微波酸處理對骨膠原蛋白酶解效果的影響研究

王潔昀,李亞欣,樂國偉,2,林云鑒,施用暉,2,＊

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

微波酸處理對骨膠原蛋白酶解效果的影響研究

王潔昀1,李亞欣1,樂國偉1,2,林云鑒1,施用暉1,2,＊

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

以骨膠原蛋白為原料,采用微波酸處理輔助酶解制備膠原蛋白肽,以水解度及抗氧化能力為指標(biāo)確定最佳水解條件。通過比較實(shí)驗(yàn)確定最佳微波酸處理?xiàng)l件為：微波功率 510W作用 270s;通過對酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶水解結(jié)果比較,確定中性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度及ABTS、DPPH自由基清除率最高;通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化中性酶最佳酶解條件為：酶與底物比10%,底物濃度4%,反應(yīng)溫度55℃,pH 7.0。結(jié)果表明,與單獨(dú)酶解相比,微波酸處理能夠使骨膠原蛋白酶解時(shí)間縮短 1/2,水解度上升 3.2%,產(chǎn)物的ABTS、DPPH自由基清除率分別提高8.7%和3.1%。

骨膠原蛋白,微波酸水解,酶解,水解度,抗氧化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬骨膠原蛋白 實(shí)驗(yàn)室提供;DPPH、ABTS、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶 均購于 Sigma公司;木瓜蛋白酶 龐博生物工程公司;中性蛋白酶 夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

微波爐 松下 NN-S563JF;UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯 (上海)儀器有限公司; Waters 600高效液相色譜儀 Waters公司;Delta320 pH Meter 梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司; 85-2型恒溫磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市通濟(jì)儀器廠;DL-5型低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 微波酸處理方法

準(zhǔn)確稱取適量骨膠原蛋白,加入一定濃度磷酸溶液,半干狀態(tài)浸潤過夜,放入微波爐中,在設(shè)定微波功率及時(shí)間條件下水解處理。

1.3 膠原蛋白的水解實(shí)驗(yàn)流程

微波酸處理→冷卻后調(diào)解 pH、濃度至酶解條件→加入蛋白酶→控制水解條件進(jìn)行酶解 →100℃滅酶 10min→5000r/min離心 15min去沉淀→上清液定容→測定水解度、抗氧化活性

1.4 酶解實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 蛋白酶的選擇 選用四種酶在推薦最適條件下水解,實(shí)驗(yàn)條件如表 1所示。

表1 各酶水解膠原蛋白的實(shí)驗(yàn)條件

1.4.2 最佳酶解條件的確定 對選定的最佳蛋白酶水解底物濃度、酶與底物比、水解溫度、pH等因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)水平,通過正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)水平組合。對正交結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),并與常規(guī)酶解結(jié)果對比,確定最佳水解條件。

1.5 測定方法

水解度 (DH)的測定：采用茚三酮比色法[10]; ABTS+·清除率的測定：采用分光光度比色法,由Roberta Re的方法[11]改進(jìn);DPPH·清除率的測定：采用分光光度比色法[12];相對分子質(zhì)量分布測定：采用HPLC(高效液相色譜)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波酸處理?xiàng)l件對酶解效果影響

微波酸處理過程中不同微波功率和微波作用時(shí)間對最終酶解產(chǎn)物水解度的影響見表 2。

表 2 微波功率及作用時(shí)間與產(chǎn)物水解度的關(guān)系

微波酸處理實(shí)際是一種微波預(yù)水解的過程,如表 2,最終酶解產(chǎn)物的水解度大小總體上與預(yù)處理時(shí)的作用時(shí)間和微波輻射強(qiáng)度成正比,而在作用時(shí)間過長(如 300s)以及功率過大 (如 700W)時(shí)有水解度下降甚至蛋白焦糊的情況。這是由于隨著微波輻射強(qiáng)度的提高,體系內(nèi)分子碰撞加劇、熱量迅速上升,加快了蛋白水解速率;而當(dāng)微波輻射強(qiáng)度超出一定范圍,體系熱量上升過快,導(dǎo)致膠原蛋白結(jié)構(gòu)受損甚至焦糊。因此,確定微波功率 510W、作用 270s為微波酸處理?xiàng)l件。

2.2 蛋白酶的選擇

在相同底物濃度、酶底比、水解時(shí)間下反應(yīng),以水解度、ABTS+·和 DPPH·清除率為判斷指標(biāo),如圖 1所示,在四種蛋白酶中水解效果最好的是中性酶,因而將中性蛋白酶定為最佳用酶。

圖 1 各酶解產(chǎn)物水解度及自由基清除率比較

2.3 酶解最佳工藝條件的確定

2.3.1 酶與底物比([E]/[S])對酶解效果的影響控制酶解條件為：底物濃度 5%,反應(yīng)溫度 55℃, pH7.0,時(shí)間 3h。圖 2表明,隨著酶濃度的增加,水解度在酶與底物比 2%～6%范圍內(nèi)上升明顯,6%后由于酶的數(shù)量達(dá)到飽和,此時(shí)酶的增加對水解速度影響不大,因而水解度變化趨于緩慢?？紤]到酶的利用率與生產(chǎn)成本問題,將酶與底物比的最適范圍定為6%～10%。

圖 2 酶與底物比對酶解效果的影響

2.3.2 底物濃度 ([S])對酶解效果的影響 控制酶解條件為：酶與底物比 5%,反應(yīng)溫度 55℃,pH7.0,時(shí)間 3h。圖 3表明,底物濃度為 4%時(shí)水解度達(dá)到最高,高于或低于此值均下降。底物濃度過高,體系有效水濃度低,溶液流動(dòng)性下降,酶與底物發(fā)生有效碰撞的幾率降低,同時(shí)過量的底物遮蔽了酶的作用位點(diǎn);底物濃度過低,酶濃度隨之下降。因此,確定 3%～5%為反應(yīng)的最適底物濃度。

2.3.3 溫度對酶解效果的影響 控制酶解條件為：酶與底物比 5%,底物濃度 5%,pH7.0,時(shí)間 3h。圖 4表明,酶解過程中水解度隨溫度變化明顯。當(dāng)反應(yīng)溫度從 40℃升高到 55℃,水解度逐漸升高,55℃時(shí)達(dá)到最高,60℃時(shí)有明顯下降。這說明在適宜的溫度范圍內(nèi),酶的活性隨著溫度上升而逐漸升高,而當(dāng)溫度過高,酶的活性受到抑制,甚至失活。因此,酶解溫度取值范圍為 45～55℃。

圖3 底物濃度對酶解效果的影響

圖4 溫度對酶解效果的影響

2.3.4 pH對酶解效果的影響 控制酶解條件為：酶與底物比 5%,底物濃度 5%,反應(yīng)溫度 55℃,時(shí)間3h。圖 5表明,當(dāng)反應(yīng)體系 pH控制在 7.0時(shí)的水解度最高,pH6.0～7.0范圍內(nèi)水解度迅速上升,大于 7.0后逐漸下降。酶活性部位的可解離基團(tuán)需要在特定的 pH范圍內(nèi)才能充分解離,此時(shí)酶的構(gòu)象處于活性狀態(tài)。底物蛋白的構(gòu)象在不同的 pH下也有不同,當(dāng)pH同時(shí)滿足酶和底物的需要,才能使酶的活性中心與底物蛋白最大程度地結(jié)合。因此,確定反應(yīng) pH范圍為 6.5～7.5。

圖5 pH對酶解效果的影響

2.3.5 酶解最佳工藝條件的確定 由表3結(jié)果可知,影響因素的主次順序?yàn)?pH＞溫度 ＞底物濃度 ＞酶與底物比。中性蛋白酶的最佳酶解條件為：酶與底物比 10%,底物濃度 4%,反應(yīng)溫度 55℃,水解液pH7.0。

表 3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 最佳水解條件結(jié)果驗(yàn)證

骨膠原蛋白分別通過中性酶最優(yōu)條件微波酸處理酶解 (微波功率 510W作用 270s,酶與底物比10%,底物濃度 4%,反應(yīng)溫度 55℃,pH 7.0)以及相同酶解條件下單獨(dú)酶解,兩種水解方法下的水解度曲線對比如圖 6所示,3h水解產(chǎn)物水解度、自由基清除率如圖 7所示,相對分子量分布如圖 8所示。

圖 6 中性酶最優(yōu)水解條件下水解度曲線對比

圖7 水解度及抗氧化活性對比

由圖 6可知,經(jīng)微波酸處理后骨膠原蛋白已得到一定程度的水解,酶解過程中快速接近最高水解度,在水解 1.5h時(shí)已達(dá)到單獨(dú)酶解 3h的水平,反應(yīng)時(shí)間縮短一半,最終水解度高于后者,3h后基本平緩,驗(yàn)證最佳酶解時(shí)間為 3h。圖 7結(jié)果表明,將膠原蛋白經(jīng)微波酸處理提高了酶解產(chǎn)物的水解度及自由基清除率,水解度上升 3.2%,ABTS+·、DPPH·清除率分別提高 8.7%和3.1%。圖 8表明,兩者的分子量分布趨勢相似,8a圖的分布范圍較寬,分子量在500～1000的肽約占17%,500以下占65%以上;8b圖中分子量在 500～1000的肽約占 22%,500以下約占58%,這與水解度差異相對應(yīng)。由此說明,微波酸處理對提高骨膠原蛋白的酶解效率及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性效果明顯。

圖8 分子量分布對比

膠原蛋白的水解是分子中肽鍵受到破壞而斷裂,生成中間產(chǎn)物最終形成肽的過程。微波酸處理是一種預(yù)水解過程,酸可攻擊肽鍵使其斷裂,蛋白質(zhì)固有頻率 (5×1010Hz)恰好處于微波頻率 (3×108～3×1011Hz)范圍,蛋白質(zhì)分子交變在電磁場中振動(dòng),每個(gè)分子的正負(fù)電荷都受到交變電場力的作用,造成蛋白質(zhì)部分降解或空間結(jié)構(gòu)改變,并提高了酸作用的效率并增加了之后加入的酶的作用靶部位,大大縮短水解時(shí)間。中性蛋白酶屬于外切蛋白酶,它的水解部位是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等疏水大分子氨基酸的氨基。多種作用方式結(jié)合提高了肽鍵斷裂的效率。而肽鏈片段的氨基酸組成、數(shù)量、序列直接影響產(chǎn)物的抗氧化活性,不同水解方式得到產(chǎn)物的抗氧化活性不同,微波酸處理輔助酶解的作用方式提高了具有抗氧化活性多肽的產(chǎn)率。

3 結(jié)論

3.1 微波酸處理對膠原蛋白酶解效率的提高具有十分顯著的作用,與常規(guī)單獨(dú)酶解方法相比,反應(yīng)時(shí)間縮短一半;相同酶解時(shí)間下,水解度及 ABTS+·、DPPH·清除率均高于單獨(dú)酶解。

3.2 微波酸處理?xiàng)l件對酶解結(jié)果有明顯影響,通過比較實(shí)驗(yàn)確定最佳微波酸處理?xiàng)l件為：微波功率510W,處理時(shí)間 270s。

3.3 中性蛋白酶的酶解效果優(yōu)于酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶,其最佳水解條件為：酶與底物比 10%,底物濃度 4%,控制反應(yīng)溫度 55℃,pH 7.0。產(chǎn)物水解度為20.5%。各因素影響順序?yàn)閜H＞溫度＞底物濃度 ＞酶與底物比。

3.4 膠原蛋白經(jīng)微波酸處理輔助酶解所得水解產(chǎn)物中分子量在 500～1000的肽約占 17%,500以下占65%以上,具體組成還有待進(jìn)一步研究。

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Study on effect of microwave-acid treatment on enzymolysis of collagen

WANG Jie-yun1,L IYa-xin1,LE Guo-wei1,2,L IN Yun-jian1,SHIYong-hui1,2,＊
(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.The State KeyLaboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Collagen hyd rolysa te p roduced w ith m ic rowave-ac id trea tm ent p re trea tm ent com b ined w ith hyd rolys is by enzym e.The op t im um technology cond itions we re s tud ied w ith the deg ree of hyd rolys is and antioxidant ac tivity as index.Through the comp a rison tes t,the op t im um cond itions for m ic rowave trea tm ent we re de te rm ined as follows：m ic rowave outp ut p owe r510W,m ic rowave rad ia tion t im e270s.Neutra lp rotease was chosen as the bes t enzym e by the comp a rison of ac id p rotease,p ap a in,neutra l p rotease and a lka line p rotease.The op t im um hyd rolys is technology for enzym olys is w ith neutra l p rotease was confirm ed through the orthogona l tes t：[E]/[S]=10%, [S]=4%,temp re ture55℃,pH7.0.Comp a red w ith conventiona l enzym olys is,the reac ting t im e was shortened by 1/2,deg ree of hyd rolys is inc reased by3.2%,ABTS and DPPH rad ica l scaveng ing ac tivity of hyd rolysa te we re inc reased by8.7%and3.1%resp ec tive ly.

collagen;m ic rowave-ac id hyd rolys is;enzym olys is;deg ree of hyd rolys is;antioxidant ac tivity

TS201.1

A

1002-0306(2010)02-0097-04

膠原蛋白 (collagen)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)[1],其類型多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,目前已發(fā)現(xiàn) 7個(gè)亞類、二十余種不同類型的膠原[2]。膠原蛋白具有共同的特征：由重復(fù)出現(xiàn)的 Gly-X-Y肽段以左手螺旋方式形成α肽鏈,每 3條α肽鏈以右手螺旋方式形成穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu),即膠原區(qū)域[3]。這些結(jié)構(gòu)特征決定了膠原蛋白具有穩(wěn)定的性質(zhì),不易被人體充分消化吸收。將膠原蛋白水解成為膠原多肽,可大大提高其營養(yǎng)價(jià)值和吸收利用率,具有保護(hù)消化道粘膜、促進(jìn)骨形成、促進(jìn)皮膚膠原代謝等生理功能。目前,國內(nèi)外多采用酶法對膠原蛋白進(jìn)行水解,由于膠原蛋白本身性質(zhì)限制,水解時(shí)間長,能耗大,產(chǎn)率較低[4-5]。近年來微波輔助反應(yīng)方法以其快速和節(jié)能的特點(diǎn)已經(jīng)在食品及化學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用,國內(nèi)外研究表明,使用微波輔助蛋白質(zhì)水解可有效提高水解效率及產(chǎn)率,與傳統(tǒng)化學(xué)水解及酶解方法相比具有快速、簡便、高效的特點(diǎn)[6-9],而微波酸處理輔助酶解膠原蛋白鮮有報(bào)道。本研究將微波輔助酸水解與傳統(tǒng)酶解方法相結(jié)合,為膠原蛋白水解效率的提高提供新的途徑。

2009-04-17 ＊通訊聯(lián)系人

王潔昀(1984-),女,碩士研究生,研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

863計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z325);科技部十一五支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD27)。