光度法測(cè)定肉制品中蛋白質(zhì)含量的方法研究

尉立剛,張生萬(wàn)＊,齊尚忠,吳菊花,張嬋娟

光度法測(cè)定肉制品中蛋白質(zhì)含量的方法研究

尉立剛1,張生萬(wàn)1＊,齊尚忠3,吳菊花2,張嬋娟2

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原030006;2.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山西太原030006; 3.山西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,山西太原030012)

對(duì)含有蕎麥的新型保健肉制品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,建立了一種測(cè)定肉制品中蛋白質(zhì)含量的紫外分光光度法.結(jié)果表明:在選定的測(cè)定波長(zhǎng)250 nm下,蛋白質(zhì)含量在0～170μg/mL范圍內(nèi)其濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系,其R=0.999 5、RSD=1.89%(n=7),回收率為97.24%～99.82%,該法用于實(shí)際樣品測(cè)定取得了令人滿意的結(jié)果.

肉制品;蛋白質(zhì);紫外分光光度法;凱氏定氮法

目前,蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法主要有:凱氏定氮法[1-3]、電泳法[4-6]、質(zhì)譜法[7]、滴定法[8]等,另外,分光光度法通常也以280 nm為測(cè)定波長(zhǎng)[9]對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定,這主要是利用了蛋白質(zhì)分子中羰基的n-л躍遷引起的吸收,由于n-л躍遷屬禁阻躍遷,故靈敏度差.目前,加有蕎麥的肉制品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法尚少見報(bào)道,本工作主要對(duì)含有蕎麥的新型保健肉制品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,建立了一種以凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),選擇蛋白中不飽和氨基酸的л-л躍遷引起的吸收(250 nm)為測(cè)定波長(zhǎng),建立了光度法測(cè)定肉制品中蛋白質(zhì)含量的方法.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

含有蕎麥的肉制品,由本實(shí)驗(yàn)室自制,檸檬酸(分析純,天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠),UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司生產(chǎn)),離心機(jī)、凱氏定氮儀、滴定管.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凱氏定氮法

準(zhǔn)確稱取肉制品約2.000 g,移入500 mL凱氏燒瓶中,加入硫酸銅0.2 g、硫酸鉀6.0 g和濃硫酸20 mL,輕輕搖勻后進(jìn)行消化反應(yīng),最后用0.100 0 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量.

1.2.2 紫外分光光度法

準(zhǔn)確稱取肉制品1.000 g,用15 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液溶解,充分?jǐn)嚢?然后用四層紗布過(guò)濾,在轉(zhuǎn)速為3 000 r/min的離心機(jī)中離心,吸取3 mL上清液移于25 mL比色管中用蒸餾水稀釋至刻度,然后用與樣品溶液濃度相同的檸檬酸水溶液作空白,在250 nm處測(cè)定其吸光度,代入以凱氏定氮法為基礎(chǔ)建立的回歸方程y=0.938x+0.011,計(jì)算肉制品中蛋白質(zhì)的含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

準(zhǔn)確稱取肉制品0.800 g,1.300 g,2.000 g于三個(gè)燒杯中(編號(hào)1、2、3),分別用30 mL 0.1 mol/L的檸檬酸溶解,過(guò)濾離心,得其上清液為供試液;以0.1 mol/L檸檬酸水溶液為空白,在230～500 nm范圍內(nèi)掃描(圖1),從圖1可知,樣品在250 nm和369 nm處有兩個(gè)最大吸收峰.其中,250 nm的吸收強(qiáng)度較大,且與蛋白濃度成正比,該峰主要是此類蛋白中不飽和氨基酸的л-л躍遷所致.所以本實(shí)驗(yàn)選用250 nm作為蛋白溶液的測(cè)定波長(zhǎng).

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取一定量的含蕎麥肉制品樣品,按1.2.1節(jié)凱氏定氮法平行測(cè)定三次取平均值,然后按1.2.2紫外分光光度法準(zhǔn)確稱取一定量的該樣品、溶解、過(guò)濾、離心,以此上清液作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別吸取0.3, 1.0,2.0,3.0,4.0,6.0 mL上述蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL比色管中,用蒸餾水定容至刻度.再分別吸取0.3, 1.0,2.0,3.0,4.0,6.0 mL 0.1 mol/L的檸檬酸溶液于6個(gè)25 mL比色管中,用蒸餾水定容至刻度,在250 nm處測(cè)定各溶液的吸光度A.以上述凱氏定氮法為基礎(chǔ),計(jì)算出蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液中的蛋白質(zhì)濃度,并將其作為橫坐標(biāo),吸光度A作縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.結(jié)果表明,蛋白溶液在0～170μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好,符合朗伯比耳定律,其線性回歸方程為y=0.938x+0.011,R=0.999 5.

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1.000 g肉制品,加入30 mL 0.1 mol/L的檸檬酸,然后按1.2.2實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理,得樣品蛋白溶液.取樣品蛋白溶液3 mL置于25 mL比色管中,用蒸餾水稀釋至刻度;量取3 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液置于25 mL比色管中,用蒸餾水稀釋至刻度作空白,每隔10 min測(cè)定樣品蛋白溶液的吸光度值A(chǔ),連續(xù)測(cè)定2 h.實(shí)驗(yàn)表明,此期間吸光度值基本無(wú)變化,穩(wěn)定性良好(見圖2).

圖1 紫外吸收光譜圖Fig.1 Graph of ultraviolet spectrum

圖2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig.2 Result of stability test

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取肉制品1.000 g,加入30 mL 0.1 mol/L的檸檬酸,按1.2.2實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理得樣品蛋白溶液.取該溶液1、2、3 mL分別置于3個(gè)25 mL比色管中,然后分別加入4 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液于上述比色管,用蒸餾水稀釋至刻度,以對(duì)應(yīng)濃度的檸檬酸作空白,測(cè)定其吸光度值A(chǔ),計(jì)算回收率(見表1).

表1 回收率實(shí)驗(yàn)Table 1 Experiment of recovery

由表1可知,本方法回收率較好,可用于蕎麥火腿腸中蛋白質(zhì)含量的定量測(cè)定.

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取肉制品2.000 g,加入60 mL 0.1 mol/L的檸檬酸,按1.2.2實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理,得樣品蛋白溶液.分別準(zhǔn)確量取10份樣品蛋白溶液3 mL于25 mL比色管中用蒸餾水稀釋至刻度,以對(duì)應(yīng)濃度的檸檬酸作空白,按照1.2.2中的測(cè)定方法測(cè)定它們的吸光度值A(chǔ).結(jié)果為0.828,0.827,0.827,0.828, 0.829,0.828,0.828,0.828,0.828,0.828.相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00 036.

2.6 樣品測(cè)定

對(duì)生產(chǎn)日期不同的三批蕎麥火腿腸樣品,分別稱取1.065 2 g、1.112 9 g、1.096 3 g,按照1.2.2中樣品測(cè)定方法分別對(duì)其進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表2.

表2 樣品測(cè)定Table 2 Determination of sample

由表2可知該方法的測(cè)定結(jié)果與凱式定氮法的測(cè)定結(jié)果基本符合.

3 結(jié)論

蕎麥?zhǔn)俏覈?guó)北方特有的一種農(nóng)作物,含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分.含蕎麥的肉制品中蛋白質(zhì)含量準(zhǔn)確測(cè)定方法的建立,對(duì)蕎麥肉制品生產(chǎn)工藝的控制和產(chǎn)品質(zhì)量保證具有極為重要的意義.由于蛋白質(zhì)含有肽鍵和其降解產(chǎn)物芳香環(huán)殘基(如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等)中含有的共軛雙鍵在紫外區(qū)對(duì)一定波長(zhǎng)的光有選擇吸收,并且其吸光度在一定范圍與蛋白質(zhì)濃度成正比,因此該實(shí)驗(yàn)選擇紫外光度法,250 nm為測(cè)定波長(zhǎng),結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、靈敏度高、精密度好、操作簡(jiǎn)便.

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Assaying Protein in Meat Product by a Spectrophotometry

WEI Li-gang1,ZHANG Sheng-wan1,QI Shang-zhong3,WU Ju-hua2,ZHANG Chan-juan2
(1.School of Lif e Science,Shanxi University,Taiyuan030006,China; 2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi University,Taiyuan030006,China; 3.S hanxi Product Quality Supervision and Inspection Institute,Taiyuan030012,China)

A determination method to the protein in the buckwheat meat product was introduced.UV spectrophotometry was applied to assay the protein in the buckwheat meat product.The results indicated:in the designation determination wavelength 250 nm,the protein was 0～170μg/mL,the consistency and the difference of absorbency were linear.The correlation coefficientR=0.999 5,theRSDwas 1.89%,the recovery rate was 97.24%～99.82%,the method was reliable in the determination of sample.

meat products;protein;UV Spectrophotometry;kjeldahl nitrogen determination method

O657.32;TS207

A

0253-2395(2010)02-0267-03

2009-09-16;

2009-12-03

山西省攻關(guān)項(xiàng)目(20080311082)

尉立剛(1983-),男,山西襄汾人,碩士研究生,主要從事食品化學(xué)研究.＊通訊聯(lián)系人:E-mail:zswan@sxu. edu.cn