CRH在正常與抑郁癥大鼠皮質(zhì)分布的研究

唐曉偉，陳曉杰，胡鐵中，劉曉慶，劉 文

（安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校 基礎教學部，安徽 蕪湖241000）

CRH在正常與抑郁癥大鼠皮質(zhì)分布的研究

唐曉偉，陳曉杰，胡鐵中，劉曉慶，劉 文

（安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校 基礎教學部，安徽 蕪湖241000）

以SD雄性大鼠為材料，采用慢性輕度不可預見性應激＋孤養(yǎng)方法復制大鼠抑郁模型，比較促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）免疫陽性神經(jīng)元在大鼠大腦皮質(zhì)的區(qū)域分布特征。結(jié)果顯示：CRH免疫陽性神經(jīng)元在皮層的各層均有分布；與對照組（NC組）相比，模型組（MC組）大鼠CRH免疫陽性細胞在大腦皮質(zhì)的運動皮質(zhì)（M）、感覺皮質(zhì)（S）、聽皮質(zhì)（Au）、梨形皮質(zhì)（Pir）顯著增加，嗅皮質(zhì)（Ol）也有增加但不明顯。結(jié)論：CRH免疫反應陽性細胞在大腦皮層內(nèi)廣泛分布，抑郁大鼠CRH在皮質(zhì)的表達增加，提示其可能參與應激反應。

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素；慢性輕度不可預見性應激；孤養(yǎng)模型；免疫組織化學；大腦皮質(zhì)；大鼠

下丘腦分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），因其可能通過調(diào)節(jié)下丘腦－垂體－腎上腺軸（HPA）參與應激反應而受到人們的關(guān)注。但CRH在皮層內(nèi)的區(qū)域分布及其在應激反應中的變化未見報道。本研究采用免疫組織化學方法，研究CRH免疫陽性神經(jīng)元在大腦皮層的區(qū)域分布特征，對其在正常大鼠與抑郁模型大鼠運動皮質(zhì)（M）、感覺皮質(zhì)（S）、聽皮質(zhì)（Au）、嗅皮質(zhì)（Ol）和梨形皮質(zhì)（Pir）的分布進行比較，以希為進一步研究CRH與應激反應的相關(guān)性提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體重250－300g，由安徽省動物中心提供。

1.2 抑郁模型的建立及評價

1.2.1 動物分組

動物購回后在安靜、室溫20－22℃、自然光照、自由進食進水的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周。通過敞箱試驗將穿越格數(shù)加后肢直立次數(shù)不足30次或超過120次的大鼠剔除，隨機分為NC和MC組，每組10只。

1.2.2 模型的建立

適應性喂養(yǎng)結(jié)束后，結(jié)合 Willner等［1］以及Forbe等［2］的方法，用慢性應激結(jié)合孤養(yǎng)的方式造模。MC組單籠飼養(yǎng)，給予7種不同的刺激，即：冰水游泳（4℃，5min）、夾尾（3min）、禁水（24h）、禁食（24h）、鼠籠傾斜45°（24h）、溫箱（45℃，5min）、搖晃（3Hz／s，5min），每天隨機安排 1種，每種刺激在實驗全程中使用3次，共21d。NC組每籠5只喂養(yǎng)，不予任何刺激。

1.2.3 模型的評價

采用Open－field測試和液體消耗試驗對抑郁模型進行評價。Open－field測試方法為：造模前1d及造模結(jié)束后，早8：30～12：00之間在安靜的房間內(nèi)，按Kennett等的方法［3］，觀察大鼠在5分鐘內(nèi)中央格停留時間、穿越格數(shù)、后肢直立次數(shù)和清潔運動次數(shù)，敞箱裝置采用不透明黑色材料，底面為90cm×90cm的正方形，用白線劃分為面積相等的16塊，周圍有高40厘米的墻壁。液體消耗試驗測試方法為：造模前2d及造模結(jié)束后，按照Benelli等的方法［4］，在24小時禁食禁水后，同時給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶純水，120分鐘后取走兩瓶并稱重，計算糖水偏愛（糖水偏愛＝ 糖水消耗／總液體消耗×100%）。

1.3 組織標本的制備

兩組大鼠在規(guī)定時間點用7%水合氯醛（5ml／Kg）腹腔注射麻醉后開胸，升主動脈插管，快速灌注生理鹽水沖洗后再灌注4%多聚甲醛（PFA）（4℃，PH7.4），取腦，4%PFA后固定，蔗糖水梯度脫水，恒冷冰凍切片機（Leica CM1900）連續(xù)冠狀切片，片厚30μm，取 M區(qū)、S區(qū)、Au區(qū)、Ol區(qū)和Pir區(qū)互包平面，直接貼在處理過的玻片上。

1.4 CRH陽性細胞檢測

采用ABC法標記CRH陽性細胞，具體步驟如下：4%PFA補固定10min；0.3%H2O2和1%Trion X100混合液孵育切片30min（避光）；5%羊血清封閉30min（37℃）；兔抗的CRH 血清（1：2000，Bachem 公司 T－4037）孵育60min（37℃）后4℃孵育12h；生物素化山羊抗兔的IgG（1：200，Vector公司 BA－1000）孵育60min（37℃）；ABC液（1：200，Vector公司 CA94010）孵育60min（37℃）；上述各步驟間均用PBS洗3次，每次5min。DAB硫酸鎳銨加強呈色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察并拍照。陰性對照組用PBS代替一抗。

1.5 CRH免疫陽性細胞在大腦皮質(zhì)分布層次及區(qū)域的測定

選取正常對照組和模型組各10只大鼠相同皮質(zhì)部位的3張30μm切片，在顯微鏡（10×20）下通過Camera lucida將CRH神經(jīng)元描繪于白紙上。從皮層表面至白質(zhì)在紙上標出寬為1mm的柱狀范圍，層次的邊界通過鄰近的H－E染色切片確定；計數(shù)每個層次的陽性細胞數(shù)，壓在右、上線的細胞計數(shù)，而左、下線的細胞則不計。根據(jù)George Paxinos等的大鼠腦定位圖譜，劃分出M區(qū)，S區(qū)，Au區(qū)，Ol區(qū)及Pir區(qū)，計數(shù)每個區(qū)域的陽性細胞數(shù)，壓在右、上線的細胞計數(shù)，而左、下線的細胞則不計。

1.6 統(tǒng)計方法

用SPSS11.0進行數(shù)據(jù)t檢驗處理。描述性統(tǒng)計值用平均值±標準差表示，顯著性水平設置為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 open－field測試結(jié)果

與NC組相比，第21dMC組穿越格數(shù)、后肢直立次數(shù)、清潔運動次數(shù)及糖水偏愛度顯著減少，中央格停留時間延長。（表1）

表1 正常組與抑郁癥大鼠敞箱實驗中運動行為及糖水偏愛度比較

2.2 細胞層次分布

CRH免疫反應性神經(jīng)元散在地分布于皮層內(nèi)Ⅰ～ Ⅵ層，其中Ⅱ、Ⅲ 層相對較多，Ⅰ 層次之，Ⅳ、Ⅴ層較少，Ⅵ層偶見分布（圖1）。NC組每1000μm寬度的皮層范圍內(nèi)的平均陽性細胞數(shù)為3.83±0.35個，MC組每1000μm寬度的皮層范圍內(nèi)的平均陽性細胞數(shù)為10.6±0.69個。

圖1 Camera lucida描繪的CRH細胞在大腦皮質(zhì)的層次分布，切片30μm厚，1000μm寬的柱形方塊內(nèi)，CRH神經(jīng)元見于Ⅰ～Ⅵ層，以Ⅰ～Ⅲ層較多。標尺示400μm

2.3 細胞的區(qū)域分布

CRH免疫反應陽性神經(jīng)元在大鼠大腦皮質(zhì)的M區(qū)，S區(qū)，Au區(qū)，Ol區(qū)及Pir區(qū)都有分布（表2）。其中 MC組大鼠與NC組相比，CRH在皮質(zhì)分布的總數(shù)及在 M區(qū)，S區(qū)，Au區(qū)和Pir區(qū)均顯著增加，Ol區(qū)增加但沒有顯著差異。

表2 兩組大鼠CRH神經(jīng)元在大腦皮質(zhì)各區(qū)的表達

3 討論

目前，國際上抑郁癥病理生理研究較為理想的模型之一是CUMS模型［1］，對已建立模型的評價，則采用液體消耗實驗和Open－field測試，將液體消耗實驗中糖水偏愛度顯著降低作為測量快感缺乏的客觀指標，Open－field測試中穿越方格數(shù)目的減少用以反映動物活動度的降低，后肢直立次數(shù)減少和中央格停留時間延長用以反映動物對新鮮環(huán)境好奇程度的降低，清潔動作次數(shù)減少用以反映動物對周圍環(huán)境的要求及對自身的關(guān)注下降［4，5］。本實驗中我們采用CUMS＋孤養(yǎng)方式建立了抑郁模型，并對其進行了評價，結(jié)果顯示，與NC組相比，MC組大鼠1%糖水偏愛度顯著下降，后肢直立次數(shù)、穿越格數(shù)、清潔運動次數(shù)均顯著減少，中央格停留時間顯著增加，表明該模型反映了動物對幸福事件反應能力的下降、活動能力下降和興趣喪失，與抑郁癥臨床表現(xiàn)中的精神運動性阻抑癥狀相似，符合相關(guān)國際標準，可用于研究抑郁癥的發(fā)病機制［6］。

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）被認為是與抑郁癥發(fā)病密切相關(guān)的物質(zhì)。近年來的研究顯示，CRH不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還廣泛地存在于卵巢、睪丸、腎上腺髓質(zhì)、心、肝、小腸、大腸等消化道以及胰腺等組織內(nèi)。在受到應激刺激時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的CRH增多，其中下丘腦室旁核（PVN）分泌的CRH經(jīng)垂體門脈血流到達垂體并刺激垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），后者經(jīng)血液循環(huán)到達腎上腺，刺激腎上腺皮質(zhì)的束狀帶－網(wǎng)狀帶合成、分泌以皮質(zhì)醇為中心的糖皮質(zhì)激素（GC），促使機體各組織發(fā)生應激防御反應，CRH還可通過植物神經(jīng)系統(tǒng)協(xié)調(diào)心血管消化系統(tǒng)的運動及吸收功能，甚至可調(diào)控炎性反應和個體及行為，提示其可能具有強大的全面調(diào)控人體應激反應的功能［7，8］。

本實驗中，我們通過免疫組化方法對CRH在NC組與MC組大鼠大腦皮質(zhì) M區(qū)、S區(qū)、Au區(qū)、Ol區(qū)和Pir區(qū)的表達量進行了比較，結(jié)果顯示，CRH在MC組大鼠大腦皮質(zhì)上述區(qū)域總表達量顯著增加，其中在 M區(qū)、S區(qū)、Au區(qū)和Pir區(qū)的表達量均顯著高于NC組，而在Ol區(qū)沒有顯著差異，提示大腦皮質(zhì)CRH的表達與應激刺激有關(guān)。同時我們也注意到，大腦皮質(zhì)部位CRH細胞軸突的走向與腦膜垂直，提示大腦皮質(zhì)中的CRH即可能直接分泌到相應的部位發(fā)揮調(diào)控作用，也可能通過改變腦脊液中CRH的量而調(diào)節(jié)機體對應激的自主神經(jīng)和情緒行為反應，應激刺激時中樞神經(jīng)系統(tǒng)CRH增加的來源值的進一步關(guān)注。

［1］Willner P.Validation criteria for animal models of human mental disorders：learned helplessness as a paradigm case［J］.Prog Neuro psychopharmaca Biol Psychiatry，1986，10（6）：677－690.

［2］Forbes NF.Caroline A.Keith Matthews.et al.Chronic mild stress and sucrose consumption：validity as a mod el of depression［J］.Physiology ＆Behavior，1996.60：1481－1484.

［3］Kennett GA，Dickinson SL，Curzon G.Enhancement of some 5－HT－dependent behavioural responses following repeated immobilization in rats［J］.Brain Research，1985，330：253－263.

［4］Forbes NF，Caroline A.Keith Matthews，et al.Chronic mild stress and sucrose consumption：validity as a mod el of depression［J］.Physiology ＆Behavior，1996，60：1481－1484.

［5］Yadid G，Nakash R，DeriI，et al.Elucidation of the neurobiology of depression：insights from a novel genetic animal model［J］.Prog Neurobiol，2000，62：353－358.

［6］Marta K，Agicszaka B，Vladimir H，et al.Effect of mild chronic stress，as a model of depression，on the immunoreactivity of C57BL／6mice［J］.International Journal of Immunopharmacology，1998，20：781－789.

［7］Drew E.Carlson，William C.Chiu Suzelle M.Fiedler et al.Central neural distribution of immunoreactive Fos and CRH in relation to plasma ACTH and corticosterone during sepsis in the rat［J］.Experimental Neurology，2007，6：485－500.

［8］Culman J，Das G，Ohlendorf C，et al.Blockade of tachykinin NK1／NK2receptors in the brain attenuates the activation of corticotrophin－releasing hormone neurones in the hypothalamic paraventricular nucleus and the sympathoadrenal and pituitary－adrenal responses to formalin－induced pain in the rat［J］.Neuroendocrinol，2010，22（5）：467－476.

On Distribution of Corticotropin Releasing Hormone in Cortex of Normal and Depressed Rats

Tang Xiaowei，Chen Xiaojie，Hu Tiezhong，Liu Xiaoqing，Liu Wen
（Department of Basic Sciences，Anhui Junior College of Traditional Chinese Medicine，Wuhu 241000，China）

To explore distribution characteristics of immunopositive neurons for the corticotrophin releasing hormone（CRH）in the cerebral cortex of rats as well as changes in depressed rats.Methods：20 SD male rats were randomized into control group（NC group），model control group（MC group），with 10rats in each group.The depression model was achieved by chronic unpredictable mild stress plus solitary breeding.The immunohistochemistry method was used to observe immunopositive neurons for CRH in different regions of the cerebral cortex of the rats，comparing distribution differences of the neurons in cortex regions of rats in both groups.Results：Immunopositive neurons for CRH were distributed in all layers of the cortex.Compared to rats in the NC group，rats in the MC group significantly increased their expression of CRH in the cortex，particularly in the motor cortex（M），sensory cortex（S），auditory cortex（Au），and pyriform cortex（Pir）.The CRH expression in the olfactory cortex（Ol）was also intensified but not significant.Conclusions：Immunopositive neurons for CRH were extensively distributed in the cerebral cortex of the rats and the depressed rats increased the expression of CRH in the cortex，suggesting their involvement with stress response.

corticotrophin releasing hormone；chronic unpredictable mild stress ＋ solitary breeding model；immunohistochemistry；cerebral cortex；rat

R749.4

：A

：1673－1794（2010）05－0032－03

唐曉偉（1968－），女，副教授，主要從事抑郁癥發(fā)病機制的基礎研究。

安徽省教育廳自然科學基金（KJ2008B224）

2010－05－14