酰化對(duì)大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)影響的研究

姚玉靜,楊曉泉,蘇新國(guó),許彩虹

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣東廣州 510520; 2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

酰化對(duì)大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)影響的研究

姚玉靜1,2,楊曉泉2,＊,蘇新國(guó)1,許彩虹2

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣東廣州 510520; 2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

目的：研究化學(xué)改性對(duì)大豆分離蛋白(SPI)分子結(jié)構(gòu)的影響;方法：采用 SDS-PAGE電泳、DSC熱分析手段探討?；瘜?duì)蛋白分子結(jié)構(gòu)特征的影響;結(jié)果：DSC圖譜顯示,SPI經(jīng)過(guò)琥珀酰化處理后熱穩(wěn)定性得到顯著改善,乙?；幚韺?duì)大豆蛋白的熱穩(wěn)定性影響不大。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,改性后蛋白的 11S酸性亞基和 7S含量大大減少,說(shuō)明 SPI經(jīng)酰化處理后亞基發(fā)生了降解。隨著酸酐添加量的增大,11S球蛋白分子逐步分解為亞基。琥珀酰化的電泳圖譜預(yù)示著可能存在一個(gè)琥珀?；呐R界點(diǎn),在這一點(diǎn)上,解離的蛋白亞基突然展開(kāi)。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于闡明 SPI?；蠊δ苄再|(zhì)發(fā)生變化的內(nèi)在結(jié)構(gòu)因素。

乙酸酐,琥珀酸酐,大豆分離蛋白,電泳,差示掃描量熱法

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆分離蛋白(SPI) 哈爾濱黎明A,其組成成分為水分 5.97%,灰分 2.83%,脂肪 0.90%,蛋白質(zhì)含量90.8%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙酰化或琥珀?；痆4]6%(w/v)大豆分離蛋白溶液在攪拌條件下分多次加入 0.1、0.3、0.6、0.9g/g蛋白的乙酸酐或琥珀酸酐。反應(yīng)過(guò)程中以 1mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液 pH在 7.5～8.5范圍。反應(yīng)結(jié)束后用去離子水透析(4℃,24h),然后冷凍干燥備用。

1.2.2 ?；潭鹊臏y(cè)定[5]采用 Paik等的茚三酮比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的?；潭?吸取濃度為 1% (w/v)的蛋白液 1mL,加入 2%(w/v)茚三酮溶液1mL,混合液于 100℃水浴上加熱 5min,迅速冷至25℃,加入 5mL蒸餾水,在 580nm波長(zhǎng)下,測(cè)定溶液的吸光度,以 2%(w/v)茚三酮溶液為參比液。

2%(w/v)茚三酮溶液的配制[5]：30mL檸檬酸緩沖液 (0.2mol/L,pH5)與 30mL的茚三酮溶液 (濃度為 4%,溶劑為 2-乙氧基乙醇)混合,加入 50mg氯化亞錫(SnCl2·H2O),攪拌過(guò)濾備用。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 凱氏定氮法 (GB/T 5009.5 -2003)。

1.2.4 熱變性溫度的測(cè)定 采用差示掃描量熱儀(DSC)對(duì)固體粉末狀樣品進(jìn)行熱分析。DSC為杜邦公司的 1090B-910DSC。氮?dú)獾乃俾蕿?40mL/min,使用銦 (Tf=156.4℃)作為溫度校正標(biāo)準(zhǔn)。樣品重量約為 8mg。參照池為空鋁盒,掃描速率為 5℃/min,掃描溫度范圍為 25～160℃。

1.2.5 SDS-PAGE(測(cè)定亞基降解程度) 采用LaemmLi[6]的方法,分離膠濃度 12%,濃縮膠濃度3%。樣品溶液與樣品緩沖液 1∶1(v/v)混合,電泳前沸水沸騰 5min。上樣量為 15μL,濃縮膠中為 15mA,進(jìn)入分離膠后增至 25mA。電泳完畢后以考馬斯亮藍(lán) R-250染色。

說(shuō)明：各測(cè)定過(guò)程除特別說(shuō)明外,均在室溫下進(jìn)行,重復(fù)三次,以平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 DSC熱分析

本實(shí)驗(yàn)采用差示掃描量熱儀 (DSC)對(duì)市售 SPI及其?；鞍椎臒嵝再|(zhì)進(jìn)行了分析研究。圖 1～圖 4即為市售 SPI及其琥珀?；鞍椎?DSC曲線 (第一次掃描)。

圖1 未改性大豆分離蛋白的DSC圖譜

圖 2 琥珀酰化程度為 0.1g/g蛋白的 SPI的DSC圖譜

圖 3 琥珀?；潭葹?0.3g/g蛋白的 SPI的DSC圖譜

圖 4 琥珀?；潭葹?0.6g/g蛋白的 SPI的DSC圖譜

市售大豆蛋白的峰溫為 65.8℃(見(jiàn)表 1),說(shuō)明原大豆蛋白經(jīng)過(guò)一系列加工處理,已經(jīng)發(fā)生了很大的變性,可以推測(cè)蛋白質(zhì)變性對(duì)吸熱峰的貢獻(xiàn)不大,水峰的貢獻(xiàn)占主導(dǎo)。從表 1可見(jiàn),琥珀?；鞍椎奈鼰岱鍦囟确秶几哂谖锤男源蠖沟鞍椎?琥珀酰化三個(gè)改性程度的吸熱峰都大于 100℃,主要是蛋白質(zhì)峰的貢獻(xiàn);而乙?；鞍纂S著酸酐添加量的增大,吸熱峰溫度與未改性 SPI差別不明顯,乙酰化三個(gè)改性程度的吸熱峰主要是水峰 (50～70℃)的貢獻(xiàn)。說(shuō)明大豆蛋白經(jīng)過(guò)琥珀酰化處理后熱穩(wěn)定性得到明顯改善,乙?；幚韺?duì)大豆蛋白的熱穩(wěn)定性影響不大。

表 1 ?；男詫?duì)大豆分離蛋白DSC峰溫(Td)的影響

2.2 SDS-PAGE電泳分析

圖 5為酰化 SPI的聚丙烯酰胺電泳圖譜。從圖中可見(jiàn),改性后蛋白的 11S酸性亞基和 7S含量大大減少,說(shuō)明 SPI經(jīng)酰化處理后亞基發(fā)生了降解,隨著?；潭鹊脑龃?11S球蛋白分子逐步分解為小分子量的亞基。乙?；?0.1g/g蛋白時(shí),亞基降解程度已經(jīng)很大,琥珀?；瘎t是從 0.3g/g蛋白增加到 0.6g/g蛋白時(shí),7S和 11S蛋白帶大量消失,這些變化反映了乙酰化對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的破壞劇烈,琥珀?；瘎t溫和許多;此外可能存在一個(gè)琥珀?；呐R界點(diǎn),在這一點(diǎn)上,解離的蛋白亞基突然展開(kāi)。這種現(xiàn)象也可見(jiàn)于花生球蛋白[7]、向日葵蛋白[8]、油菜籽蛋白[9]和豌豆球蛋白[10]的琥珀?；芯恐小Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)豌豆球蛋白輕微的琥珀?；蛔阋允沟鞍踪|(zhì)解離,豌豆球蛋白 45%的賴氨酸殘基琥珀酰化時(shí),僅有 20%的蛋白質(zhì)解離。對(duì)向日葵蛋白的琥珀酰化研究發(fā)現(xiàn), 11S和 7S蛋白隨?；潭鹊脑黾佣?取而代之的是 2.5S蛋白的增加。

圖5 ?；鞍椎腟DS-PAGE圖譜

3 結(jié)論

DSC圖譜顯示,琥珀?；齻€(gè)程度的吸熱峰都大于 100℃,說(shuō)明大豆蛋白經(jīng)琥珀?；幚砗鬅岱€(wěn)定性得到顯著改善。乙?；齻€(gè)改性程度的吸熱峰主要是水峰(50～70℃)的貢獻(xiàn),與未改性 SPI相比沒(méi)有明顯變化,說(shuō)明乙?；幚韺?duì) SPI的熱穩(wěn)定性影響不大。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,改性后蛋白的 11S酸性亞基和 7S含量大大減少,說(shuō)明 SPI經(jīng)?；幚砗髞喕l(fā)生了降解。隨著酸酐添加量的增大,11S球蛋白分子逐步分解為小分子量的亞基。其中乙?；瘜?duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的破壞劇烈,琥珀?；瘎t溫和許多。此外可能存在一個(gè)琥珀酰化的臨界點(diǎn),在這一點(diǎn)上,解離的蛋白亞基突然展開(kāi)。

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Effect of succinic anhydride and acetic anhydride on the structure of soybean protein

YAO Yu-jing1,2,YANG Xiao-quan2,＊,SU Xin-guo1,XU Ca i-hong2
(1.Food Science Depar tment,Guangdong Food and DrugVocational College,Guangzhou 510520,China; 2.College ofLight Industry&Food,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

O b jec tive：The effec t of chem ica l m od ifica tion on the s truc ture of soybean p rote in isola te(SPI)was s tud ied.M e thods：SDS-PAGE and DSC we re used to obse rve the d issoc ia tion of subunit p rote ins and the hea t s tab ility of acyla ted SPI resp ec tive ly.Results：DSC p rofile showed tha t succ inyla tion s ignificantly imp roved the hea t s tab ility of SPI,while the ace tyla tion had no s ignificant change.SDS-PAGE p rofile showed tha t7S g lobulin and m os t of the ac id subunits of11S g lobulin d isapp ea red due to acyla tion.Itwas a lso ind ica ted a coop e ra tive p rocess lead ing to a sudden unfold ing of the d issoc ia ted subunits a t a ce rta in c ritica l leve l of succ inyla tion.Conc lus ion：The exp e r im ent results show ing the changes in the s truc ture p rop e rties of acyla ted SPI could he lp to e luc ida te the changes in its func tiona lp rop e rties due to acyla tion.

ace tyla tion;succ inyla tion;soybean p rote in isola te;e lec trop hores is;d iffe rentia l scanning ca lor im e try

TS201.2+1

A

1002-0306(2010)03-0122-03

隨著自動(dòng)化生產(chǎn)和產(chǎn)品配方的日趨精確化,食品工業(yè)對(duì)食品成分和蛋白質(zhì)組分的功能規(guī)范也提出更高的要求,需要有標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)定量描述蛋白質(zhì)功能特性,闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能間的關(guān)系。所以,有必要深入了解不同條件下,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性與其功能性的關(guān)系,闡明蛋白質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)在應(yīng)用中的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系,以便在具體的應(yīng)用中,我們可以自主選擇適合的蛋白質(zhì),或是為了改善某種功能,知道應(yīng)采取怎樣的改性措施。本文作者采用酰化試劑對(duì)市售大豆分離蛋白進(jìn)行化學(xué)改性,以便改善大豆蛋白質(zhì)的功能特性,以及探索其內(nèi)在結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)對(duì)功能性質(zhì)的影響。?；磻?yīng)所造成的蛋白質(zhì)功能特性的變化都與蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)變化有關(guān),從前述的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1-3]中已經(jīng)證實(shí)了其中的一些變化,譬如?；蟮拇蠖沟鞍尊ざ仍龈咭馕吨鞍踪|(zhì)分子展開(kāi)或膨脹,分子體積增加。為了能進(jìn)一步認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)有關(guān)性能變化的機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電泳、DSC熱分析來(lái)探討酰化對(duì)蛋白分子結(jié)構(gòu)特征的影響,以期闡明SPI?；蠊δ苄再|(zhì)發(fā)生變化的內(nèi)在結(jié)構(gòu)因素。

2009-09-22 ＊通訊聯(lián)系人

姚玉靜(1979-),女,在讀博士研究生,研究方向：食品科學(xué)。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2006BAD27B04)。