藍莓類飲料中花青素的快速檢測方法

宋陽成，陳玉娟，李 皓，陳小樺，陳長武，任保國

(1.吉林工程技術(shù)師范學院食品工程學院，吉林 長春 130052；2.長春理工大學生命科學技術(shù)學院，吉林 長春 130000；3.黔南民族職業(yè)技術(shù)學院農(nóng)學院，貴州 興義 562400)

藍莓類飲料中花青素的快速檢測方法

宋陽成1，陳玉娟2，李 皓1，陳小樺3，陳長武1，任保國1

(1.吉林工程技術(shù)師范學院食品工程學院，吉林 長春 130052；2.長春理工大學生命科學技術(shù)學院，吉林 長春 130000；3.黔南民族職業(yè)技術(shù)學院農(nóng)學院，貴州 興義 562400)

目的：建立藍莓飲料中飛燕草定-3-O-葡萄糖苷及錦葵定-3-O-葡萄糖苷兩種花青素類成分的高效液相色譜快速檢測方法。方法：采用高效液相色譜法，使用安捷倫ZORBAX SB-C18(4.6mm×75mm，3.5μm)色譜柱，以3%磷酸溶液和甲醇為流動相，二極管陣列檢測器在波長525nm處進行檢測。結(jié)果：該方法對飛燕草定-3-O-葡萄糖苷和錦葵定-3-O-葡萄糖苷的最低檢出限分別為0.4ng和2.5ng，標準曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.9984，回收率在90.2%～98.3%之間，相對標準偏差不大于1.79%。結(jié)論：該法簡潔、快速且靈敏度高，適合于藍莓類飲料中花青素的快速檢測。

藍莓；飲料；花青素；高效液相色譜法

花青素(anthocyanins)又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物[1-4]，多以糖苷的形式存在，也稱花色苷[5-8]。最早且最豐富的花青素是從紅葡萄渣中提取的葡萄皮紅[9]?；ㄇ嗨刈鳛橐环N天然食用色素，安全、無毒、資源豐富，而且具有一定營養(yǎng)和藥理作用，在食品、化妝、醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用潛力[10-11]。有實驗證明，花青素是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強效的自由基清除劑，具有多種保健功能。最近美國的一份研究報告指出，藍莓所含有的花青素是所有的水果與蔬菜之中含量最高的，而藍莓的花青素最豐富的部分就是在它特有的紫色果皮部位[12]。

藍莓學名越橘，杜鵑花科越橘屬植物，是少有的藍色食品之一。藍莓果實營養(yǎng)豐富，除含有常規(guī)的糖、酸、V C。礦物元素外，藍莓果實中還含有尼克酸、SOD、黃酮等特殊成分。VC含量是蘋果的幾十倍[12]，被譽為“漿果之王”，是上等的保健食品，風靡歐美各國，備受人們推崇和喜愛。藍莓不僅營養(yǎng)價值高，還含有大量對人類健康有益的物質(zhì)，被美國最有影響力的健康雜志稱為“神奇果”。目前有實驗表明，藍莓具有增強人體免疫力、延緩衰老，預(yù)防心血管疾病、改善視力、抗腫瘤、抗氧化等作用，已經(jīng)逐漸被國內(nèi)學者和廣大群眾所接受和喜愛。藍莓對土壤的酸度要求較高，所以全球藍莓的種植面積十分有限，僅局限于美國和加拿大等地[13]，目前美國已形成了集栽培、貯運、加工及市場服務(wù)于一體的藍莓產(chǎn)業(yè)。但隨著市場需要，我國各種藍莓汁、藍莓飲品、藍莓酒充斥市場，質(zhì)量良莠不齊，好壞無從分辨[14]。因此建立一種快速、簡便的測定藍莓飲料質(zhì)量的方法十分必要。本實驗是在參考文獻的基礎(chǔ)上[15-16]，應(yīng)用高效液相色譜法，同時測定飛燕草定-3-O-葡萄糖苷及錦葵定-3-O-葡萄糖苷。目前現(xiàn)有方法多采用150mm以上色譜柱才能達到良好分離，本實驗采用75mm色譜柱即可達到分離效果，所耗費時間短，分離效果好。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

藍莓汁飲料、藍莓果酒 市售。

甲醇 美國迪馬公司；二重水 自制；磷酸(分析純) 北京化工二廠；飛燕草定-3-O-葡萄糖苷、錦葵定-3-O-葡萄糖苷 法國Extrasynthese公司。

液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；AB135-S天平 瑞士梅特勒-托利多集團；Thermo PICO17離心機美國熱電集團。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

藍莓汁飲料：移取5mL試樣(精確到0.01mL)到50mL容量瓶中，加水后超聲波振蕩，并定容到50mL，l4000 r/min離心5min，上清液經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾，備用。

藍莓果酒：移取5mL試樣(精確到0.01mL) 到50mL容量瓶中，加水后超聲波振蕩，并定容到50mL，l4000 r/min離心5min，上清液經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾，備用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×75mm，3.5μm)；流動相：A(3%磷酸溶液)-B(甲醇)；0～10.5min，B為23%；10.5～29.1min，B為23%～26%；29.1～40min，B為26%～60%。流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長：525nm。

1.2.3 標準曲線繪制

分別精確稱取飛燕草定-3-O-葡萄糖苷、錦葵定-3-O-葡萄糖苷各25mg，于25mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成兩個質(zhì)量濃度分別為1.0mg/mL的儲備液。分別移取上述儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL到10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成混合標準溶液。得到5個系列質(zhì)量濃度的混合標準溶液：50、100、150、200、250μg/mL，備用。在上述色譜條件下進行HPLC測定，作峰面積對濃度的標準曲線，求出直線回歸方程。

1.2.4 液相色譜測定

在相同的液相色譜條件下，分別將標準溶液和樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，以試樣峰面積與標準比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法前處理條件的選擇

對于藍莓汁飲料、藍莓果酒，根據(jù)花青素的理化特性可選擇水作為提取溶劑采用1:4的提取比例，并用超聲波振蕩10min提取，之后定容至50mL，l4000r/min離心5min，取上清液經(jīng)水系濾膜即可，這可使操作更簡單、提取效果更好。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動相

為了快速檢測樣品，本研究發(fā)現(xiàn)以3%磷酸溶液和甲醇為流動相能快速有效分離飛燕草定-3-O-葡萄糖苷和錦葵定-3-O-葡萄糖苷，選擇的色譜條件為：流動相為A(3%磷酸酸溶液)-B(甲醇)；洗脫條件為0～10.5min、B23%；10.5～29.1min、B23%～26%；29.1～40.0min、B26%～60%。此時，飛燕草定-3-O-葡萄糖苷在6.978min出峰，錦葵定-3-O-葡萄糖苷在9.294min出峰，兩種成分達到完全基線分離(圖1)。

圖1 飛燕草定-3-O-葡萄糖苷(峰1)、錦葵定-3-O-葡萄糖苷(峰2)標準品液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of standard delphinidin-3-O-glucoside and malvidin-3-O-glucoside

2.2.2 線性范圍

在規(guī)定的色譜條件下，將標準溶液系列進樣10μL進行測定，飛燕草定-3-O-葡萄糖苷和錦葵定-3-O-葡萄糖苷的線性范圍分別為33.68～168.40 μ g/mL和44.21～221.05μg/mL；求飛燕草定-3-O-葡萄糖苷和錦葵定-3-O-葡萄糖苷響應(yīng)峰面積的線性回歸方程，其方程分別為Y=12.714X+13(r=0.9994)和Y=12.771X－13.8(r=0.9984)。符合定量要求。

表1 精密度實驗結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

2.2.3 精密度和準確度測定

質(zhì)量濃度為50μg/mL的樣品6次實驗的結(jié)果見表1，飛燕草定-3-O-葡萄糖苷，錦葵定-3-O-葡萄糖苷的RSD分別為1.79%和1.70%。

2.2.4 回收率實驗

稱取含有以上花青素的樣品各5份，將飛燕草定-3-O-葡萄糖苷和錦葵定-3-O-葡萄糖苷標準溶液5mL，加入5mL水進行稀釋。將稀釋后的標準溶液倒入稱取的5份樣品中，進行測定。樣品加樣回收率飛燕草定-3-O-葡萄糖苷為90.2%，錦葵定-3-O-葡萄糖苷為98.3%。

2.2.5 方法的最低檢測限和定量限

以進樣量10μL基線噪音的3倍為最低檢測限計算，飛燕草定-3-O-葡萄糖苷的最低檢測限為0.4ng、最低定量限5.0ng，錦葵定-3-O-葡萄糖苷的最低檢測限2.5ng、最低定量限10ng。2.3 實際樣品檢測

圖2 藍莓飲料液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of blueberry beverage

圖3 藍莓果酒液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of blueberry fruit wine

從圖2、3結(jié)果看，此方法選擇性強、重現(xiàn)性高，達到基線分離，能從飲料中快速地檢測出飛燕草定-3-O-葡萄糖苷、錦葵定-3-O-葡萄糖苷。

3 結(jié) 論

本實驗確立的檢測方法簡單快速、選擇性強、重現(xiàn)性和回收率高，達到基線分離，適用于各種含有藍莓成分的樣品的分析，飲品中各種常見防腐劑、甜味劑都不影響飛燕草定-3-O-葡萄糖苷和錦葵定-3-O-葡萄糖苷的定性定量分析。

[1] 王日為, 張麗霞, 高吉剛.茶葉中花青素類物質(zhì)研究展望[J]. 茶葉科學技術(shù), 2002(4): 4- 8.

[2] OGURI S. Electromigration methods for amino acids biogenic amines and aromatic amines[J]. J Chromatogr B, 2000, 747: 1-19.

[3] MORET S, CONTE L S. High-performance liquid chromatographic evaluation of biogenic amines in foods an analysis of ifferent methods of sample preparation relation to food characteristics[J]. J Chromatogr A,1996, 729: 363-369.

[4] ROBERTO R, MERCEDES S V, DOMINGO G, et al. Characterization of selected Spanish table wine samples according to their biogenic amine content from liquid chromatographic determination[J]. J Agic Food Chem,2002, 50: 4714-4717.

[5] MAH J H, HAN H K, OH Y J, et al. Biogenic amine in jeotkals, Korean salted and fermented fish products[J]. Food Chemistry, 2002, 79: 239-243.

[6] KIRSCHBAUM J, REBSCHER K, BRUCKNER H. Liquid chromatographic determination of biogenic amines in fermented foods afer derivatization with 3,5-dinitrobenzoyl chloride[J]. J Chromatography A,2000, 881: 517-530.

[7] TAMIN N M, BENNETT L W, SHELLEM A, et al. Hightperformance liquid chromatographic determination of biogenic amine in poultry carcasses[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50: 5012-5015.

[8] 莫巍. 彩葉樹種葉片中花青素含量的測定及動態(tài)分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學, 2007, 44(Suppl 2): 138-140.

[9] ANNANARYJU D. Sarma, antioxidant ability of anthocyanins against ascorbic acid oxidation[J]. Phytochemistry, 1997, 45(4): 671-674.

[10] 趙宇瑛, 張漢. 花青素的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學,2005, 33(5): 904-905; 907.

[11] 李亞東, 張志東, 吳林. 藍莓果實的成分及保健機能[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2002(1): 27-28.

[12] 胡雅馨, 李京, 惠伯棣. 藍莓果實中主要營養(yǎng)及花青素成分的研究[J]. 食品科學, 2006, 27(10): 600-603.

[13] 孔祥強. 談藍莓中花青素的保健功能[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2009(15):130-131.

[14] 於紅, 賀善安, 顧姻. 我國和世界藍莓漿果的發(fā)展前景[J]. 植物資源與環(huán)境學報, 2001, 10(2): 52-55.

[15] 袁帥, 姚勝軍, 耿昱, 等. HPLC-ESI-MS/MS識別藍莓提取物中花青素和黃酮醇[J]. 化學學報, 2009, 67(4): 318-322.

[16] 李穎暢, 宣景宏, 孟憲軍. 藍莓果種花色素苷的研究進展[J]. 食品研究與開發(fā), 2007, 28(1): 178-780.

Rapid Detection Methods for Anthocyanins in Blueberry Beverage

SONG Yang-cheng1，CHEN Yu-juan2，LI Hao1，CHEN Xiao-hua3，CHEN Chang-wu1，REN Bao-guo1(1. College of Food, JilinInstitute of Engineering and Technology, Changchun 130052, China；2. College of Life Science, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130000, China；3.College of Agronomy, Qiannan Vocational and Technical College for Nationalities, Xingyi 562400, China)

Objective: To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for simultaneous determination of delphinidin-3-O-glucoside and malvidin-3-O-glucoside in blueberry beverage. Methods: The anthocyanins including delphinidin-3-O-glucoside and malvidin-3-O-glucoside were determined by HPLC with ZORBAX SB-C18 (4.6 mm × 75 mm, 3.5μm) as the chromatographic column, 3% phosphoric acid-methanol as the mobile phase, diode array as the detector and detection wavelength at 525 nm. Results: The detection limits of this HPLC method for delphinidin-3-O-glucoside and malvidin-3-O-glucoside were 0.4 ng and 2.5 ng, respectively. The standard curve determined by this method exhibited an excellent linear relationship with correlation coefficient larger than 0.9984. The recovery rate of this method was in the range of 90.2%－98.3%with relative standard deviation less than 1.79%. Conclusion: The established HPLC method is a simple, rapid and sensitive determination method, which is suitable for the rapid determination of anthocyanins in blueberry beverage.

beverage；blueberry；anthocyanins；high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.61

A

1002-6630(2010)24-0334-03

2010-08-02

宋陽成(1968—)，男，講師，碩士，主要從事分析化學研究。E-mail：songyangchengsych@163.com