添加乳蛋白水解物配方奶粉的免疫功能評價(jià)

孟維彬，胡志和,*，王麗娟，馮永強(qiáng)，朱利民

(1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.天津海河乳業(yè)有限公司，天津 300402)

添加乳蛋白水解物配方奶粉的免疫功能評價(jià)

孟維彬1，胡志和1,*，王麗娟1，馮永強(qiáng)2，朱利民2

(1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.天津海河乳業(yè)有限公司，天津 300402)

根據(jù)我國免疫調(diào)節(jié)功能食品的評價(jià)方法，對添加乳蛋白水解物的免疫增強(qiáng)乳制品的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行評價(jià)。在實(shí)驗(yàn)中，采用Balb/c 小鼠建立免疫低下模型，以不同劑量的配方奶粉對小鼠進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行免疫臟器質(zhì)量、細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨嗜細(xì)胞功能等指標(biāo)檢測。結(jié)果表明：在所選定的劑量范圍內(nèi)，添加乳源蛋白水解物的老年奶粉和嬰幼兒(三段)奶粉結(jié)果均為陽性，因此可判定配方奶粉具有免疫增強(qiáng)作用。

乳蛋白水解物；配方奶粉；免疫調(diào)節(jié)功能

目前，從不同的乳蛋白降解產(chǎn)物得到了多種具有生理功能的活性肽，不僅改善了乳蛋白的加工性能，而且為乳的深加工奠定了基礎(chǔ)[1-3]。Mellander[4]從酪蛋白中首次獲得了酪蛋白磷酸肽(CPP)，Brantl等[5]從部分酶水解的牛奶酪蛋白中發(fā)現(xiàn)了阿片樣活性肽。這些發(fā)現(xiàn)使得營養(yǎng)學(xué)家開始重視對酪蛋白源的生物活性肽的生理功能的研究，并且日趨成為乳品領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。這些肽類具有非常重要和廣泛的生物學(xué)功能，其中有些已經(jīng)通過工業(yè)化生產(chǎn)。對腸道的組織形態(tài)學(xué)的研究表明，酪蛋白酶解產(chǎn)物能提高胃的質(zhì)量，增加十二指腸絨毛高度與隱窩深度的比值[6]。牛乳蛋白經(jīng)胰酶處理后飼喂初生仔豬，對腸道的組織生長，隱窩細(xì)胞增殖和黏膜酶的活性有一定刺激作用[7-9]。乳清蛋白蘊(yùn)含多種生物活性功能的片段，其酶解產(chǎn)物可分離出具有提高心血管系統(tǒng)功能、改善糖尿病、抗衰老、提高免疫、改善體質(zhì)等功能的多肽[10-12]。乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)及其水解產(chǎn)物乳鐵素(lactoferricin，Lfcin)具有促進(jìn)鐵吸收功能[13]、抑菌和殺菌作用[14]、調(diào)整腸道菌群[15-16]、免疫調(diào)節(jié)活性[16]、抗氧化功能[17]、抗病毒功能[18]、基因調(diào)節(jié)功能[19]等，可以作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑用于乳制品及其他益生菌的功能性食品中。本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，按照我國免疫調(diào)節(jié)食品的功能檢驗(yàn)方法，對添加乳蛋白水解物的免疫增強(qiáng)乳制品進(jìn)行免疫功能評價(jià)，檢驗(yàn)添加乳蛋白水解產(chǎn)物能否增強(qiáng)配方奶粉的免疫作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮牛初乳 天津海河乳業(yè)有限公司；Balb/c 小鼠(18～22g，雌、雄性各半) 中國醫(yī)學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

鹽酸、氫氧化鈉、胰蛋白酶、乳鐵蛋白(純度為90%，鐵飽和度為15%)、胃蛋白酶、藥用環(huán)磷酰胺、二硝基氟苯(DNFB)、丙酮、麻油、硫化鋇、綿羊紅細(xì)胞(SRBC，綿羊靜脈取血自制)、生理鹽水、Na2CO3、雞紅細(xì)胞、甲醇、G i e m s a染液、山藥粉、低聚麥芽糖。

電子天平、離心機(jī)、72 1分光光度計(jì)、計(jì)時(shí)器、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 原材料制備

酪蛋白水解產(chǎn)物的制備：配制質(zhì)量濃度8g/100mL的酪蛋白溶液，在45℃、pH8.0，酶與底物質(zhì)量比為1:30條件下用胰蛋白酶水解，水解過程中不斷攪拌并加入0.1mol/L的NaOH溶液維持pH8.0，當(dāng)pH值不變時(shí)，85℃滅酶15min，用0.1mol/L HCl溶液調(diào)pH7.0，4000r/min離心30min，上清液冷凍干燥。

乳清蛋白水解產(chǎn)物的制備：配制質(zhì)量濃度6g/100mL的乳清蛋白溶液，在45℃、pH8.0，酶與底物質(zhì)量比為1:30條件下用胰蛋白酶水解。酶解過程中不斷攪拌并加入0.1mol/L NaOH溶液維持pH8.0，當(dāng)pH值不變時(shí)，85℃滅酶15min，用0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH7.0，4000r/min離心30min，上清液冷凍干燥。

乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的制備：配制質(zhì)量濃度為5g/100mL的乳鐵蛋白溶液，在37℃、pH3.0、酶與底物質(zhì)量比為1:30條件下用胃蛋白酶水解，水解過程中用0.1mol/L NaOH溶液維持pH3.0，水解結(jié)束后，85℃滅酶15min。用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH7.0，4000r/min離心30min，上清液冷凍干燥，獲得乳鐵蛋白水解產(chǎn)物。

添加乳源蛋白水解物的中老年奶粉：100g奶粉中乳鐵蛋白水解產(chǎn)物0.05g、酪蛋白水解產(chǎn)物4.8g、乳清蛋白水解產(chǎn)物1.15g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的山藥粉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%低聚異麥芽糖以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%初乳粉作為輔料進(jìn)行混合。

添加乳源蛋白水解物的嬰幼兒奶粉(三段)：100g奶粉中添加乳鐵蛋白水解產(chǎn)物0.05g，酪蛋白水解產(chǎn)物4.8g、乳清蛋白水解產(chǎn)物1.15g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%低聚果糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%低聚異麥芽糖以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%初乳粉作為輔料混合。

1.2.2 配方奶粉對免疫臟器質(zhì)量的影響

1.2.2.1 建立脾臟、胸腺小鼠免疫低下模型[20]

Balb/c小鼠30只，隨機(jī)分3組，每組10只。對各組小鼠分別以0、40、80mg/kg bw的環(huán)磷酰胺一次性腹腔注射，注射量為10mL/kg bw。在給藥后第2、3、4、5、6天測定脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，判定小鼠免疫低下最低點(diǎn)。所得數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，以±s表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

1.2.2.2 灌胃及指標(biāo)測定

取體質(zhì)量為18～22g左右的小鼠(90只)，雌雄兼用，隨機(jī)分為9組，每組10只，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及灌胃劑量Table 1 Animal grouping and corresponding administration protocol

按照表1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)連續(xù)灌胃15d。末次給藥后次日，摘眼球放血處死動(dòng)物，剝離胸腺和脾臟，用電子天平稱質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)，比較各組間的差異。

1.2.3 配方奶粉對細(xì)胞免疫功能影響

采用二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)(耳腫脹法)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 試劑配制

DNFB溶液：DNFB溶液應(yīng)新鮮配制，稱取DNFB 50mg，置清潔干燥小瓶中，將預(yù)先配好的5mL丙酮麻油溶液(丙酮與麻油體積比為1:1)，倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封?；靹蚝?，用250μL注射器通過瓶蓋取用。

1.2.3.2 建立小鼠耳腫脹免疫低下模型[20]

小鼠數(shù)量、分組及給藥劑量同1.2.2.1節(jié)方法，在給造模藥后第2、3、4、5、6 天每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約 3cm×3cm、用 DNFB 溶液50μL均勻涂抹致敏。5d后，測定耳腫脹度或耳腫脹率，判定小鼠免疫狀態(tài)最低點(diǎn)。

1.2.3.3 灌胃及耳腫脹率檢測

小鼠數(shù)量、分組及給藥劑量同方法1.2.2.2節(jié)，灌胃配方奶粉，末次給藥后次日，給小鼠一次性腹腔注射80mg/kg bw的環(huán)磷酰胺，注射量為10mL/kg bw。第3天，每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約 3cm×3cm、用DNFB溶液50μL均勻涂抹致敏。5d后，用DNFB 溶液10μL 均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進(jìn)行攻擊。攻擊后24h 頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱質(zhì)量，計(jì)算耳腫脹率。左右耳質(zhì)量之差表示DTH的程度。所得數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，以±s表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。受試樣品組的差值顯著高于與對照組的差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.2.4 對體液免疫功能影響評價(jià)(血清溶血素的測定)

用SRBC免疫動(dòng)物后，產(chǎn)生抗SRBC抗體(溶血素)，利用其凝集SRBC的程度來檢測溶血素的水平。

1.2.4.1 SRBC細(xì)胞懸液

綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)方向搖動(dòng)，以脫纖維，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆茫杀４?周。取羊血，用生理鹽水洗滌3次，2000r/min離心10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成體積分?jǐn)?shù)2%的細(xì)胞懸液。

1.2.4.2 建立小鼠抗體水平免疫低下模型

小鼠數(shù)量、分組及給藥劑量同1.2.2.1節(jié)方法，在給造模藥后第2、3、4、5、6 天每只鼠腹腔注射0.2mL SRBC細(xì)胞懸液進(jìn)行免疫。4～5d后，測定血球凝集程度。經(jīng)過Excel軟件處理，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。根據(jù)結(jié)果判定小鼠免疫低下狀態(tài)最低點(diǎn)。

1.2.4.3 灌胃及血清溶血素測定

小鼠數(shù)量、分組及給藥劑量同方法1.2.2.2節(jié)，灌胃配方奶粉，末次給藥后次日，給小鼠一次性腹腔注射80mg/kg bw的環(huán)磷酰胺，注射量為10mL/kg bw。第3天，每只小鼠腹腔注射0.2mL SRBC細(xì)胞懸液進(jìn)行免疫。4～5d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100μL ，再加入100μL 體積分?jǐn)?shù)0.5%的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。

1.2.4.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

血清凝集程度一般分為5級(0～Ⅳ)記錄，按公式3計(jì)算抗體積數(shù)，受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于對照組的抗體積數(shù)，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

式中：1、2、3……n代表對倍稀釋的指數(shù)；S代表凝集程度的級別；抗體積數(shù)越大，表示血清抗體水平越高，0級：紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清皙；Ⅰ級：紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成圓點(diǎn)狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞；Ⅱ級：凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個(gè)疏松的紅點(diǎn)；Ⅲ級：凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個(gè)小紅點(diǎn)；Ⅳ級：凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時(shí)成卷折狀。

1.2.5 對單核-巨嗜細(xì)胞吞噬功能影響評價(jià)——小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(半體內(nèi)法)

巨噬細(xì)胞能吞噬雞紅細(xì)胞。將上述2種細(xì)胞37℃孵育后染色，在油鏡下計(jì)算吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的百分比，并觀察細(xì)胞內(nèi)雞紅細(xì)胞的形態(tài)。據(jù)此判斷巨噬細(xì)胞的吞噬功能和消化功能。

1.2.5.1 雞紅細(xì)胞懸液制備

取雞血置于有玻璃珠的錐形瓶中，朝一個(gè)方向充分搖動(dòng)，以脫纖維。用生理鹽水洗滌2～3次，2000r/min離心10min，去上清，用生理鹽水配成體積分?jǐn)?shù)20%的雞紅細(xì)胞懸液。

1.2.5.2 建立小鼠吞噬細(xì)胞、吞噬功能免疫低下模型

小鼠數(shù)量，分組及給藥劑量同1.2.2.1節(jié)方法，在給造模藥后第2、3、4、5、6天測定吞噬功能，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，根據(jù)結(jié)果判定小鼠免疫低下狀態(tài)最低點(diǎn)。

1.2.5.3 吞噬功能測定

小鼠數(shù)量、分組及給藥劑量同1.2.2.2節(jié)方法，灌胃配方奶粉，末次給藥后次日，給小鼠一次性腹腔注射80mg/kg bw的環(huán)磷酰胺，注射量為10mL/kg bw。第3天，每鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1mL。間隔30min，頸椎脫臼處死動(dòng)物，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2mL，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕沙布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵箱溫育30min。孵畢，于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞。晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定，體積分?jǐn)?shù)4% Giemsa- 磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干。

1.2.5.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，每張片計(jì)數(shù)100個(gè)，按公式(6)和(7)分別計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

在計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)同時(shí)觀察雞紅細(xì)胞被消化的程度。借以判定巨噬細(xì)胞吞噬與消化功能，通常分為4級：Ⅰ級：未消化。被吞噬的雞紅細(xì)胞完整，胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色，胞核淺紫色；Ⅱ級：輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色、胞核固縮呈紫藍(lán)色；Ⅲ級：重度消化。胞質(zhì)淡染，胞核淡淺灰色；Ⅳ級：完全消化。巨噬細(xì)胞內(nèi)僅見形態(tài)類似雞紅細(xì)胞大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。

受試樣品組的吞噬百分率、吞噬指數(shù)與對照組吞噬百分率、吞噬指數(shù)比較，差異均有顯著性，方可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 配方奶粉對免疫臟器質(zhì)量的影響

2.1.1 脾臟和胸腺免疫低下模型的建立

表2 環(huán)磷酰胺引起小鼠脾臟指數(shù)的變化(±s, n=10)Table 2 Changes of mouse spleen index after intraperitoneal injection of Cy ±s, n=10)

表2 環(huán)磷酰胺引起小鼠脾臟指數(shù)的變化(±s, n=10)Table 2 Changes of mouse spleen index after intraperitoneal injection of Cy ±s, n=10)

注：*.與對照相比較，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與對照組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

劑量/ 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天(mg/kg bw)對照 5.86±0.98 5.42±0.78 5.03±0.99 4.97±1.10 5.61±1.24 40 4.11±0.87** 3.79±0.64** 3.48±0.74** 5.19±0.77* 6.87±0.76*80 3.73±0.76** 3.29±0.49** 3.34±0.48** 4.89±0.27 6.31±0.46*

由表2可知，脾臟對環(huán)磷酰胺比較敏感。一次性通過腹腔注射給予小鼠0、40、80mg/(kg bw·d) 的環(huán)磷酰胺，第2天、第3天和第4天劑量反應(yīng)變化基本相同，且均有劑量效應(yīng)關(guān)系，所有造模組與對照組比較均具有極顯著性差異，即小鼠脾臟指數(shù)處于免疫低下狀態(tài)。第6天，造模組免疫狀態(tài)恢復(fù)正常，且脾臟指數(shù)有代償性增大。以80mg/kg bw 環(huán)磷酰胺腹腔注射之后的小鼠在第3天為脾臟免疫最低下狀態(tài)。

由表3可知，胸腺指數(shù)在給藥后第2天已出現(xiàn)明顯變化(P＜0.05)，第3天和第4天出現(xiàn)極顯著變化(P＜0.01)，且變化與劑量相關(guān)，在40、80mg/kg bw 組胸腺指數(shù)均出現(xiàn)了免疫低下狀態(tài)。第6天時(shí)，40、80mg/kg bw劑量組胸腺指數(shù)均基本恢復(fù)正常，未見代償性增強(qiáng)的情況。以80mg/kg bw 環(huán)磷酰胺腹腔注射之后的小鼠在第3天為胸腺免疫最低下狀態(tài)。

表3 環(huán)磷酰胺引起小鼠胸腺指數(shù)的變化結(jié)果(±s, n=10)Table 3 Changes of mouse thymus index after intraperitoneal injection of Cy (±s, n=10)

表3 環(huán)磷酰胺引起小鼠胸腺指數(shù)的變化結(jié)果(±s, n=10)Table 3 Changes of mouse thymus index after intraperitoneal injection of Cy (±s, n=10)

劑量/(mg/kg bw) 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天對照 2.17±0.98 2.04±0.41 2.11±0.54 2.19±0.12 2.27±0.21 40 1.94±0.57* 1.40±0.37** 1.51±0.39** 1.96±0.37* 2.09±0.76 80 1.91±0.46* 1.23±0.24** 1.44±0.43** 1.87±0.35* 2.10±0.61

綜合表2、表3可知，注射80mg/kg bw 環(huán)磷酰胺以后的第3天的小鼠作為下一步實(shí)驗(yàn)所需要的免疫低下模型。

2.1.2 配方奶粉對臟對器質(zhì)量的影響

表4 添加乳源蛋白水解產(chǎn)物的配方奶粉對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(±s, n=10)Table 4 Effect of formula milk powder with added lactoprotein hydrolysates on immunosuppressed mouse spleen index and thymus index (±s, n=10)

表4 添加乳源蛋白水解產(chǎn)物的配方奶粉對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(±s, n=10)Table 4 Effect of formula milk powder with added lactoprotein hydrolysates on immunosuppressed mouse spleen index and thymus index (±s, n=10)

注：a.與生理鹽水對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；b.與生理鹽水對照組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；c.與同劑量配方奶粉相比，有顯著性差異(P＜0.05)；d.與同劑量配方奶粉相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別 脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)1 3.32±0.041 1.38±0.026 2 3.55±0.055 1.42±0.025 3 4.04±0.090bd 1.89±0.054bd 4 3.56±0.083 1.43±0.022 5 3.92±0.107ac 1.94±0.040bd 6 3.53±0.064 1.43±0.032 7 3.94±0.084bd 1.94±0.043bd 8 3.51±0.036 1.44±0.026 9 3.97±0.069bd 2.01±0.036bd

由表4可知，添加乳源蛋白水解物乳制品能夠明顯提高環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)。當(dāng)添加乳源蛋白水解物老年奶粉灌胃量為1g/(kg bw·d)和10g/(kg bw·d)時(shí)對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有顯著的影響。添加乳源蛋白水解物嬰幼兒(三段)奶粉的兩個(gè)劑量也有相同結(jié)果。綜合以上可以得出，添加乳源蛋白水解物奶粉可以顯著增強(qiáng)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，結(jié)果為陽性。

2.2 配方奶粉對細(xì)胞免疫功能的影響

2.2.1 耳腫脹免疫低下模型的建立

表5 環(huán)磷酰胺引起的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(耳腫脹度/mg)變化結(jié)果(±s, n=10)Table 5 Changes of ear swelling rate after intraperitoneal injection of Cy (±s, n=10) mg

表5 環(huán)磷酰胺引起的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(耳腫脹度/mg)變化結(jié)果(±s, n=10)Table 5 Changes of ear swelling rate after intraperitoneal injection of Cy (±s, n=10) mg

劑量/(mg/kg bw) 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天對照 4.62±0.86 4.51±0.62 4.57±1.01 4.67±0.66 4.73±0.13 40 4.25±0.72 4.01±0.61* 4.04±0.65* 4.31±0.23 4.40±0.67 80 4.13±0.34* 3.64±0.19** 3.89±0.27* 4.15±0.46* 4.45±0.51

表6 添加乳源蛋白水解產(chǎn)物的配方奶粉對耳腫脹率的影響±s, n=10)Table 6 Effect of formula milk powder with added lactoprotein hydrolysates on immunosuppressed mouse ear swelling rate (±s, n=10)

表6 添加乳源蛋白水解產(chǎn)物的配方奶粉對耳腫脹率的影響±s, n=10)Table 6 Effect of formula milk powder with added lactoprotein hydrolysates on immunosuppressed mouse ear swelling rate (±s, n=10)

組別 1 2 3 4 5 6 7 8 9耳腫脹率/%17.61±0.45 18.17±1.15 21.4±1.43ac19.54±0.60 24.98±1.73ac17.39±0.51 20.2±0.97ac 16.37±0.54 19.63±2.22ac

表8 添加乳源蛋白水解產(chǎn)物的配方奶粉對抗體積數(shù)的影響±s, n=10)Table 8 Effects of formula milk powder with added lactoprotein hydrolysates on immunosuppressed mouse antibody level (±s, n=10)

表8 添加乳源蛋白水解產(chǎn)物的配方奶粉對抗體積數(shù)的影響±s, n=10)Table 8 Effects of formula milk powder with added lactoprotein hydrolysates on immunosuppressed mouse antibody level (±s, n=10)

組別 1 2 3 4 5 6 7 8 9抗體積數(shù) 31.5±0.33 31.4±0.38 36.1±0.61bd 32.1±0.52 35.3±0.92bd 31.8±0.49 36.1±0.91bd 31.8±0.53 36.1±0.90bd

由表5可知，小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)對環(huán)磷酰胺敏感性差。造模第3天和第4天，80mg/kg bw劑量組出現(xiàn)細(xì)胞免疫低下狀態(tài)明顯，在第3天為免疫最低下狀態(tài)。

2.2.2 耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，添加乳源蛋白水解物奶粉對小鼠耳腫脹率的影響是顯著的，在所選擇的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以1g/(kg bw·d)及10g/(kg bw·d)乳源蛋白水解物老年奶粉灌胃和2g/(kg bw·d)及20g/(kg bw·d)乳源蛋白水解物嬰幼兒(三段)奶粉對小鼠耳腫脹率均具有顯著影響。因此，添加乳源蛋白水解物奶粉對細(xì)胞免疫具有調(diào)節(jié)功能。

2.3 配方奶粉對體液免疫影響

表7 環(huán)磷酰胺引起小鼠抗體積數(shù)的變化(±s, n=10)Table 7 Changes of mouse antibody level after intraperitoneal injection of Cy (±s, n=10)

表7 環(huán)磷酰胺引起小鼠抗體積數(shù)的變化(±s, n=10)Table 7 Changes of mouse antibody level after intraperitoneal injection of Cy (±s, n=10)

劑量/(mg/kg bw) 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天對照 46 46 48 46 47 40 34* 32* 35* 39 45 80 36* 29** 34* 37 42

2.3.1 小鼠抗體水平免疫低下模型的建立

由表7可知，40、80mg/kg bw 的環(huán)磷酰胺腹腔注射之后的小鼠在第2、3、4、5、6天都出現(xiàn)了抗體積數(shù)值降低的現(xiàn)象，其中以80mg/kg bw 環(huán)磷酰胺腹腔注射之后的小鼠在第3天為抗體積數(shù)免疫最低下狀態(tài)。

2.3.2 血清溶血素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表8可知，在所選擇的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，0.05、0.5g/mL添加乳源蛋白水解物老年奶粉，0.1、1g/mL添加乳源蛋白水解物嬰幼兒(三段)奶粉對小鼠抗體積數(shù)的均有顯著影響。

2.4 配方奶粉對單核-巨嗜細(xì)胞功能的影響

2.4.1 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能免疫低下模型的建立

由表9可知，環(huán)磷酰胺對小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力有一定影響。第3 天和第4天，80mg/kg bw 劑量組出現(xiàn)吞噬功能低下狀態(tài)。表10也顯示出，80mg/kg bw 的環(huán)磷酰胺腹腔注射之后的小鼠在第3天為吞噬指數(shù)免疫最低下狀態(tài)。

表9 環(huán)磷酰胺引起小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率的變化(±s, n=10)Table 9 Changes of percentage of mouse mononuclear macrophages engaged in phagocytosis after intraperitoneal injection of Cy±s, n=10) %

表9 環(huán)磷酰胺引起小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率的變化(±s, n=10)Table 9 Changes of percentage of mouse mononuclear macrophages engaged in phagocytosis after intraperitoneal injection of Cy±s, n=10) %

劑量/(mg/kg bw)第2天 第3天 第4天 第5天 第6天對照 54.9±8.7 59.2±10.4 60.1±9.7 55.9±8.9 51.8±11.2 40 52.6±9.1 49.1±8.8* 50.8±11.2* 52.1±9.7 51.2±8.4 80 48.7±10.4*43.2±7.2**45.1±9.9** 50.1±8.4 50.4±9.7

表10 環(huán)磷酰胺對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響(±s, n=10)Table 10 Changes of phagocytic index of mouse mononuclear macrophage after intraperitoneal injection of Cy (±s, n=10)

表10 環(huán)磷酰胺對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響(±s, n=10)Table 10 Changes of phagocytic index of mouse mononuclear macrophage after intraperitoneal injection of Cy (±s, n=10)

劑量/(mg/kg bw) 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天對照 1.03±0.19 0.99±0.56 0.96±0.72 1.02±0.48 0.91±0.25 40 0.90±0.42 0.87±0.24* 0.88±0.15 0.96±0.22 0.88±0.34 80 0.82±0.21* 0.74±0.33** 0.76±0.17** 0.84±0.57 0.89±0.29

2.4.2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表11 添加乳源蛋白水解產(chǎn)物的配方奶粉對單核-巨嗜細(xì)胞功能的影響±s, n=10)Table 11 Effects of formula milk powder with added lactoprotein hydrolysates on phagocytic function of mononuclear macrophage in immunosuppressed mouse (±s, n=10)

表11 添加乳源蛋白水解產(chǎn)物的配方奶粉對單核-巨嗜細(xì)胞功能的影響±s, n=10)Table 11 Effects of formula milk powder with added lactoprotein hydrolysates on phagocytic function of mononuclear macrophage in immunosuppressed mouse (±s, n=10)

組別 吞噬率/% 吞噬指數(shù)1 43.4±0.58 0.75±0.009 2 44.3±0.73 0.75±0.007 3 49.0±1.2bd 0.81±0.007bd 4 44.1±0.59 0.75±0.011 5 49.3±1.08bd 0.79±0.010ac 6 43.4±0.79 0.75±0.010 7 48.6±1.07bd 0.79±0.011ac 8 44.8±0.77 0.74±0.013 9 48.7±0.82ac 0.78±0.010ac

由表1 1可知，在所給定的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，1、10g/(kg bw·d)添加乳源蛋白水解物老年奶粉灌胃和2、20g/(kg bw·d)添加乳源蛋白水解物嬰幼兒(三段)奶粉灌胃對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響顯著。

3 結(jié) 論

綜合上述各實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)我國《功能學(xué)評價(jià)檢驗(yàn)方法-增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法》[21]，通過不同劑量的免疫增強(qiáng)乳制品對細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、免疫臟器質(zhì)量測定，在所選擇的灌胃劑量范圍內(nèi)，添加乳源蛋白水解物老年奶粉和添加乳源蛋白水解物嬰幼兒(三段)奶粉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性。因此，可判定上述兩種奶粉具有增強(qiáng)免疫力。

[1] KORHONEN H, PIHLANTO A. Bioactive peptides: production and functionality[J]. International Dairy Journal, 2006, 16: 945-960.

[2] HARTMANN R, MEISEL H. Foopeptid-derived des with biological activity: from research to food applications[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2007, 18: 163-169.

[4] MELLANDER O. The physiological importance of the caseinphosphopeptide ealcium salts. Ⅱ. Peroral calcium dosageof infants[J]. Acta of the Soci-ety of Medicine of Uppsala, 1950, 55: 247-255.

[5] BRANTL V, TESCHEMACHER A, HENSCHEN A, et al. Novel opioid peptides derived from casein (β-casomorphins)[J]. HoppeZeitschrift fur Physiologische Chemie, 1979, 360(9): 1211 -1216.

[6] 霍永久, 王恬, 張莉莉, 等. 酪蛋白酶解產(chǎn)物對新生仔豬胃腸道發(fā)育的影響[J] . 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2006, 27(4): 47-50.

[7] 鄭春田, 王恬, 陸治年, 等. 胰島素和酶解配方乳對初生仔豬小腸生長發(fā)育的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1999, 30(5): 405-413.

[8] 王恬, 許若軍. 酶解日糧蛋白對仔豬腸黏膜活性及腸道組織形態(tài)的影響[C]//第三屆全國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集. 成都: 中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)分會(huì)飼料營養(yǎng)專業(yè)委員會(huì), 1998: 153-154.

[9] WANG T, XU R J, CHANG Y Q, et al. Effect s of milk protein prehydrolyzation on crypt cell proliferation and intestinal morphology in neonatal pigs[J]. 中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志, 1999(2): 48-54.

[10] KUZMANOFF K M, BEATTIE C W. Isolation of monoclonal antibodies nonspecific for bovine β-lactoglobulin[J]. J Dairy Sci, 1991, 74:3731-3740.

[11] SEYDIM A C, SARIKUS G. Antimicrobial activity of whey protein based edible films incorporated with oregano, rosemary and garlic essential oils[J]. Food Research international, 2006, 39: 639-644.

[12] BRIX S, BOVETTO L, FRITSCHE R, et al. Immunostimulatory potential of beta-lactoglobulin preparations: effects caused by endotoxin contamination[J]. J Allergy Clin Immunol, 2003, 112: 1216-1222.

[13] KAWAKAMI H. Effect of iron-saturated lactoferrin on iron absorption[J].Agtic Biol Chem, 2005, 52(2): 903-908.

[14] AMOLD R R A. Bactericidal effect of for human lactoferrin[J]. Science,2007, 197: 263-265.

[15] WOAN-SUB K. Lactoferrin-binding proteins in Bifidobacterium bifidum[J]. Biochem Cell Biol, 2002, 80: 91-94.

[16] 盧蓉蓉, 許時(shí)嬰. 乳鐵蛋白的分離、純化及其生物活性功能[J]. 食品與生物技術(shù), 2002, 21(1): 67-70.

[17] 郭本恒. 益生菌[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004: 4-7.

[18] 黃海清, 薛建軍. 乳鐵蛋白的研究進(jìn)展[J]. 飼料博覽, 2006, 14: 3-8.

[19] CHRISTINA T T. Lactoferrin geneespression and regulation: an overview[J]. Biochemical and Cell Biology, 2002, 80(1): 7-16.

[20] 胡志和, 劉傳國, 龐廣昌, 等. 乳鐵素免疫調(diào)節(jié)功能評價(jià)[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(15): 200-204.

[21] 毛跟年, 許牡丹. 功能食品生理特性與檢測技術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 387-400.

Evaluation of Immunoregulatory Function of Formula Milk Powder Added with Lactoprotein Hydrolysates

MENG Wei-bin1， HU Zhi-he1,*， WANG Li-juan1， FENG Yong-qiang2， ZHU Li-min2
(1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China；2. Tianjin Haihe Dairy Co. Ltd., Tianjin 300402, China)

To understand the immunoregulatory function of formula milk powder added with lactoprotein hydrolysates,different doses of infant formula milk powder and middle-aged and senior formula milk powder with and without the additions of casein and milk whey protein hydrolysates were orally administered to the Balb/c mouse model with immunosuppression induced by intraperitoneal injection of cyclophosphate (Cy) for 15 successive days, respectively. Spleen index, thymus index,cellular immune response, humoral immune function and phagocytic function of mononuclear macrophage were determined on the second day after the last administration. It was found that the evaluation results of infant formula milk powder and middleaged and senior formula milk powder added with lactoprotein hydrolysates were both positive, thus proving that adding lactoprotein hydrolysates enhances the immunoregulatory function of formula milk powder.

lactoprotein hydrolysates；formula milk powder；immunoregulatory function

R151.2

A

1002-6630(2010)23-0360-06

2010-06-27

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(07ZCKFNC00200)

孟維斌(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：mengweibin8437@126.com

胡志和(1962—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)閷Ｓ霉δ苁称?。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn