雙歧桿菌RH菌株不同處理物修復(fù)腸道菌群平衡失調(diào)的研究

尚 楠，劉麗莎，旭日花*，武瑞赟

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

雙歧桿菌RH菌株不同處理物修復(fù)腸道菌群平衡失調(diào)的研究

尚 楠，劉麗莎，旭日花*，武瑞赟

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

為探討雙歧桿菌RH菌株對腸道菌群平衡失調(diào)的修復(fù)功能，本研究通過動物實驗，考察雙歧桿菌活菌(LB)、菌體破碎物(CE)及發(fā)酵上清液(FS)3種處理物灌胃由抗生素造成的菌群失調(diào)模型小鼠后對其腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸球菌、腸桿菌和擬桿菌6大類主要菌群的影響。結(jié)果顯示：3種處理物均可使小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量極顯著增加(P＜0.01)，產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸球菌數(shù)量顯著降低(P＜0.05和P＜0.01)，并能使腸桿菌和擬桿菌數(shù)量恢復(fù)至正常水平，說明該雙歧桿菌LB、CE和FS均可起到修復(fù)、調(diào)節(jié)小鼠腸道微生態(tài)平衡的作用。

雙歧桿菌；腸道菌群；菌群失調(diào)；修復(fù)

人體腸道內(nèi)存在數(shù)量龐大的腸道菌群，大約有100萬億個細(xì)菌，包括30個屬的500多種菌，其菌體總體積相當(dāng)于一個人的肝臟[1]。微生態(tài)研究表明，腸道微生物是人類健康和疾病的重要決定因素，這些微生物既包括有益菌，也包括有害菌。

乳桿菌和雙歧桿菌是腸道內(nèi)主要益生菌，與其他厭氧菌一起形成腸道的生物屏障，對致病菌及條件致病菌的定植入侵構(gòu)成一種定植抗力，保持腸道正常的微生態(tài)平衡，并且參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝，構(gòu)建免疫防御系統(tǒng)，對維持宿主健康起著重要的作用[2]。因此，保持腸道內(nèi)有益菌群的數(shù)量是宿主保持健康的關(guān)鍵因素。然而，氣候變化、攝入污染食物、精神狀況、手術(shù)、外傷及患過敏性疾病等外來因素的影響，以及人體老化、應(yīng)用抗生素、免疫抑制劑、抗癌劑、激素、輻射均能導(dǎo)致人體抵抗力下降，使致病菌和條件致病菌大量繁殖，雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌減少，造成腸道內(nèi)菌群發(fā)生紊亂，引起腹瀉、消化不良、維生素B族缺乏癥、低蛋白血癥、便秘等臨床疾病。

隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，已有許多針對菌群失調(diào)的微生態(tài)學(xué)療法，其中以應(yīng)用雙歧桿菌活菌制劑為主[3]。研究證明，攝入外源的雙歧桿菌等微生態(tài)制劑可以起到修復(fù)腸道菌群失調(diào)，促進內(nèi)源性有益菌增殖的作用[4-5]。本實驗以雙歧桿菌RH菌株的活菌、發(fā)酵上清液、菌體破碎物為材料，研究雙歧桿菌不同處理物對菌群失調(diào)小鼠腸道菌群平衡的影響和修復(fù)，旨在為進一步探討雙歧桿菌的生理功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

雙歧桿菌RH分離自廣西巴馬長壽老人腸道，由本實驗室分離并保存。該菌株經(jīng)生理生化實驗和1 6 S rDNA序列分析鑒定為動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)。

1.1.2 動物

近交系BALB/C小鼠70只，體質(zhì)量18～22g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

雙歧桿菌：BBL瓊脂培養(yǎng)基，(36±1)℃厭氧培養(yǎng)48～72h；乳桿菌：MRS培養(yǎng)基(pH 5.4)，(36±1)℃培養(yǎng)48h；產(chǎn)氣莢膜梭菌：TSC瓊脂培養(yǎng)基，(36±1)℃厭氧培養(yǎng)24h；擬桿菌：改良GAM瓊脂培養(yǎng)基，(36±1)℃厭氧培養(yǎng)48～72h；腸球菌：疊氮化鈉-結(jié)晶紫-七葉苷培養(yǎng)基，(36±1)℃培養(yǎng)48h；腸桿菌：VRPD培養(yǎng)基，(36±1)℃培養(yǎng)24h。鹽酸林可霉素及6種培養(yǎng)基配制用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

亨蓋特厭氧裝置；JY92-II超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝科技研究所；SCL-1300型垂直流潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司；YXQ-LS-75SII全自動高壓滅菌鍋 上海博迅實驗設(shè)備有限公司；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備公司；HH.S21-6恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠； TGL-20M高速冷凍離心機 湖南長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受試物制備

將雙歧桿菌RH按1%(菌濃度107CFU/mL)接種量接種于500mL改良MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48h至菌液濃度為1×109～3×109CFU/mL，將菌液4000r/min離心10min，分離得到發(fā)酵上清液(FS)。菌體用去離子水迅速洗滌兩次，再用相同體積的去離子水重懸雙歧桿菌沉淀，所得菌懸液分為兩組，一組作為活細(xì)胞組(live bacteria，LB)，另一組菌懸液經(jīng)65℃處理40min后，用超聲波粉碎儀在2kHz條件下處理，每處理2min、間隔lmin，超聲粉碎40min，顯微鏡下檢查沒有完整菌體后以7800r/min離心10min，收集上清液即為菌體破碎物(cell-free extract，CE)。

1.3.2 抗生素菌群失調(diào)模型的建立

隨機選擇14只小鼠(雌雄各半)作為陰性對照組，灌胃生理鹽水；其余為抗生素模型組，小鼠腹腔注射鹽酸林可霉素，連續(xù)3d，灌胃劑量50mg/(kg bw·d)。3d后檢測腸道主要菌群，與陰性對照組比較，建立菌群失調(diào)模型，然后進行后續(xù)實驗。

1.3.3 實驗動物分組及給藥

將上述菌群失調(diào)模型小鼠隨機分成4組，即LB組、FS組、CE組和自然恢復(fù)組，每組14只，雌雄各半。雙歧桿菌RH的3種受試物采取灌胃方式給藥，每天1次，每次0.2mL，連續(xù)14d，自然恢復(fù)組和上述陰性對照組繼續(xù)以生理鹽水灌胃，第15天進行6大類腸道主要菌群的測定。

1.3.4 小鼠腸道菌群的檢測

最后1次給予雙歧桿菌不同受試物24h后，無菌采取小鼠糞便0.1g于滅菌試管內(nèi)，10倍稀釋至10-8，選擇10-6～10-8四個稀釋度，分別傾注于1.1.3節(jié)6種選擇性培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后，對特征性菌落進行Gram染色鏡檢、接觸酶實驗、糖醇發(fā)酵實驗后計算出每克濕糞便中的菌數(shù)，然后取對數(shù)進行統(tǒng)計分析。

按中華人民共和國衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中的動物實驗調(diào)節(jié)腸道菌群功能的評價標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)給予受試物后小鼠腸道菌群值的變化進行評價[6]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素菌群失調(diào)小鼠模型的建立

抗生素處理正常小鼠后，抗生素模型組和正常陰性對照組小鼠的6大類腸道菌群的比較結(jié)果如表1所示。

從表1可知，模型組與陰性對照組相比，雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量顯著降低(P＜0.01)，產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸球菌極顯著增加(P＜0.01)，說明給小鼠連續(xù)3d腹腔注射鹽酸林克霉素能破壞腸道正常的菌群平衡，表明該抗生素菌群失調(diào)模型建立成功。

2.2 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道雙歧桿菌的影響

表1 抗生素模型組與陰性對照組小鼠的腸道菌群比較Table 1 Comparison of intestinal flora in antibiotic model group and normal control group?? lg(CFU/g)

圖1 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道雙歧桿菌的影響Fig.1 Effect of LB, CE and FS on intestinal Bifidobacteria in mice with imbalanced intestinal flora

從圖1可知，3種受試物灌胃小鼠后，與自然恢復(fù)組相比，均可極顯著提高雙歧桿菌的數(shù)量(P＜0.01)。FS組和LB組的效果最佳，兩者之間促進雙歧桿菌生長的效果無顯著性差異；但LB組和FS組與CE組間有顯著性差異(P＜0.05)。另外，3種受試物灌胃組與陰性對照組相比均顯著促進小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖(P＜

0.01)。說明抗生素破壞腸道菌群平衡后，灌胃雙歧桿菌的不同處理物均可顯著提高雙歧桿菌的增殖，使其恢復(fù)至高于正常小鼠的腸道雙歧桿菌數(shù)量的水平。

2.3 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道乳桿菌的影響

圖2 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道乳桿菌的影響Fig.2 Effect of LB, CE and FS on intestinal Lactobacillus in mice with imbalanced intestinal flora

從圖2可知，3種受試物灌胃小鼠后，與自然恢復(fù)組相比，均可極顯著提高乳桿菌的數(shù)量(P＜0.01)。3種受試物對乳桿菌的增殖效果彼此之間無顯著性差異。另外，3種處理組的乳桿菌數(shù)量與陰性對照組相比，均無顯著性差異(P＞0.05)。表明LB、CE和FS均可調(diào)整腸道菌群失調(diào)小鼠的乳桿菌數(shù)量，使其恢復(fù)至正常水平。

2.4 雙歧桿菌RH不同處理物對菌群失調(diào)小鼠腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的影響

圖3 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的影響Fig.3 Effect of LB, CE and FS on intestinal Clostridium perfringens in mice with imbalanced intestinal flora

從圖3可知，3種受試物灌胃小鼠后，均可降低腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量。與自然恢復(fù)組相比，除CE組無顯著性差異外，LB組和FS組均有顯著性差異(P＜0.05)。與陰性對照相比，LB組和FS組均有顯著性差異(P＜0.05)，而CE組的產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著高于陰性對照組(P＜0.05)。說明除CE外，LB和FS均可調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)小鼠的腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，使其降低至低于正常水平。

2.5 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道擬桿菌的影響

圖4 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道擬桿菌的影響Fig.4 Effect of LB, CE and FS on intestinal Bacteroide in mice with imbalanced intestinal flora

從圖4可知，3種受試物灌胃小鼠后，與自然恢復(fù)組相比，均可極顯著提高腸道擬桿菌的數(shù)量(P＜0.01)。其中，F(xiàn)S組與陰性對照組相比無顯著性差異。表明雙歧桿菌RH的LB、CE和FS均可使腸道菌群失調(diào)小鼠的擬桿菌數(shù)量恢復(fù)至正常水平。

2.6 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道腸球菌的影響

圖5 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道腸球菌的影響Fig.5 Effect of LB, CE and FS on intestinal Enterococcus in mice with imbalanced intestinal flora

從圖5可知，雙歧桿菌RH的3種受試物對小鼠灌胃后與自然恢復(fù)組相比，均可極顯著降低腸道腸球菌的數(shù)量(P＜0.01)，但彼此之間無差異顯著性。與陰性對照組相比，3組均無顯著性差異。表明腸道菌群失調(diào)小鼠的腸道腸球菌可以由雙歧桿菌RH的LB、CE和FS調(diào)節(jié)至正常水平。

2.7 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道腸桿菌的影響

圖6 雙歧桿菌RH不同處理物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道腸桿菌的影響Fig.6 Effect of LB, CE and FS on intestinal Enterobacteriaceae in mice with imbalanced intestinal flora

從圖6可知，3種受試物灌胃小鼠后與自然恢復(fù)組相比，均可極顯著提高腸道腸桿菌的數(shù)量(P＜0.01)，但3種處理組之間均無顯著性差異。3種處理組的腸桿菌數(shù)量略高于陰性對照組，但無顯著性差異。表明腸道菌群失調(diào)小鼠的腸桿菌也可被雙歧桿菌RH的LB、CE和FS調(diào)節(jié)至正常水平。

實驗同時還發(fā)現(xiàn)，自然恢復(fù)組與起初建立的抗生素模型組之間的雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量存在顯著性差異(P＜0.05)，說明抗生素致小鼠腸道菌群失調(diào)后，機體自身有一定的自我修復(fù)功能，但與雙歧桿菌3種處理組相比存在極顯著差異(P＜0.01)。

綜合雙歧桿菌RH 三種不同處理物灌胃腸道菌群失調(diào)小鼠后上述6大類微生物菌群的變化情況可以明顯看出，3種受試物均可極顯著提高小鼠腸道雙歧桿菌、乳桿菌的數(shù)量(P＜0.01)，極顯著提高腸道擬桿菌、腸桿菌數(shù)量(P＜0.01)，極顯著降低腸道腸球菌的數(shù)量(P＜0.01)；活菌和發(fā)酵上清液能顯著降低產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量(P＜0.05)。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中的評價標(biāo)準(zhǔn)，該雙歧桿菌RH的LB、CE和FS具有明顯的修復(fù)腸道菌群平衡的作用。

3 討 論

抗生素為人類征服感染發(fā)揮了巨大的作用，然而，臨床上存在抗生素濫用現(xiàn)象。近年來，抗生素廣泛使用以致腸道菌群失調(diào)甚至腸道菌群產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象日益嚴(yán)重?？股卦跉绮≡⑸锏耐瑫r也抑制了腸道正常菌群中的有益菌，破壞機體內(nèi)相對穩(wěn)定的生態(tài)屏障，導(dǎo)致腸道菌群的構(gòu)成、功能發(fā)生改變，影響機體的免疫力[7]。另外，由于抗生素的選擇作用，一些細(xì)菌通過突變產(chǎn)生了對抗生素的耐藥性，或者使原來的耐藥性細(xì)菌大量增殖，造成腸道菌群失調(diào)及抗生素的相關(guān)腸炎[1]。本實驗結(jié)果表明，大劑量使用抗生素破壞小鼠腸道菌群平衡后，補充雙歧桿菌RH的3種不同處理物，無論是活菌體、菌體破碎物還是發(fā)酵上清液均可起到促進體內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌大量增殖，抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長，同時使腸球菌數(shù)量降低，腸桿菌的數(shù)量升高，達到腸道菌群平衡，起到修復(fù)菌群失調(diào)的作用。由此可見，在使用抗生素治療疾病時，可食用雙歧桿菌及其培養(yǎng)物，防止抗生素引起的菌群失調(diào)，避免抗生素造成的不良后果，從而起到預(yù)防和治療疾病的作用。

據(jù)報道，飼喂含雙歧桿菌的微生態(tài)制劑可增加健康動物和人腸道中雙歧桿菌的數(shù)量，降低腸桿菌的數(shù)量，從而改善腸道菌群的組成和比例[8-9]。但外源雙歧桿菌對腸道菌群的調(diào)整機制還不清楚，可能是外源雙歧桿菌在腸道內(nèi)生長定植的結(jié)果[10-11]，也可能是外源攝入的雙歧桿菌造成了腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量增加的結(jié)果[12]。也有一些研究者推測可能是雙歧桿菌代謝過程中大量產(chǎn)生乙酸和乳酸，降低腸道的pH值及氧化還原電位值(Eh值)，改善局部微環(huán)境，增進腸道菌群失調(diào)的恢復(fù)[13]。本實驗證明雙歧桿菌RH的活菌、菌體破碎物和發(fā)酵上清液均能增加小鼠腸道雙歧桿菌、乳桿菌的數(shù)量而降低腸球菌的數(shù)量，說明雙歧桿菌對機體腸道菌群的調(diào)整可能是多種作用的結(jié)果。確切的調(diào)整腸道菌群平衡的機制還有待更深入研究。

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Restoration Capability of Bifidobacteria with Different Treatments on Imbalanced Flora in Intestine

SHANG Nan，LIU Li-sha，XU Ri-hua*，WU Rui-yun
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In order to explore the restoration capability of Bifidobacteria on imbalanced flora in intestine, live bacteria (LB),cell-free extract (CE) and fermentation supernatant (FS) of Bifidobacteria were used to treat the vancomycin-induced mice model with imbalanced flora by gastric gavage. The effects of three different treatments of Bifidobacteria on major species of intestinal flora were evaluated. Results showed that three different treatments could significantly increase the proliferation of Bifidobacteria and Lactobacillia (P ＜ 0.01) and decrease the amounts of Clostridium perfringens and Enterococcus (P ＜ 0.05 and P ＜0.01).Bacteroide and Enterobacteriaceae were increased to the normal level. Therefore, LB, CE and FS of Bifidobacterium RH could restore and modulate the intestinal microecological balance of mice.

Bifidobacterium；ntestinal flora；imbalance；restoration

Q936

A

1002-6630(2010)23-0300-05

2010-11-02

國家大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目(091001924)；國家“863”計劃項目(2008AA10Z324)

尚楠(1990—)，女，本科生，研究方向為益生菌與益生元的開發(fā)與利用。E-mail：echoppig@126.com

旭日花(1981—)，女，講師，博士，研究方向為食品微生物與發(fā)酵工程。E-mail：xurihua81@126.com