黑曲霉發(fā)酵豆粕制備抗氧化肽研究

秦衛(wèi)東，陳學(xué)紅，馬利華，呂 潔

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

黑曲霉發(fā)酵豆粕制備抗氧化肽研究

秦衛(wèi)東，陳學(xué)紅，馬利華，呂 潔

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

研究黑曲霉發(fā)酵豆粕制備大豆多肽的工藝條件及多肽的抗氧化性能，并考察多肽的分子質(zhì)量。結(jié)果表明：在接種量為2%、發(fā)酵液pH6.0、底物質(zhì)量濃度9g/100mL、發(fā)酵時(shí)間34h的條件下，所得發(fā)酵液中豆粕多肽的質(zhì)量濃度最高，為3.38mg/mL。經(jīng)凝膠層析分離后得到兩個(gè)組分的大豆多肽(組分I和組分II)。大豆多肽清除DPPH自由基和羥自由基活性及對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用與其質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且組分I優(yōu)于組分II。大豆多肽組分I和組分II的分子質(zhì)量分別為675.58D和1625.54D。

大豆多肽；黑曲霉；發(fā)酵；抗氧化

早在1980年，Yee 等[1]就報(bào)道了大豆蛋白水解產(chǎn)物具有抗氧化性，1991年P(guān)rokomy提出[2]，蛋白水解產(chǎn)物能降低自動(dòng)氧化速率和脂肪的過氧化物含量。目前，以蛋白質(zhì)特別是提取油脂后的油料粕為原料采用酶法水解是制備活性肽工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法。但是，酶法制備肽時(shí)往往會(huì)產(chǎn)生一些苦味肽，堿性蛋白酶水解物苦味最強(qiáng)，木瓜蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶水解物苦味較低[3]。利用微生物發(fā)酵制備多肽的方法引起了許多研究人員的興趣。萬琦等[4-5]研究了大豆多肽生產(chǎn)菌株的篩選，得到了一株能在發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌，并研究了其發(fā)酵大豆多肽的條件優(yōu)化。邵偉等[6]報(bào)道了以豆粕粉為原料添加枯草桿菌將大豆蛋白水解為大豆多肽。陳學(xué)紅等[7]以芝麻粕為原料接種枯草芽孢桿菌發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間為 48h 所得發(fā)酵液中芝麻多肽的質(zhì)量濃度達(dá)到 3.585mg/mL。李理等[8]用毛霉發(fā)酵大豆蛋白制備多肽，經(jīng) 24～30h發(fā)酵水解度達(dá)到25%～30%，多肽得率高達(dá)75%。本實(shí)驗(yàn)以黑曲霉(Aspergillus niger)為菌種，研究制備大豆多肽的工藝條件，同時(shí)測定多肽的抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕由新沂明帝食品有限公司提供。

黑曲霉(Aspergillus niger)由本院食品與生物工程實(shí)驗(yàn)中心提供。

1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH) 美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白(Mw67000D)、溶菌酶(Mw14400D)、短菌肽(Mw1422.7D)、L-精氨酸(Mw174.2D) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 豆粕多肽發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 接種量的影響

準(zhǔn)確稱取5份5.00g豆粕置于250mL三角瓶中，再稱取5份0.50g蔗糖分別加入上述三角瓶中，再各加蒸餾水100mL，調(diào)節(jié)發(fā)酵液培養(yǎng)基pH7.0，滅菌。向滅菌的發(fā)酵液中分別加入1、2、3、4、5mL(3.2×107CFU/mL)菌液，29℃、120r/min培養(yǎng)32h后將這些發(fā)酵液離心，上清液在80℃的水浴中滅活10min，測此發(fā)酵上清液的多肽含量。

1.2.1.2 pH值的影響

準(zhǔn)確稱取5份5.00g豆粕置于250mL三角瓶中，再稱取5份0.50g蔗糖分別加入上述三角瓶中，再各加蒸餾水100mL。調(diào)節(jié)發(fā)酵液培養(yǎng)基pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，滅菌。向滅過菌的發(fā)酵液加3.2×107CFU/mL菌液3mL， 29℃、150r/min培養(yǎng)32h。取出發(fā)酵液離心，上清液在80℃的水浴中滅活10min，測此發(fā)酵上清液的多肽含量。

1.2.1.3 豆粕質(zhì)量濃度的影響

分別稱取3.0、5.0、7.0、9.0、11.0g 豆粕于250mL三角瓶中，再稱取5份0.50g蔗糖分別加入上述三角瓶中，各加蒸餾水100mL制備成底物質(zhì)量濃度分別為3、5、7、9、11g/100mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，向滅過菌的發(fā)酵液中加 3.2×107CFU/mL菌液3mL， 29℃、150r/min培養(yǎng)32h。取出發(fā)酵液離心，上清液在80℃的水浴中滅活10min，測此發(fā)酵上清液的多肽含量。

1.2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

準(zhǔn)確稱取5份5.0g豆粕置于250mL三角瓶中，再稱取5份0.50g蔗糖分別加入上述三角瓶中，各加蒸餾水100mL，調(diào)節(jié)發(fā)酵液培養(yǎng)基pH值為7.0，滅菌。向滅完菌的發(fā)酵液中加入2.4×107CFU/mL菌液3mL，在29℃、150r/min條件下分別考察發(fā)酵時(shí)間為28、30、32、34、36h時(shí)發(fā)酵液中多肽含量，到發(fā)酵時(shí)間后，分別取出發(fā)酵液離心，上清液在80℃的水浴中滅活10min，測此發(fā)酵上清液的多肽含量。

1.2.1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以接種量、pH值、豆粕質(zhì)量濃度、發(fā)酵時(shí)間作四因素三水平的正交試驗(yàn)。

1.2.2 多肽含量的測定

參照魯偉等[9]的方法，多肽含量以酸可溶性多肽計(jì)，將等體積的10%三氯乙酸加入到豆粕多肽混合液中，4000r/min離心 15min，去除酸不溶性的蛋白和長鏈肽沉淀。向上清液中分別加入3mL待測多肽液。再加入2mL雙縮脲試劑，充分混勻，靜置片刻，以蒸餾水為空白，用可見分光光度計(jì)于540nm波長處測各管吸光度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算處理液中的肽含量。

1.2.3 Sephadex G-15凝膠層析法分離大豆多肽

取150mL G-15膠，用漏斗慢慢裝入90cm層析柱中，并用蒸餾水保持濕潤，保持上面水平，同時(shí)開動(dòng)真空泵，把膠抽實(shí)。當(dāng)蒸餾水下降到與膠液面相切的時(shí)候，加入樣品，進(jìn)行檢測。上樣量為0.5mL，用蒸餾水作洗脫劑，流速為15mL/min。在出現(xiàn)波峰時(shí)收集各個(gè)組分，經(jīng)過多次分離收集樣品。

1.2.4 蛋白肽分子質(zhì)量測定

SDS-PAGE電泳法。電泳條件：加樣量20μL、電流為32mA、電泳時(shí)間2h。采用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色法測定電泳遷移率。以不同分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的分子質(zhì)量對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。根據(jù)未知樣品的遷移率用回歸方程計(jì)算其分子質(zhì)量。

1.2.5 多肽抗氧化活性的測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除活性

按照Brand-Williams等[10]的方法測定DPPH自由基清除活性。將100μ L大豆多肽溶液與400μ L 100mmol/L Tris-HCl (pH7.4) 和500 μ L 新制備的 80mmol/L DPPH 乙醇溶液混合，暗處放置20min后測定波長517nm處的吸光度(A1)。以蒸餾水為對照(A2)。由式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.2.5.2 羥自由基清除活性

根據(jù)Zhang等[11]的方法測定。

1.2.5.3 脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用

根據(jù)Pena-Ramos等[12]的方法稍作改進(jìn)。用pH7.4、0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)配制0.04mg/mL的卵磷脂懸濁液，取卵磷脂懸濁液0.2mL，分別加入不同質(zhì)量濃度的大豆多肽溶液、0.2mL 25mmo1/L FeSO4·7H2O溶液，用上述PBS補(bǔ)足至2mL，在37℃水浴振蕩15min取出后，加入20%三氯乙酸0.5mL，靜置10min，于3500r/min離心10min，取上清液2mL，分別加入0.8%硫代巴比妥酸(TBA)1mL，混勻，置100℃水浴15min，取出冷卻，以分光光度計(jì)測定其在波長532nm處的吸光度A1。以不加大豆多肽溶液為對照，其吸光度記為A0。則樣品對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制率可表示為：

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕多肽的制備

2.1.1 接種量對提取多肽的影響

圖1 接種量對多肽產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on the yield of soybean peptide

從圖1可見，隨著接種量的增加，多肽的產(chǎn)量在一定范圍內(nèi)是上升的。當(dāng)接種量為2%時(shí)，多肽的產(chǎn)量最大，為2.69mg/mL。此后，隨著接種量增加，多肽產(chǎn)量下降。因此，黑曲霉在此發(fā)酵過程中接種量以2%為最佳。

2.1.2 pH值對提取多肽的影響

圖2 pH值對多肽產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of pH on the yield of soybean peptide

由圖2可知，隨著pH值的增大多肽產(chǎn)量也隨之增大，但當(dāng)?shù)竭_(dá)pH7.0時(shí)，多肽的產(chǎn)量達(dá)最大值2.93mg/mL。但當(dāng)pH值繼續(xù)增大時(shí)，多肽的產(chǎn)量隨之下降。這是由黑曲霉產(chǎn)蛋白酶性能決定的。羅躍中等[13]指出，培養(yǎng)基初始pH 值對酶的合成有重大影響，在培養(yǎng)基初始pH7，即接近于中性時(shí)最為理想。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致，即pH7.0時(shí)多肽產(chǎn)量最高，pH值增大后則不利于蛋白酶的合成，分解蛋白質(zhì)的能力降低，多肽產(chǎn)量下降。

2.1.3 底物質(zhì)量濃度對提取多肽的影響

圖3 底物質(zhì)量濃度對多肽產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of soybean peptide

從圖3可以看到，隨著底物質(zhì)量濃度的增大多肽產(chǎn)量也隨之增大，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為9g/100mL時(shí)，多肽的產(chǎn)量達(dá)最大值2.94mg/mL。底物質(zhì)量濃度過高，多肽的產(chǎn)量反而下降。這可能是由于大豆粕含豐富的蛋白質(zhì)，當(dāng)其質(zhì)量濃度過高時(shí)會(huì)造成氮源過多的環(huán)境，使菌體生長過于旺盛，容易導(dǎo)致溶氧不足，不利于水解酶類的積累，從而導(dǎo)致多肽質(zhì)量濃度下降。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對提取多肽的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對多肽產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the yield of soybean peptide

從圖4可以看到，隨著時(shí)間的延長，多肽產(chǎn)量在一定范圍內(nèi)上升，在32h達(dá)到最大值3.00mg/mL，但此后多肽的產(chǎn)量隨著時(shí)間延長而降低。這可能是因?yàn)槔^續(xù)發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生一些能夠降解肽的酶類，從而導(dǎo)致多肽產(chǎn)量降低。因此，黑曲霉在此發(fā)酵過程中最佳發(fā)酵時(shí)間為32h。

2.1.5 正交試驗(yàn)工藝優(yōu)化

由表1可以看到，因素主次順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞接種量＞底物質(zhì)量濃度＞起始p H值，理論最佳組合為A1B2C3D3，即發(fā)酵時(shí)間34h、底物質(zhì)量濃度9g/100mL、接種量2%、pH6.0，與試驗(yàn)最佳組合A1B3C3D3有差異，以此理論最佳組合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，得到多肽質(zhì)量濃度為3.38mg/mL。故A1B2C3D3為最佳組合。

表1 正交試驗(yàn)工藝優(yōu)化結(jié)果Table 1 Results of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions of soybean meal

將上述條件下得到的3000mL大豆多肽發(fā)酵液在4000r/min離心15min，取上清液，在0.08MPa、料液溫度為室溫、膜面積為0.1m2、膜截留分子質(zhì)量為5kD的條件下，對豆粕多肽提取液進(jìn)行超濾純化。收集所得樣品2500mL，測得其多肽含量為3.75mg/mL。

2.2 Sephadex G-15凝膠層析法分離豆粕多肽

圖5 豆粕多肽Sephadex G-15凝膠層析結(jié)果Fig.5 Sephadex G-15 gel permeation chromatographic separation of soybean peptides

如圖5所示，多肽液經(jīng)過層析柱分離后得到兩種主要成分，在0.4～0.5h之間出現(xiàn)第一個(gè)峰(組分I)，在0.7～0.8h之間出現(xiàn)第二個(gè)峰(組分II)。多次分離收集組分I和組分II，分別濃縮備用。

2.3 豆粕多肽的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性

圖6 豆粕多肽清除DPPH自由基活性Fig.6 Concentration-dependent scavenging activity of soybean peptides on DPPH free radicals

兩個(gè)豆粕多肽組分清除DPPH自由基活性與其質(zhì)量均呈良好的線性關(guān)系，擬合方程分別為：

I1/%=225.13x+25.476 (R2=0.9284)和I2/%=221.97x+21.805 (R2=0.9896)，且組分I對清除DPPH自由基活性強(qiáng)于組分II。

2.3.2 羥自由基的清除活性

圖7 豆粕多肽清除羥自由基的活性Fig.7 Concentration-dependent scavenging activity of soybean peptides on hydroxyl free radicals

兩個(gè)豆粕多肽組分清除羥自由基活性與其質(zhì)量均呈良好的線性關(guān)系，擬合方程分別為：

I1/%=209.87x+14.162(R2=0.9873)和I2/%=211x+11.328(R2=0.9679)，且組分I清除羥自由基活性強(qiáng)于組分II。

2.3.3 脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用

圖8 豆粕多肽對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用Fig.8 Concentration-dependent inhibitory effect of soybean peptides on lipid peroxidation

兩個(gè)豆粕多肽組分對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制與其質(zhì)量均呈良好的線性關(guān)系，擬合方程分別為：

I1/%=277.9x+18.245(R2=0.9506)和I2/%=213.33x+22.67(R2=0.9729)，且組分I對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制能力強(qiáng)于組分II。

2.4 豆粕多肽的分子質(zhì)量

圖9 豆粕多肽SDS-PAGE電泳圖Fig.9 SDS-PAGE electrophoresis of soybean peptides

豆粕多肽SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖9所示。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)，相對遷移距離(相對遷移距離=蛋白質(zhì)分子遷移距離/染料遷移距離)為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)回歸計(jì)算得回歸方程為：y=－1.2705x+4.9897(R2=0.9902)。由此，得到豆粕多肽組分I和組分II的分子質(zhì)量分別為675. 58D和1625.54D。Chen等[14-16]提出具有抗氧化性多肽片段應(yīng)由5～16個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量在600～1700D之間。何榮等[17]在研究菜籽肽清除自由基能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量越小的菜籽肽對DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)。余勃[18]在研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)36h發(fā)酵主要得到分子質(zhì)量在300～1000D范圍內(nèi)的短肽。龐宗文等[19]用毛霉發(fā)酵豆粕后所產(chǎn)大豆肽分子質(zhì)量主要集中在10 kD 以下。本研究得到的兩個(gè)主要組分的分子質(zhì)量在670～1630D之間，且分子質(zhì)量較小的組分I的抗氧化能力強(qiáng)于分子質(zhì)量較大的組分II，這些結(jié)果與上述報(bào)道基本一致。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以脫脂豆粕為原料，采用黑曲霉發(fā)酵制備抗氧化肽。正交試驗(yàn)法確定的最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間34h、底物質(zhì)量濃度9g/100mL、接種量2%、pH 6.0，得到的多肽質(zhì)量濃度為3.38mg/mL。該最適條件下制備的大豆多肽發(fā)酵液經(jīng)離心、超濾純化后用Sephadex G-15凝膠層析分離，得到兩個(gè)主要多肽組分，兩個(gè)多肽組分的分子質(zhì)量分別為675.58D和1625.54D。

以清除DPPH自由基和羥自由基活性及對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用等方法測定黑曲霉發(fā)酵大豆多肽的抗氧化活性。結(jié)果表明：大豆多肽的3種抗氧化活性與其質(zhì)量均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且組分I優(yōu)于組分II。

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Preparation of Antioxidant Peptides from Soybean Meal by Aspergillus niger Fermentation

QIN Wei-dong，CHEN Xue-hong，MA Li-hua，Jie
(School of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

The optimal processing conditions and antioxidant activity of soybean peptides prepared by Aspergillus niger fermentation were investigated and the molecular weights of soybean peptides were determined. The highest concentration of soybean peptides in the fermentation broth, 3.38 mg/mL, was achieved under the optimal preparation conditions, which were the inoculation amount of 2%, fermentation pH of 6.0, substrate concentration of 9 g/100 mL and fermentation time of 34 h.Fractions I and II were obtained from the fermentation supernatant of soybean meal through Sephadex G-15 gel permeation chromatographic separation. Both of them exhibited DPPH and hydroxyl free radical scavenging activities and inhibitory effect on lipid peroxidation, which were all linearly dependent on concentration, and fraction I was superior to fraction II. Moreover,it was found that the molecular weights of fractions I and II were 675.58D and 1625.54 D, respectively.

soybean peptide；Aspergillus niger；fermentation；antioxidation

TQ922.9

A

1002-6630(2010)23-0289-05

2010-09-15

徐州市科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(XJ08057)

秦衛(wèi)東(1961—)，男，教授，本科，研究方向?yàn)槭称坊钚猿煞旨肮δ苄?。E-mail：wdqin@xzit.edu.cn