新疆天山北部地區(qū)加工番茄上ToMV和CMV的動態(tài)分析

趙祥樹,向本春,劉升學(xué),都業(yè)娟

(石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室,石河子832003)

新疆天山北部地區(qū)加工番茄上ToMV和CMV的動態(tài)分析

趙祥樹,向本春,劉升學(xué),都業(yè)娟

(石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室,石河子832003)

為研究加工番茄上 ToMV和CMV消長動態(tài),采用RT-PCR方法對新疆天山北部6個地區(qū)采集的加工番茄樣品進行了分子檢測。結(jié)果表明:不同地區(qū)的138份加工番茄樣品中,石河子、奎屯、烏蘇的樣品在存在CMV和ToMV,并以CMV為主,ToMV次之;從石河子蔬菜研究所,按不同品種不同時間采集的加工番茄660份樣品中,CMV的檢出率為21.5%,ToMV的檢出率為12.1%,2種病毒的復(fù)合檢出率為8.9%,病毒的檢出率明顯低于往年;CMV和 ToMV分別在6月25和7月11日左右開始發(fā)生,CMV比 ToMV早發(fā)生10-15 d。2種病毒的發(fā)生高峰期都在8月中下旬,復(fù)合侵染發(fā)病期在7月下旬;品種間2種病毒的消長動態(tài)沒有明顯的差異。

檢測;RT-PCR;黃瓜花葉病毒;番茄花葉病毒;消長動態(tài)

Abstract:The population dynamics of the processing tomato samples collected from six regions in the north of Tianshan mountains were detected by RT-PCR.Among 138 processing tomato samples collected from different regions,CMV and ToMV were detected in Shihezi,Kuitun and Wusu.Among 660 processing tomato samples collected from different varieties and different periods in the Shihezi Vegetable Institute,the incidences of CMV and ToMV were 21.5%and 12.1%respectively,and the mixed infection was 8.9%.The beginning occurrence of CMV and ToMV appears in June 25 and July 11 respectively.The occurrence of CMV is 10-15 days earlier than that of ToMV.The peak period of ToMV and CMV were all in middle and late August,and the mixed infection was at the end of July.There was no obvious difference for the dynamics of ToMV and CMV among varieties.

Key words:detection;RT-PCR;tomato mosaic virus;cucumber mosaic virus;population dynamics

在我國引起番茄病毒病害的病原主要有煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、馬鈴薯 X病毒(Potato virus X,PVX)和馬鈴薯 Y病毒(Potato virus Y,PV Y)等[1-2],而危害新疆加工番茄的主要病原是 TMV、CMV和番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)等[3-4]。

T oMV寄主范圍很廣,能侵染茄科、十字花科等許多種植物,其中茄科的番茄是其最主要的寄主。受侵染作物產(chǎn)生花葉、植株矮化等癥狀,有時甚至植株死亡,嚴重影響了作物(尤其是番茄)的產(chǎn)量和品質(zhì),T oMV發(fā)生嚴重的作物能減產(chǎn)20%以上[5],T oMV在茄科作物中發(fā)生較普遍,其中侵染番茄的煙草花葉病毒屬病毒中 T oMV占絕大多數(shù)[6]。CMV最早由Doolittle[7]和Jagger[8]于1916年報道,現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)危害蔬菜最嚴重的5種病毒之一,常使許多重要經(jīng)濟和觀賞植物表現(xiàn)出蕨葉、叢枝、壞死等癥狀,是禾谷類、蔬菜、果樹等植物的重要病原。

近年來,新疆加工番茄上檢測出 ToMV[4],并且常與CMV復(fù)合侵染引起加工番茄條斑壞死病毒病。該病毒病在新疆為害明顯上升,并有逐年加重趨勢,嚴重影響了加工番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量,造成較大的經(jīng)濟損失。

以往對加工番茄病毒病的檢測,是在發(fā)病高峰期集中一次進行。然而尚不清楚CMV和 ToMV在加工番茄生長發(fā)育期的發(fā)生消長動態(tài),為此本研究于2009年利用RT-PCR法并結(jié)合歷年資料對新疆天山北部地區(qū)加工番茄上的CMV和 ToMV的消長動態(tài)進行了研究,以明確CMV和 ToMV的消長動態(tài),以期為今后加工番茄的抗病育種和制定防治措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集

1)不同地點采集樣品:2009年6-9月,從石河子蔬菜研究所、石河子152團、瑪納斯縣、昌吉三坪農(nóng)場等6個地點田間自然發(fā)病及疑似病毒癥狀的加工番茄植株上采集138份樣品。

2)不同時間不同品種采集樣品:在石河子蔬菜研究所,從2009年6月1號開始,每隔10 d采集不同品種樣品,每次每個品種采集10個樣品,共660份樣品。

1.1.2 實驗試劑及質(zhì)粒

實驗試劑:TaqDNA聚合酶購自Promega公司、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自 TaKaRa公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。含CMV和 T oMV外殼蛋白基因(CP)的質(zhì)粒由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院都業(yè)娟老師提供。

1.1.3 特異性引物

根據(jù)已報道的CMV和T oMV的外殼蛋白(CP)基因序列設(shè)計引物[4,9],其由上海生工合成(表1)。

表1 擴增CMV和 ToMV外殼蛋白(CP)基因特異片段的引物Tab.1 Primers for amplifying segments of the coat protein gene of CMV and ToMV

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

總RNA的提取參照改良的LiCl方法[3]進行。

1.2.2 cDNA的合成

cDNA反轉(zhuǎn)錄在25μL體積中進行,取加工番茄組織總RNA 5μL、R9隨機引物2μL、加無RNA酶的去離子水11μL、再依次加入以下試劑:1μL 10 mmol/L dNTP、4μL 5×第一鏈合成緩沖液、1μL Rnasin inhibitor(23 U/μL)、1μL M-MLV(200 U/μL)反轉(zhuǎn)錄酶。將以上試劑混勻后在25℃反應(yīng)10 min,42℃延伸60 min,99℃5 min滅活M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)結(jié)束后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于4℃或-20℃條件下,備用。

1.2.3 PCR擴增

PCR反應(yīng)在25μL體積中進行。體系為:2μL 10×反應(yīng)緩沖液1μL dNTP(10 mmol/L)、1μL 3′端引物(5 mmol/L)、1μL 5′端引物(5 mmol/L)、2μL cDNA 模板、1μL Taq DNA 聚合酶 (2 U/μL)、17μL ddH2O,混勻后于擴增儀上完成PCR反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物保存于4℃或-20℃?zhèn)溆?。CMV的擴增程序為:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s;53℃退火45 s;72℃延伸1 min,30個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10 min。T oMV的擴增程序為:94℃預(yù)變性4 min,94℃變性45 s;52℃退火45 s;72℃延伸45 s,30個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10 min。取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,紫外燈下進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地點CMV和ToMV的發(fā)生動態(tài)

針對 CMV 和 ToMV,用引物 C1/C2、To1/To2對在天山北部不同地點采集的138份加工番茄樣品進行RT-PCR檢測,并以CMV和 ToMV質(zhì)粒的擴增產(chǎn)物作陽性對照,以加工番茄健康組織的擴增產(chǎn)物作陰性對照(圖1、圖2僅為所有樣品RT-PCR檢測的代表圖)。結(jié)果表明:在石河子、奎屯、烏蘇檢測出CMV和 ToMV,其擴增產(chǎn)物分別為735 bp和689 bp的條帶,均與陽性對照一致,但在陰性對照中未得到任何擴增產(chǎn)物,而在瑪納斯、昌吉、阜康的樣品中未檢測出CMV和 ToMV(表2)。

圖1 CMV CP基因的RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 The RT-PCR analysis of the CMV CP gene

圖2 ToMV CP基因的RT-PCR擴增結(jié)果Fig.2 The RT-PCR analysis of the TOMV CP gene

表2 不同地點CMV和ToMV的RT-PCR檢測結(jié)果Tab.2 The results of CMV and ToMV were detectedby RT-PCR in the different regions

2.2 不同品種CMV和ToMV的發(fā)生狀況

對石河子蔬菜研究所6個加工番茄品種的660份樣品進行RT-PCR檢測,結(jié)果表明:ToMV的單獨侵染率較低,這主要與CMV復(fù)合侵染引起加工番茄條斑壞死有關(guān)。品種間2種病毒的檢出率有一定差距,約50%,即 ToMV的發(fā)生率小于 CMV的發(fā)生率,CMV的檢出率為21.5%,ToMV的檢出率為12.1%,2種病毒的復(fù)合檢出率為8.9%,但CMV和 ToMV在品種間的發(fā)生沒有明顯差異(表3)。

表3 不同品種CMV和ToMV的RT-PCR檢測結(jié)果Tab.3 The results of CMV and ToMV were detected by RT-PCRfor the different varieties

2.3 不同時間CMV和ToMV的消長變化

對在石河子蔬菜研究所不同時間采集的660份加工番茄樣品進行RT-PCR檢測,結(jié)果表明:CMV比ToMV早發(fā)生10-15 d,CMV發(fā)生在6月25日左右,ToMV發(fā)生在7月11日左右。CMV的發(fā)生高峰期出現(xiàn)在7月下旬-8月下旬,ToMV的發(fā)生高峰期出現(xiàn)在8月中下旬,復(fù)合侵染發(fā)病期在7月下旬(表 4)。

表4 不同時間CMV和ToMV的檢出率(%)Tab.4 The incidence of CMV and ToMV were in the different periods

2.4 不同年份CMV和ToMV的消長變化

根據(jù)資料(表 5)可以看出,2009年 CMV和T oMV的發(fā)生明顯比2007和2008年低,與2006年比較接近,因此,初步認為與每年5-6月份的溫度和雨量大小有一定關(guān)系。2009年6月份溫度比往年同期低2℃左右,而雨量比往年同期多18～28 mm,而且2009年6-8月份溫度均低于往年同期溫度(表6)。

表5 不同年份CMV和ToMV的消長變化Tab.5 The population dynamics of CMV and ToMV were from different years

表6 不同年份石河子地區(qū)氣象資料Tab.6 The meteorological data of Shihezi were from different years

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明,2009年新疆天山北部地區(qū)加工番茄病毒主要以CMV為主,ToMV次之,但2種病毒的發(fā)生明顯低于往年。ToMV的單獨侵染率較低,這主要是與CMV復(fù)合侵染引起加工番茄條斑壞死有關(guān)。CMV和 ToMV分別在6月25和7月11日左右開始發(fā)生,CMV比 ToMV早發(fā)生10-15 d。CMV的發(fā)生高峰期出現(xiàn)在7月下旬-8月下旬,ToMV的發(fā)生高峰期出現(xiàn)在8月中下旬,復(fù)合侵染發(fā)病期在7月下旬。

本研究檢測的結(jié)果表明,2009年新疆加工番茄上CMV和 ToMV的發(fā)生明顯低于往年,而 ToMV的發(fā)生低于CMV,同時又低于菜用番茄上病毒的發(fā)生。初步認為,一方面與加工番茄栽培方式的改變有關(guān),另一方面與當(dāng)年溫度雨量的變化有關(guān)。新疆加工番茄病毒病害的發(fā)生嚴重程度與栽培措施有一定的關(guān)系,溝灌地比滴灌地發(fā)病重;移栽田發(fā)病重于直播田[12],而新疆加工番茄大多采用膜下滴灌栽培方式,并且加工番茄生長過程中打叉、抹芽等的田間操作很少,從而降低了接觸傳染的機率,進而大大減少了ToMV的發(fā)生。CMV在多年生宿根植物或雜草上越冬,主要通過蚜蟲傳毒,在蚜蟲大發(fā)生的年份,病毒病害尤其嚴重。2009年5-6月份該地區(qū)雨水多溫度偏低,與往年同期有較大差異,這不利于蚜蟲等傳播介體的遷飛,從而降低了CMV的發(fā)生程度。

[1]馮蘭香,蔡少華,鄭貴彬,等.我國番茄病毒病的主要毒原種類和番茄上煙草花葉病毒株系的鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1987,20(3):60-66.

[2]馮蘭香,田如燕,楊翠榮,等.中國北方番茄主要病毒種類普查及 TMV、CMV株系鑒定[J].植物保護學(xué)報,1996,23(1):52-55.

[3]常波,向本春,劉升學(xué),等.加工番茄條斑壞死病原黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因的克隆和序列分析[J].石河子大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2006,24(4):410-414.

[4]姜玉霞,向本春,安仙麗,等.新疆加工番茄上番茄花葉病毒的分子鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,45(3):484-489.

[5]Broadbent L.Epidemiology and control of tomato mosaic virus[J].Annu Rev Phytopathol,1976,14:75-96.

[6]Van Regenmortel M H V,Fraenkel Conrat H.The plant viruses[M].NewYork,London:Plenum Press,1986.

[7]Doolitlle S P.Anew infectiousmosaic disease of cucumber[J].Phytopathol,1918,6:145-147.

[8]Jagger I C.Experiments with the cucumber mosaic disease of cucumber[J].Phytopathol,1916,6:145-151.

[9]宋婷婷,陳榮溢.應(yīng)用多重 RT-PCR檢測煙草上的TMV和CMV[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(1):53-54.

[10]張新宇.新疆加工番茄病毒種類鑒定和分離物XJl087的株系鑒定[D].石河子:石河子大學(xué),2007.

[11]許文博,都業(yè)娟,黃家風(fēng).加工番茄CMV與 ToMV的ELISA檢測及其相關(guān)性分析[J].石河子大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2009,27(2):199-201.

[12]張新宇,向本春,黃家風(fēng),等.新疆加工番茄病毒病害的調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(18):5477-5478.

Population Dynamics of T omato Mosaic Virus and Cucumber Mosaic Virus of Processing T omato in the North of Tianshan Mountains in Xinjiang

ZHAO Xiangshu,XIANG Benchun,LIU Shengxue,DU Yejuan
(Key Laboratory of Oasis Crop Diseases Control,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S436.412.19

A

1007-7383(2010)05-0561-04

2009-12-11

國家科技合作與交流項目(20072072)

趙祥樹(1984-),男,碩士生,專業(yè)方向為植物病理學(xué);e-mail:zhaoxiangshu@stu.shzu.edu.cn。

向本春(1958-),男,教授,博士生導(dǎo)師,從事植物病毒及病害防治方面研究;e-mail:xbc@shzu.edu.cn。