棉花9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因在干旱條件下的表達分析

劉江娜,鄧曉艷,李志博,劉菲菲,章杰,郗忠玲,魏亦農(nóng)

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室,石河子 832003)

棉花9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因在干旱條件下的表達分析

劉江娜,鄧曉艷,李志博,劉菲菲,章杰,郗忠玲,魏亦農(nóng)

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室,石河子 832003)

為了了解棉花幼苗9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)基因在干旱脅迫下的生物學(xué)功能,采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(semi RT-PCR)法檢測在干旱脅迫下棉花 GhNCED基因表達量的變化。結(jié)果表明:隨著PEG6000介導(dǎo)的水分脅迫時間的推移,該基因的表達量逐漸上升,6 h時達到最強,隨后又逐漸下降,到24 h時表達量降到最低。而在棉花不同的組織器官中,6 h時水分脅迫能顯著促進棉花葉和莖中NCED基因的表達,根部GhNCED基因表達變化較小。

棉花;NCED;半定量RT-PCR;水分脅迫

Abstract:In order to study the biologic function of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase(NCED)gene under water-stress in cotton,a semi RT-PCR system was established to detect the gene expression of NCED in dehydrated cotton.The result showed that the expression level of the gene in leaves was gradually increased with the water-stressed accumulation,and it reached the highest level at the time point of 6 hours after PEG6000 and treatment and then it was gradually decreased to the lowest level after 24 hours'water stress.In different organs of cotton,the expression of GhNCED gene can be obviously induced at 6 hours after water stress treatment in stems and leaves,but the expression level of the gene in root was not obvious.

Key words:cotton;NCED;semi RT-PCR;dehydration

脫落酸(abscisic acid,ABA)在植物抗逆境脅迫反應(yīng)中起著廣泛而重要的作用[1],干旱、高鹽和低溫脅迫均能引起植物內(nèi)源 ABA水平的提高[2-3]。ABA生物合成酶中9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)催化的氧化裂解反應(yīng)是ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵步驟[4]。NCED基因最初是在玉米(Zea mays)的ABA缺失突變體 viviParousj4(vPj4)中克隆得到[5],其可以特異地氧化裂解9-順式紫黃質(zhì)和9-順式新黃質(zhì)而產(chǎn)生黃質(zhì)醛,而并不催化其它種類的類胡蘿卜素氧化裂解。隨后在擬南芥[6]、番茄[7]、豇豆[8]、鱷梨[9]、菜豆[10]、柑橘[11]等植物中均克隆到了NCED基因。對不同植物中的NCED基因分析表明,這類基因是一個多基因家族,在植物界中普遍存在并高度保守;在結(jié)構(gòu)上無內(nèi)含子,氨基酸序列的N-端有典型的葉綠體靶向轉(zhuǎn)運肽,而 C-端高度同源,并且有4個保守的組氨酸結(jié)構(gòu)。

棉花種植區(qū)多分布在干旱、半干旱地區(qū),因此干旱是影響棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量的主要制約因素之一。而近年來,抗蟲棉的推廣及應(yīng)用、棉花抗黃、枯萎病的基因工程研究大大降低了生物脅迫對棉花品質(zhì)所造成的不良影響[12],而非生物脅迫下抗逆分子機制研究及基因工程的研究也在不斷深入。因此,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),研究棉花抗逆分子機制,并利用基因工程技術(shù)分離出與棉花抗旱品質(zhì)緊密相關(guān)的基因則顯得十分重要。

目前,尚未見到棉花NCED基因的相關(guān)報道,水分脅迫下棉花體內(nèi)NCED基因的表達模式及功能尚不明晰。本研究利用PCR方法結(jié)合cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)擴增棉花NCED基因的同源片段以及3′末端,并利用半定量RT-PCR的方法分析其在棉花受到水分脅迫時的表達特性,以期為進一步探討 GhNCED基因作為新的棉花抗旱基因資源的可行性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以抗旱品種晉13為實驗材料,用 Hogland營養(yǎng)液培養(yǎng)棉花至第3片真葉展開,20%的PEG6000處理棉花幼苗,用于提取棉花總RNA。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

取1 g左右的棉花新鮮幼嫩葉片組織,利用改良的CTAB/酸酚法[13-14]提取棉花組織總RNA,用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性,用紫外分光光度計測定OD260與OD280,確定總 RNA的濃度和純度。

1.2.2 棉花GhNCED基因主體片段的克隆

以棉花總RNA為模板,參照M-MLV的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(invotrogen公司)說明書的方法合成cDNA第一條鏈作為反應(yīng)模板,以LJ1:5′-CGACGGMGACGGNATGGTBCACGC-3′和LJ2:5′-NNCTCYTCCCAM GCRTTC-3′(由上海生工公司合成)為引物,進行PCR擴增?；驍U增采用PCR反應(yīng)體系[15](10μL):TaqDNA 聚合酶(天根公司 2.5 U/μL)0.2μL、10×buffer 1μL、dNTP(10 mmol/L)0.2μL、LJ1(10 μmol/L)0.2μL、LJ2(10μmol/L)0.2μL、反轉(zhuǎn)錄第一條cDNA 0.4μL、ddH2O 7.8μL,總反映體系為10μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃3 min,94 ℃1 min、55℃1 min、72℃1 min,35個循環(huán),72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用DNA凝膠回收試劑盒(天根公司)回收,克隆至pGEM-T easy載體(Promega公司),用 T7通用引物測序(上海生工公司)。

1.2.3 棉花 GhNCED基因3′端的克隆

逆轉(zhuǎn)錄:在微量離心管中加入棉花葉片RNA 2 μL 、3′-CDSprimer 1μL,用 RNAase Free ddH2O 定容至5μL混樣之后迅速離心一下,70℃水浴2 min,迅速冰浴2 min,稍稍離心,使樣品沉于管底,再依次加入5×First-strand buffer 2μL,DTT(20 mmol)1μL,dN TP Mix(10 mmol/L)1μL,MMLV Reverse Transcriptase 1μL,將混樣反復(fù)抽提混勻幾次后稍加離心,42℃溫浴1.5 h,72℃滅活7 min,-20℃保存待用。

3′Outer PCR反應(yīng):取上步RT產(chǎn)物0.5μL,10×Buffer 1μL,LJ3:5′-GCCACTCAGGGATTGCCAGACTCTTACT-3′(10μmol/L)0.2μL,UPM(10μmol/L)1μL,dN TP(10mmol/L)0.2μL,Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.2μL,ddH2O 6.9μL,反應(yīng)條件為94℃30 s,72℃3 min,5個循環(huán);94℃30 s,70℃30 s,5個循環(huán);94℃30 s,68℃3 min,72℃3 min 25個循環(huán)。

3′Inner PCR反應(yīng):取第1輪產(chǎn)物1μL用 EDTA-buffer稀釋50倍,取稀釋后的產(chǎn)物1μL,10×Buffer 1μL,LJ4:5′-TGTCGAGA TCCCTCTATCCATGCCAACC-3′(10μmol/L)0.2μL,NUP(10 μmol/L)0.2μL,dNTP 0.2μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2μL,ddH2O 7.2μL,反應(yīng)條件為 94℃30 s,68℃3 min,72℃3 min 30個循環(huán)。

巢式 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆、鑒定,每個陽性克隆挑選3個平行菌,送至上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

1.2.4 半定量RT-PCR方法檢測棉花 GhNCED基因在干旱脅迫下的表達

分別提取經(jīng) PEG6000 干旱處理 0、0.5、1、2、4、6、8、12、16、20、24 h 的棉花幼苗葉片總 RNA 并進行反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄條件參照上文),用于半定量RTPCR[16]的基因特異引物是在3′U TR區(qū)設(shè)計的:上游NCED1:5-GGGGAGGTAAAAAAGCAC-3,下游 NCED2:3-A TCCAAACTTTCCTCGCC-5。為防止擴增達到平臺期,分別進行了26、30和35個循環(huán)的擴增,最后選用30個循環(huán)進行表達特性分析,反應(yīng)條件:94℃3 min,94℃45 s,52℃45 s,72℃45 s,30個循環(huán),72℃延伸10 min。

內(nèi)參基因UBI的擴增引物序列[17]為:上游,5′-CAGATCTTCAAAACCCT-3′;下 游 ,5′-GACTCCTTCTGGATGTTGTA-3′。反應(yīng)條件是:94 ℃3 min,94℃45 s,55℃45 s,72℃45 s,26個循環(huán),72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。

1.2.5 半定量RT-PCR法檢測 GhNCED基因在棉花不同組織中的表達

分別提取經(jīng) PEG6000干旱處理0、6 h的棉花幼苗根、莖、葉的總 RNA并進行反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄條件參照上文),方法同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取

分別提取經(jīng) 20%PEG6000 處理 0、0.5、1、2、4、6、8、12、16、20、24 h 的棉花幼苗葉片總 RNA,以及經(jīng)20%PEG6000處理0和6 h的棉花幼苗根莖的總 RNA,從結(jié)果(圖1)可以見到28、18和5 S的條帶,這表明所提取的 RNA完整性好。經(jīng)DNaseⅠ處理后檢測OD260/280,結(jié)果均在2.0左右,表明提取的RNA質(zhì)量符合要求,可用于RT-PCR實驗。

2.2 棉花GhNCED基因主體片段的擴增結(jié)果

用RT-PCR的方法,以簡并引物L(fēng)J1和LJ2擴增出了746 bp的 GhNCED主體片段(圖2a),與預(yù)期的片段長度相符。對測序結(jié)果進行BLASTp分析,該片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中其它NCED蛋白具有較高的同源性,與柑橘CsNCED(登錄號為ABC26010.1)、蓖麻VVNCED(登錄號為 E1F42638.1)和花生 AhNCED(登錄號為 CAE004592.2)的同源性分別為87%、84%和79%,因此推測該片段是從棉花中克隆到的NCED基因同源片段。

圖1 棉花根、莖、葉的總RNAFig.1 The pattern of cotton total RNA

2.3 棉花 GhNCED基因3′端的克隆結(jié)果

根據(jù)RT-PCR所得的序列信息設(shè)計基因特異性引物,按Clontech公司的SMART RACE試劑盒提供的方法進行 RACE實驗,引物L(fēng)J3和LJ4分別用于primary和nested PCR擴增目的基因的3′端,得到約1 kb的片段(圖2b),將所得片段克隆并測序。對測序結(jié)果進行BLASTp分析,該片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中其它NCED蛋白有較高的同源性,與柑橘CsNCED(登錄號為 ABC26010.1)、蓖麻 VVNCED(登錄號為E1F42638.1)和菜豆 PvNCED(登錄號為AAF26356.1)的同源性分別為 78%、78%和 73%。將所得GhNCED的3′端片段與其主體片段用DNAStar進行拼接,得到1個長度為1681 bp的片段。

圖2 GhNCED主體和3′片段Fig.2 The main fragment and 3′-end of GhNCED

2.4 水分脅迫對棉花 GhNCED基因表達的影響

作為內(nèi)參照的UBI基因?qū)俦Ｊ匦詮姷摹肮芗一颉?UBI mRNA具有普遍而恒定表達的特性,設(shè)立內(nèi)參照可減少加樣不準(zhǔn)或RNA定量時產(chǎn)生的誤差。在本研究中,UBI擴增條帶亮度相同,保證RTPCR的真實可靠性。采用RT-PCR方法半定量分析GhNCED基因響應(yīng)脫水的表達情況。結(jié)果(圖3)顯示:GhNCED基因的表達呈現(xiàn)出典型的響應(yīng)干旱脅迫的特征;經(jīng)脫水處理能夠顯著誘導(dǎo) GhNCED基因的表達。經(jīng)PEG6000處理0.5 h后 GhNCED的表達量就開始增加,隨著脅迫時間的延長其表達量仍在不斷增加,處理6 h時表達量達到最高,隨后其表達量不斷降低,至24 h時表達量達到最低[10]。

圖3 棉花GhNCED基因在干旱處理下的表達情況Fig.3 Analysis of GhNCED expressing under water stress

2.5 GhNCED基因在在棉花不同組織中的特異性表達

分析干旱脅迫下棉花幼苗中 GhNCED基因表達的器官特異性,結(jié)果如圖4所示,在未經(jīng)脅迫的棉花幼苗莖葉中均檢測到GhNCED基因,而在根部未檢測到該基因。6 h水分脅迫能顯著促進棉花葉和莖中的GhNCED基因的表達,但在根部其表達量只有少量的增加。

圖4 GhNCED基因在棉花不同組織中的表達情況Fig.4 Analysis of GhNCED in different cotton organs

3 討論

本研究所采用的semi RT-PCR是目前探討基因轉(zhuǎn)錄水平的有效手段,可用來檢測基因表達及其變化狀況,并進行半定量分析,與傳統(tǒng)的Nohrtem Blot法比較,其具有靈敏、簡捷、特異性、費用低等優(yōu)點。在特異引物的引導(dǎo)下,可以從低豐度mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中擴增出近μg級的cDNA產(chǎn)物。在運用半定量RT-PCR方法檢測特異基因表達量的差異時,總RNA的質(zhì)量至關(guān)重要,只有在總RNA未被降解的情況下,才能保證其中mRNA的完整性,從而真實反映起始模板中基因表達量的差異。

NCED的作用是轉(zhuǎn)運到質(zhì)體中裂解9-順新黃質(zhì)和9-順紫黃質(zhì)形成黃質(zhì)醛,其編碼的9-順環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶是ABA合成的關(guān)鍵限速酶。NCED在果實成熟、萎蔫、干旱等過程或條件下對ABA的合成起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。由此可見,多種脅迫條件能誘導(dǎo)該基因的大量表達,但經(jīng)過各個處理后,NCED的表達變化趨勢以及到達峰值的時間有很大差異。玉米ZmNCEDmRNA在萎蔫5 h后達到峰值[5];番茄LeNCEDmRNA在萎蔫12 h后增加3倍,但在干旱處理16 h時才增加3倍[7];菜豆葉片滲透脅迫30 min即可檢測到 PvNCEDmRNA快速增加,并證明mRNA的變化領(lǐng)先于ABA的積累,且認為是葉片和根部NCEDmRNA控制著ABA的積累。本研究結(jié)果表明,在棉花幼苗葉片中GhNCED基因的表達呈現(xiàn)典型的響應(yīng)水分脅迫的特征,水分脅迫0.5 h就能誘導(dǎo) GhNCED轉(zhuǎn)錄本的增加,當(dāng)水分脅迫6 h時 GhNCED基因的表達量達到最高,隨著脅迫時間的增加,GhNCED基因的表達量又逐漸下降,直到脅迫24 h時,其表達量降到最低。在菜豆[10]和柱花草[18]中,干旱脅迫前用Nothern blot方法檢測不到 PvNCED1和SgNCED基因的轉(zhuǎn)錄本,但是在受到短時間脅迫后二者的轉(zhuǎn)錄本均有大量的增加,說明 PvNCED1和 SgNCED基因在干旱脅迫下高效表達。我們采用的半定量RT-PCR方法在水分脅迫前的棉花幼苗葉片中也檢測到了 GhNCED的表達,但其表達量低,水分脅迫時高效表達。這種結(jié)果可能是檢測方法靈敏度不同造成的,RT-PCR檢測靈敏度高能擴增出較低拷貝的轉(zhuǎn)錄本,這與 Tan等[19]利用實時定量 RT-PCR方法在擬南芥中的研究結(jié)果一致。而在棉花幼苗的不同器官中,我們發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)脅迫的棉花葉片和莖中均能檢測到GhNCED的表達,但是在根中卻檢測不到 GhNCED基因的表達,水分脅迫 6 h后GhNCED基因在莖和葉片中高效表達,而在根中雖然檢測到了 GhNCED基因的表達但表達量很低。這與萬小榮等[20]利用半定量RT-PCR法在花生上的研究結(jié)果一致,同時萬小榮等[20]將花生的AhNCED1氨基酸序列進行亞細胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn),其N端有一典型的由30個氨基酸組成的葉綠體靶向轉(zhuǎn)運肽,表明AhNCED1蛋白主要在地上部綠色組織中起作用。由此我們可以推測 GhNCED基因在根中表達量低的原因可能是 GhNCED蛋白主要也是在地上部綠色組織中起作用。而鑒于NCED基因是ABA合成過程中的關(guān)鍵限速酶,因此我們還可以推測在干旱條件下,ABA可能主要在葉片和莖中合成,從而使氣孔關(guān)閉,通過降低蒸騰作用減少失水率。

4 結(jié)論

本研究中,我們分離到了1個新的棉花NCED基因,并通過半定量 RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn),GhNCED基因在正常條件下表達量很低,干旱脅迫能夠強烈誘導(dǎo)該基因的表達,并且在干旱處理0.5 h時棉花NCED基因的轉(zhuǎn)錄本便開始積累,直到6 h時其表達量達到最大,隨后其表達量逐漸降低,直到24 h時其表達量降到最低。這表明棉花NCED基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)非常靈敏,而在棉花幼苗不同的器官中,GhNCED基因在莖葉中的表達量高,在根中表達量低。目前,抗逆基因分離及在品種改良上的應(yīng)用是棉花抗逆育種的研究熱點。本研究克隆了GhNCED基因的保守區(qū)及其3′末端,為進一步研究GhNCED基因表達的調(diào)控以及其蛋白結(jié)構(gòu)奠定了一定的基礎(chǔ)。目前 GhNCED基因的5′末端正在測序當(dāng)中。

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The Expression Analysis of Cotton 9-cis-epoxycarotenoid Dioxygenase G ene under Drought Stress

LIU Jiangna,DENG Xiaoyan,LI Zhibo,LIU Feifei,ZHANGJie,XI Zhongling,WEI Yinong
(College of Agriculture,Shihezi University/The Key Laboratory of Osis Eco-agricultury,Xinjiang Production and Construction Group,Shihezi 832000,China)

S513;S718.43

A

1007-7383(2010)05-0546-05

2009-12-24

國家自然科學(xué)基金項目(30760124)

劉江娜(1984-),女,碩士生,專業(yè)方向為生物技術(shù)在作物遺傳育種中的應(yīng)用。

魏亦農(nóng)(1964-),男,教授,從事棉花遺傳育種研究;e-mail:weiyinong@163.com。