棉花耐旱相關(guān)基因的cDNA-AFLP差異顯示

鄧曉艷,劉江娜,李志博,劉菲菲,章杰,郗忠玲,魏亦農(nóng)

(1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,石河子832003;2石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

棉花耐旱相關(guān)基因的cDNA-AFLP差異顯示

鄧曉艷1,劉江娜2,李志博2,劉菲菲2,章杰2,郗忠玲1,魏亦農(nóng)2

(1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,石河子832003;2石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

為鑒定棉花干旱脅迫響應(yīng)基因,應(yīng)用cDNA-AFLP技術(shù),以棉花耐旱品種晉棉13號幼苗為研究對象,對干旱脅迫早期葉片基因表達(dá)進(jìn)行了mRNA指紋分析。通過64對引物組合的篩選,共分離得到232個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄衍生片段(TDFs),對其中102個(gè) TDFs進(jìn)行了克隆、測序和序列分析。結(jié)果表明:45個(gè) TDFs與NCBI中已有序列同源,功能涉及信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及逆境誘導(dǎo)蛋白等,另有57個(gè) TDFs無同源序列或同源性低,預(yù)測其為是一些未知功能基因。

棉花;干旱脅迫;cDNA-AFLP;差異表達(dá)基因

Abstract:In order to identify genes involved in drought stress responses in cotton,cDNA-AFLP approach was employed to identify genes differentially expressed in cotton leaves at drought stress.Sixty-four primer combinations were used for selective amplification.Two hundred and thirty-two TDFs were selected for their differential expression under drought stress.Among the 232 TDFs,one hundred and two TDFs were cloned and sequenced.Compared with the publicly available databases,45TDFs presented some significant similarities with known plant sequences,whose functions are involved in gene regulation,transcription factor,signal transduction,stress defense,etc.Fifty-seven TDFs with low identity and no match to known genes may represent novel cotton genes.

Key words:cotton;drought stress;cDNA-AFLP;differentially expressed genes

干旱是全球面臨的嚴(yán)重問題之一,也是制約我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界約43%的耕地受到干旱、半干旱的威脅[1],因此,提高作物的抗旱能力是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中的熱點(diǎn)和重點(diǎn)問題之一。

棉花是我國乃至全世界重要的經(jīng)濟(jì)作物。新疆是西北五省干旱區(qū)之一,屬于干旱荒漠地帶,氣候干燥,同時(shí)又是我國最大的棉花生產(chǎn)基地之一,開荒植棉面積逐年擴(kuò)大。目前全疆耕地面積402.55萬hm2,其中棉花種植面積約126萬 hm2[2]。棉花屬于耗水作物,其造成的農(nóng)業(yè)用水危機(jī)問題日益突出,干旱問題嚴(yán)重制約著新疆棉花的進(jìn)一步發(fā)展。由于棉花耐旱性狀的復(fù)雜性和缺乏有效的選擇手段,多年來,人們一直采用傳統(tǒng)常規(guī)選育等方法解決棉花品種的干旱問題,但此方法具有耗資大、工作量大和選擇效率不高等缺點(diǎn),同時(shí),植物的抗旱性是受多基因控制的復(fù)雜性狀,單個(gè)抗旱基因在植物的抗旱過程中所起的作用有限[3],從而增加了解決棉花品種干旱問題的難度。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,利用生物技術(shù)手段,培育抗旱、耐旱棉花品種成為可能。目前研究基因差異表達(dá)的技術(shù)主要有 DD-PCR、RDA、SSH、SAGE、基因芯片技術(shù)、cDNA-AFLP[6]。cDNAAFLP技術(shù)是一種新的研究基因差異表達(dá)的技術(shù),因其具有可靠性高、重復(fù)性好、假陽性率低,不需要預(yù)先知道序列信息,且所需儀器設(shè)備簡單的特點(diǎn)[5],被廣泛應(yīng)用于生物體基因表達(dá)特性的研究。目前,利用 cDNA-AFLP技術(shù)已在藜屬植物[6]、擬南芥[7]、馬鈴薯[8]、番茄[9]等植物中分離出抗蟲、抗病、抗干旱等多個(gè)抗性基因。

本研究采用cDNA-AFLP技術(shù),分離出與棉花耐旱有關(guān)的cDNA片段,試圖從棉花中克隆出耐旱相關(guān)基因,以期為進(jìn)一步闡明棉花耐旱性分子機(jī)理奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以耐旱材料晉棉13號為實(shí)驗(yàn)材料,將晉棉13號的種子浸泡過夜,然后轉(zhuǎn)入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中,待發(fā)芽后,轉(zhuǎn)入盛有 Hoagland營養(yǎng)液[10]的塑料盒中培養(yǎng)。

當(dāng)幼苗長至兩葉一心時(shí),用濃度分別為20%和30%的 PEG6000進(jìn)行干旱脅迫,整個(gè)培養(yǎng)過程在25℃進(jìn)行。脅迫時(shí)間分別為 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h。剪取葉片于液氮中速凍,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法1.2.1 RNA的提取及雙鏈cDNA的合成

分別取對照和脅迫后的棉花葉片,用改良的CTAB法[11]提取其總RNA。

cDNA雙鏈合成按照 Takara的 M-MLV RTase cDNA SynthesisKit(M-MLV version)(Code No.D6130)中介紹的方法,先以O(shè)ligo(dT)18 Primer為引物,合成cDNA第一鏈,然后通過E.coli RNaseH使雜合鏈中 RNA形成單鏈切口,在E.coli DNA Polymerse I與E.coli DNA ligase的作用下合成cDNA第二條鏈。合成的雙鏈cDNA用Ubiquitin gene(UBI)[12]進(jìn)行檢測。

1.2.2 cDNA-AFLP分析

cDNA 200 ng,10 U/μL MseI和 EcoR Ⅰ各 1 μL,10×Reaction buffer 2.5μL,T4DNA連接酶(3 U/μL)1μL,10 mmol/L ATP 2.5μL,MseI和EcoRI人工接頭(50μmol/L)各 0.5μL,用 ddH2O補(bǔ)足至20μL,在37 ℃下保溫5 h,8 ℃保溫4 h,然后4℃過夜。

取酶切連接后的產(chǎn)物2μL,M0和E0(50μg/L)各0.5μL,10×PCR buffer 2.5 L,dNTP 0.5 L ,Taq酶(2 U/μL)0.5μL,用 ddH2O 補(bǔ)足至20μL,進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。

預(yù)擴(kuò)增引物序列:

PCR反應(yīng)為預(yù)變性94℃2 min,變性94℃30 s,退火56℃30 s,延伸72℃80 s,30個(gè)循環(huán),延伸加時(shí)72℃5 min,產(chǎn)物稀釋20倍備用。稀釋后產(chǎn)物 2μL,引物(50 ng/μL)各 1μL,10×PCR buffer 2.5μL,dNTP 0.5μL,Taq 酶(2 U/μL)0.5μL,用ddH2O補(bǔ)足至20μL,進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。

選擇性擴(kuò)增引物序列:

EcoRI primers E0-AGC,E0-ACT,E0-ACG,E0-AGG,E0-ACC,E0-ACA,E0-AAG,E0-AAC;

Mse I primers M0-CAG,M0-CTC,M0-CTG,M0-CTT,M0-CTA,M0-CAA,M0-CA T,M0-CAC。

PCR反應(yīng)為預(yù)變性94℃2 min,變性94℃30 s,退火65℃30 s并且每個(gè)循環(huán)降低0.7℃,延伸72℃80 s,14個(gè)循環(huán),接下來按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪:94℃30 s,55℃30 s,72℃80 s,最后延伸72℃5 min,產(chǎn)物備用。

1.2.3 電泳及銀染

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物加上樣緩沖液,變性后通過6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,分離后用硝酸銀染色[13],染色完成后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.4 差異片段的回收、克隆及測序

選擇有明顯差異的條帶進(jìn)行回收,用與原來相同的選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行第2次擴(kuò)增,用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的真實(shí)性。

TIANgel Midi Purification Kit回收試劑盒回收純化目的片段,Promega的p GEM-T載體試劑盒進(jìn)行回收條帶的克隆,所得陽性克隆由上海生工進(jìn)行測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

對獲得序列利用BLASTN和BLASTX程序與網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(NCBI,national center for biotechnology information)進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取結(jié)果及cDNA的質(zhì)量

圖1 棉花葉片RNA電泳圖譜Fig.1.RNA of cotton leaf

圖2 棉花葉片cDNA質(zhì)量檢測Fig.2 cDNA quality of cotton leaf

本實(shí)驗(yàn)利用改良的CTAB法提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測得D260nm與D280nm的比值為1.8～2.0,表明 RNA純度較高;1.0%瓊脂糖檢測發(fā)現(xiàn)rRNA的 28 S和 18 S條帶清晰(圖 1),這說明RNA完整性較好,無降解,蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的污染少,能夠滿足反轉(zhuǎn)錄cDNA要求。

以UBI為內(nèi)參擴(kuò)增的目的片段,瓊脂糖電泳檢測在200 bp處出現(xiàn)亮的條帶(圖2),說明反轉(zhuǎn)錄成功,可用于AFLP標(biāo)記的分析。

2.2 棉花葉片對照、干旱脅迫條件下基因差異表達(dá)譜

本實(shí)驗(yàn)選取8個(gè) MseI引物和8個(gè) EcoRI引物,組成64個(gè)引物組合對其進(jìn)行了差異表達(dá)基因的篩選,圖3為部分引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果表明 E+CC/M+AG、E+CT/M+AG等引物組合可以擴(kuò)增出較穩(wěn)定的條帶。

圖3 部分引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物(未列全)Fig.3 Amplified products of several primer pairs

圖3 顯示了篩選差異片段以下5種情況。

1)在干旱脅迫和對照中的表達(dá)無明顯差異的,如圖3中第9和第10泳道。

2)某一基因在干旱脅迫處理下比在對照條件下減弱,如圖3中A指示的譜帶。

3)某一基因在干旱脅迫后表達(dá),而在對照情況下沒有表達(dá),如圖3中B指示的譜帶。

4)某一基因在干旱脅迫處理下,比在對照條件下強(qiáng),如圖3中C指示的譜帶。

5)某一基因在對照條件下表達(dá),而在干旱脅迫情況下不表達(dá),如圖3中D指示的譜帶。

2.3 差異表達(dá)片段的分析和功能預(yù)測

由于cDNA-AFLP技術(shù)顯示的是植物基因在表達(dá)水平上的差異,所以無論擴(kuò)增的是質(zhì)的差異還是量的差異,均能正確反應(yīng)出基因在整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)變化。

為了能進(jìn)一步闡明棉花對干旱脅迫條件的適應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制,將回收的232條片段進(jìn)行二次擴(kuò)增,選擇出102條表達(dá)穩(wěn)定的差異條帶進(jìn)行測序,Blast比對結(jié)果表明:與已知基因有同源性的片段有45條,約占測序數(shù)的44%,另有57條片段與已知基因或序列無任何同源性,可能是因?yàn)槠屋^短或是尚未發(fā)現(xiàn)的新基因。

表1列出了與耐旱性密切相關(guān)的13個(gè)cDNA片段的信息。有些基因只與生物的基本生長和代謝有關(guān),在此未全部列出。

表1 與棉花耐旱性相關(guān)的cDNA片段Tab.1 cDNA sequences related to cotton reaction to drought-stress

3 討論

干旱是作物生產(chǎn)面臨的主要環(huán)境問題。高等植物對干旱脅迫的耐受性在一定程度上具有相似的分子基礎(chǔ),很多基因的表達(dá)受干旱脅迫的誘導(dǎo)并在植物抵抗干旱脅迫中起作用。

本試驗(yàn)利用cDNA-AFLP技術(shù)從棉花中克隆了一些與干旱脅迫反應(yīng)相關(guān)的cDNA片段,它們有可能在棉花的耐旱中起重要或決定性作用。

首先得到了幾個(gè)與脅迫有關(guān)的基因片段,如水稻滲透響應(yīng)蛋白(12號)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白(29號)等。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可分為L TR(long terminal repeats)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非L TR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[14],其為真核生物中一類可移動因子。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄可以被多種生物或非生物的逆境所激活,如外傷、細(xì)胞培養(yǎng)等[15]?，F(xiàn)有的研究證實(shí),植物在逆境脅迫情況下,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活化可以調(diào)節(jié)植物抗逆相關(guān)基因的表達(dá),是植物自我保護(hù)的一種反應(yīng)[16],因此推測轉(zhuǎn)座可能與植物發(fā)生防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)。本研究在干旱條件下表達(dá)的1個(gè)序列(29號)與黃瓜的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白具有較高的同源性,也說明了反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與植物的抗旱可能有關(guān)。但關(guān)于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物抗旱方面的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

其次,分離到一個(gè)與離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的片段(33號),其編碼液泡膜A TPase B亞基。學(xué)者們[17-19]從棉胚珠中克隆出液泡H+-A TPase(v-ATPase)的A(69 kDa)、B(57 kDa)、c 亞基(16 kDa),這三種亞基以A3B3c6形式組成 H+-ATPase全酶。A亞基和B亞基組成位于液泡膜朝細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的Vl部分,A亞基為催化膚,具有水解A TP酶的能力,而B亞基具有調(diào)控功能,c亞基為16 kDa的蛋白脂質(zhì),構(gòu)成與膜結(jié)合的VO部分,形成一個(gè)胞質(zhì) H+跨膜進(jìn)入液泡的通道。當(dāng)土壤中存在高鹽、干旱和重金屬等脅迫時(shí),細(xì)胞的存活主要依賴V型 H+-ATPase活性的維持和調(diào)整[20]。

第三,得到了幾個(gè)與信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)的基因片段,如1,4-α-葡聚糖分支酶(1號)、ATP結(jié)合蛋白(3號)、磷脂酰甘油磷脂酶C(61號)。其中磷脂酶C(phospholipase C,PLC)是磷脂酰肌醇信號通路的關(guān)鍵酶,在體內(nèi)分布極為廣泛。許多細(xì)胞外信息分子,如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、免疫球蛋白、細(xì)胞因子、生長因子等都可以激活磷脂酰肌醇特異性 PLC?；罨腜LC能水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2),從而產(chǎn)生2種重要的第二信使(二酯酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)),進(jìn)而將細(xì)胞外信息傳遞給下游效應(yīng)分子,調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動[21]。另外 PLC與甘油二酯激酶(DGK)協(xié)同作用產(chǎn)生磷脂酸(PA),在植物的生長、分化、繁殖等多種生物和非生物脅迫的信號傳導(dǎo)中,PA均有調(diào)控作用。多種生物和非生物脅迫都可以誘導(dǎo)PA的產(chǎn)生,如病原體的侵入、干旱、鹽脅迫及冷害等[22]。

從差異片段中分離到的另外幾條片段,如預(yù)測蛋白(84號)、假擬蛋白(89號)、非常規(guī)肌球蛋白(93號),均在脅迫后增強(qiáng)表達(dá),初步推測與耐旱相關(guān),具體功能有待進(jìn)一步研究。

本研究克隆分離的13個(gè)cDNA特異片段的大小為93～231 bp,片段偏短。其原因可能是本研究所采用的cDNA-AFLP技術(shù)中進(jìn)行cDNA酶切的酶為典型的EcoRⅠ和MseⅠ,這樣經(jīng)過2種酶切成的cDNA模板片段可能較短,要獲得更多的信息可以通過 RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法得到全長cDNA序列。

4 結(jié)論

本研究利用cDNA-AFLP技術(shù),以棉花耐旱品種晉棉13號幼苗為研究對象,對干旱脅迫早期葉片基因表達(dá)進(jìn)行了mRNA指紋分析。通過64對引物組合的篩選,共分離得到232個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄衍生片段(TDFs),對其中102個(gè) TDFs進(jìn)行了克隆、測序和序列分析。生物信息學(xué)分析的結(jié)果表明:45個(gè) TDFs與NCBI中已有序列同源,功能涉及信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及逆境誘導(dǎo)蛋白等,這為棉花耐旱分子育種的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。另外有57個(gè)TDFs無同源序列或同源性低,因此預(yù)測其為一些未知功能基因。相信還有更多未知功能基因有待發(fā)現(xiàn)。

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Analysis of the Responsive Genes during Drought in Cotton by Means of cDNA-AFLP

DENG Xiaoyan1,LIU Jiangna2,LI Zhibo2,LIU Feifei2,ZHANGJie2,XI Zhongling1,WEI Yinong2
(1 College of Life Science,Shihezi University1,Shihezi 832003,China;2 College of Agriculture,Shihezi University/Key Laboratory of Oasis Ecology Agriculture of Xinjiang Production and Construction Group,Shihezi 832003,China)

S332.1;Q78

A

1007-7383(2010)05-0537-05

2009-12-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30760124)

鄧曉艷(1983-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)橹参镞z傳;e-mail:shzdxy@sina.com。

魏亦農(nóng)(1964-),男,教授,從事棉花遺傳育種研究;e-mail:weiyinong@163.com。