利用Gateway技術(shù)構(gòu)建天山雪蓮cDNA表達(dá)文庫(kù)

李晨,沈海濤,張煜星,王愛(ài)英,祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

利用Gateway技術(shù)構(gòu)建天山雪蓮cDNA表達(dá)文庫(kù)

李晨,沈海濤,張煜星,王愛(ài)英,祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

以天山雪蓮為材料,利用gateway技術(shù)構(gòu)建天山雪蓮cDNA表達(dá)文庫(kù)。從經(jīng)低溫處理后的天山雪蓮葉片中提取并分離mRNA,合成雙鏈cDNA;cDNA經(jīng)BP重組反應(yīng)重組到入門(mén)載體pDONR222上,構(gòu)建得到天山雪蓮entry cDNA文庫(kù);天山雪蓮entry cDNA再經(jīng)LR重組反應(yīng)將雪蓮cDNA重組到植物表達(dá)載體pL EELA上,從而構(gòu)建了天山雪蓮cDNA表達(dá)文庫(kù)。結(jié)果表明:cDNA入門(mén)文庫(kù)滴度達(dá)到1.2×107cfu/mL,文庫(kù)總?cè)萘繛?.8×107cfu。表達(dá)文庫(kù)的滴度為6.9×106cfu/mL,文庫(kù)總?cè)萘繛?.76×107cfu,插入片段平均大小1000 bp。陽(yáng)性克隆率100%。天山雪蓮cDNA表達(dá)文庫(kù)的建立為進(jìn)一步高通量篩選天山雪蓮抗寒基因奠定了基礎(chǔ)。

天山雪蓮 ;cDNA入門(mén)文庫(kù);cDNA表達(dá)文庫(kù);gateway技術(shù)

Abstract:The construction of a cDNA library ofS aussurea involucrataKar.et Kir using gateway technology was reported in this paper.The mRNA was isolated from Saussurea involucrata Kar.et Kir leaves.Then the double-strand cDNAs(ds-cDNAs)was synthesized.The ds-cDNAs were cloned into pDONR222 vector using BP reaction of Gateway cloning technology,and the entry clone was gained.Using the LR reaction of Gateway cloning technology,the plant express vector pLEELA was ligated with the entry clone.Results showed that the entry cDNA library constructed in this report has a high titer of 1.2×107cfu/ml and contain a total clones of 4.8×107cfu and the expression library show a high titer of 6.9×106cfu/ml and contains a total clones of 2.76×107cfu,with an average inserts size of 1000bp.This cDNA library provides an important tool for filtrate the cold resistant genes.

Key words:Saussurea involucrataKar.et Kir;cDNA entry library;cDNA expression library;gateway technology

Gateway克隆技術(shù)是利用細(xì)菌λ噬菌體的整合酶-切除酶反應(yīng)系統(tǒng)創(chuàng)建一種通過(guò)體外特異位點(diǎn)重組反應(yīng)[1-2],并在該重組系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行一系列修飾、改造,提高了這一重組系統(tǒng)的效率與特異性[3]。最早利用 Gateway技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)的是Ohara等[4-5]。在我國(guó),2004年梅文倩等[6]嘗試?yán)肎ateway技術(shù)大規(guī)模克隆擬南芥轉(zhuǎn)錄因子。天山雪蓮(S aussurea involucrataKar.et Kir)是典型的耐極端低溫的高山冰緣植物,主要生長(zhǎng)于海拔2400～4100 m處,月平均氣溫很低,日溫度變化幅度較季節(jié)溫度變化急劇,通常在一天中要經(jīng)歷類似從夏季到冬季的溫度變化,冰雹、霜凍等頻繁發(fā)生。雪蓮具有極強(qiáng)的耐寒、抗輻射、抗缺氧的能力,能在月平均溫度僅3～5℃環(huán)境中快速生長(zhǎng),而在這種極端環(huán)境條件下生存的植物,一定發(fā)展出了抵御低溫冰凍脅迫同時(shí)完成生活史的特殊的生理機(jī)制[7-8]。

在國(guó)內(nèi),近年來(lái)已有學(xué)者開(kāi)始利用SMART技術(shù)構(gòu)建天山雪蓮全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)并分析其表達(dá)序列標(biāo)簽[9-10],但未見(jiàn)利用 Gateway技術(shù)構(gòu)建天山雪蓮cDNA表達(dá)文庫(kù)的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)是以天山雪蓮為材料,利用gateway技術(shù)構(gòu)建天山雪蓮cDNA表達(dá)文庫(kù),以期為進(jìn)一步高通量的篩選天山雪蓮抗寒基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及菌株

天山雪蓮(S aussurea involucrataKar.et Kir)為本實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌苗。大腸桿菌(Escherichia colli)DH10B電擊感受態(tài)購(gòu)于Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑

TRlzol Reagent、Fast Track 2.0 mRNA Isolation Kits、CloneMiner cDNA Library Construction Kit、Gateway LR Clonase II Enzyme Mix 購(gòu)于 I nvitrogen公司。表達(dá)載體pLEELA由中國(guó)農(nóng)科院作物所傅永福研究員提供。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將18℃培養(yǎng)的天山雪蓮無(wú)菌苗進(jìn)行4℃處理1 d,0℃處理2 d[9]的低溫梯度處理。

1.2.2 總RNA的提取及mRNA分離

取1 g冷處理過(guò)的天山雪蓮葉片,液氮研磨,立即加入5 mL TRlzol Reagent,混勻,分裝到5個(gè)DEPC處理的1.5 mL離心管中,按照 T RIzol Reagent說(shuō)明書(shū)中的步驟進(jìn)行。每管用20μL DEPC處理的水溶解總RNA。通過(guò)紫外分光光度計(jì)和甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度、濃度和完整性。取1 mg總RNA按照FastTrack 2.0 mRNA Isolation Kits試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法分離mRNA,并檢測(cè)mRNA的質(zhì)量。

1.2.3 cDNA合成和片段分級(jí)

取天山雪蓮 m RNA 5μg,將 S uperScriptⅡ等試劑加入反轉(zhuǎn)錄合成一鏈,再將 E .coli DNA Ligase、E.coli DNA Polymerase Ⅰ、E.coli RNase H等試劑加入合成cDNA第二鏈,后將attB1接頭連接到雙鏈cDNA上。

cDNA片段分級(jí):采用色譜柱法,按照說(shuō)明書(shū)操作,利用試劑盒提供的含有1 mL Sephacryl S-500 HR樹(shù)脂的色譜柱將cDNA分級(jí),并檢測(cè)其純度與濃度。

1.2.4 BP重組反應(yīng)、電轉(zhuǎn)化和入門(mén)文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量檢測(cè)

將BP Clonase Enzyme Mix和pDONR 222載體加入150 ng分級(jí)后合適大小片段的cDNA中進(jìn)行BP重組反應(yīng)。再將重組反應(yīng)產(chǎn)物用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)大腸桿菌DHIOB感受態(tài)細(xì)胞。37℃、250 r/min培養(yǎng)1 h,加入冷凍培養(yǎng)基(含40%甘油的 SOC培養(yǎng)基),液氮速凍,-70℃下保存,即為構(gòu)建的cDNA入門(mén)文庫(kù)。

從入門(mén)文庫(kù)中取100μL菌液用SOC培養(yǎng)基分別稀釋到100倍、1000倍和10000倍。從中各取100μL涂到含 Kanamycin的LB平板(直徑9 cm),每種稀釋倍數(shù)涂2個(gè)平板。37℃過(guò)夜培養(yǎng),計(jì)算其克隆數(shù)。文庫(kù)的滴度=(平板上克隆數(shù)×稀釋倍數(shù))/涂板體積,根據(jù)公式計(jì)算出文庫(kù)滴度,從而得出文庫(kù)的總?cè)萘俊?/p>

1.2.5 表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建

將入門(mén)文庫(kù)接種到100 mL含有 Kanamycin的LB培養(yǎng)基中,37℃過(guò)夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒,取200 ng,在 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix作用下與Gateway載體pLEELA進(jìn)行LR重組反應(yīng),重組載體電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B,用抗生素Ampicillin篩選,從而構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)。

1.2.6 表達(dá)文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

表達(dá)文庫(kù)的滴度及總?cè)萘坑?jì)算方法與初始文庫(kù)相同。隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆,提取質(zhì)粒。根據(jù)載體設(shè)計(jì)引物:

檢測(cè)表達(dá)文庫(kù)陽(yáng)性克性率及平均插入片段大小。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取及mRNA分離

經(jīng)甲醛變性瓊脂糖電泳鑒定,可看到清晰的28 S、18 S和5 S條帶(圖1);28 S條帶明顯亮于18 S條帶,比例約為2∶1,這表明總 R NA的完整性良好。總RNA樣品經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè),OD260/280為1.92,濃度為16.34μg/μL,總共得到100μL。提取并分離得到的 m RNA樣品經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè),OD260/280為 1 .96,濃度為 0 .9μg/μL,共得到 1 0μL 。

2.2 cDNA合成及片段分級(jí)

對(duì)合成第二鏈的cDNA片段分級(jí),收集20管片段分級(jí)樣品,經(jīng)從第5管開(kāi)始能檢測(cè)到cDNA,到第8管cDNA總量345 ng?；旌系?管到第7管的樣品,乙醇沉淀后用4.5μL的 T E(8.0)溶解,分光光度計(jì)檢測(cè),OD260/280為1.82,共得到286 ng樣品。

2.3 文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量評(píng)價(jià)

經(jīng)檢測(cè)cDNA入門(mén)文庫(kù)滴度達(dá)到1.2×107cfu/mL,文庫(kù)總?cè)萘繛?.8×107cfu。表達(dá)文庫(kù)的滴度為6.9×106cfu/mL,文庫(kù)總?cè)萘繛?.76×107cfu,隨機(jī)提取10個(gè)克隆質(zhì)粒,經(jīng) P CR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)結(jié)果(圖2)表明,陽(yáng)性克隆率100%,插入片段平均大小1000 bp。

圖1 天山雪蓮總RNA的提取Fig.1 T otal RNAs extracted from Saussurea invol ucrata Kar.et K ir

圖2 表達(dá)文庫(kù)克隆的質(zhì)粒PCR檢測(cè)Fig.2 PCR analysis of recombinant plasmids from expression library

3 討論

cDNA文庫(kù)的質(zhì)量主要反映在文庫(kù)的代表性和重組cDNA片段的序列完整性兩個(gè)方面[11]。文庫(kù)的代表性可用庫(kù)容量來(lái)衡量。根據(jù)Clarke-Carbon公式,為滿足篩到低豐度mRNA的要求,文庫(kù)應(yīng)具有2.073×105以上的庫(kù)容量。另外重組cDNA片段的完整性取決于mRNA的完整程度。真核生物的mRNA的完整性一般以28 S rRNA和18 S rRNA來(lái)衡量。

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的cDNA表達(dá)文庫(kù)具有以下特點(diǎn):1)提取的天山雪蓮總 RNA,28 S、18 S和5 S條帶清晰可見(jiàn),其28 S rRNA比18 S rRNA要亮1倍,可用于構(gòu)建文庫(kù)。2)文庫(kù)克隆效率高,入門(mén)文庫(kù)庫(kù)容為4.8×107cfu,表達(dá)文庫(kù)的庫(kù)容為2.76×107cfu,完全能夠滿足篩選低拷貝基因的要求。3)陽(yáng)性克隆率高,入門(mén)文庫(kù)和表達(dá)文庫(kù)陽(yáng)性克隆率都為100%。4)插入cDNA片段平均大小為1000 bp。

從反映cDNA文庫(kù)的質(zhì)量的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看本研究所構(gòu)建的天山雪蓮cDNA文庫(kù)是高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Gateway技術(shù)構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA表達(dá)文庫(kù)尚屬首次,研究結(jié)果為高通量的篩選和克隆天山雪蓮抗寒基因奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of A cDNA Library ofSaussurea involucrataK ar.et Kir Using G ateway Technology

LI Chen,SHEN Haitao,ZHANG Yanxing,WANG Aiying,ZHU Jianbo
(Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,College of Life Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Q785;S580.1

A

1007-7383(2010)05-0534-03

2009-12-04

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)重點(diǎn)項(xiàng)目(2007AA021401),國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30960034),新疆兵團(tuán)科技攻關(guān)項(xiàng)目(NKB025DXNK01SW)

李晨(1984-),男,碩士生,專業(yè)方向?yàn)橹参锟鼓婊蚬こ?e-mail:ldczqh@163.com。

祝建波(1967-),男,副研究員,從事植物抗逆基因工程研究;e-mail:jianbozh@shzu.edu.cn。