葉酸脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究

童桂鴻，劉成梅*，劉 偉，楊水兵，劉瑋琳，陰婷婷，鄭會(huì)娟

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

葉酸脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究

童桂鴻，劉成梅*，劉 偉，楊水兵，劉瑋琳，陰婷婷，鄭會(huì)娟

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

以葉酸為載藥，卵磷脂和膽固醇為膜材，采用薄膜水化-超聲法制備葉酸脂質(zhì)體；通過單因素考察制備工藝對(duì)包封率的影響以及正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行制備工藝優(yōu)化。得出最佳制備工藝為卵磷脂與膽固醇比5:1(m/m)、葉酸質(zhì)量濃度1.4mg/mL、制備溫度60℃、水相pH8.0。制備的葉酸脂質(zhì)體包封率可達(dá)到30.36%，平均粒度為335.4nm。將脂質(zhì)體在4℃下密閉放置15d，以脂質(zhì)體的粒徑變化為指標(biāo)考察其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，脂質(zhì)體懸液粒徑無明顯變化，主要集中在300～400nm，脂質(zhì)體懸液穩(wěn)定性良好。

葉酸；脂質(zhì)體；薄膜水化-超聲法；包封率；穩(wěn)定性

脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層構(gòu)成的親水性囊泡，這種結(jié)構(gòu)使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩親的物質(zhì)，為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域內(nèi)高新技術(shù)之一，一直備受廣大藥劑工作者的關(guān)注?，F(xiàn)有多種抗癌藥物脂質(zhì)體制劑在近20個(gè)國(guó)家應(yīng)用于臨床。同時(shí)有多種維生素被制成脂質(zhì)體應(yīng)用于食品和化妝品中。作為藥物載體，脂質(zhì)體具有有效防止被包裹藥物氧化、提高其穩(wěn)定性和生物利用度、使被包裹藥物具有靶向性、天然無毒、生物可降解、無免疫抑制作用等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。

葉酸(folacin，folic acid)又叫VB11，是一種由喋啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸殘基組成的重要B族維生素。葉酸缺乏會(huì)引起巨幼紅細(xì)胞貧血，也會(huì)罹及其他代謝過程，導(dǎo)致畸形、早產(chǎn)、血管閉塞性等疾病[3-4]。許多研究證實(shí)了葉酸與新生兒缺陷、成年與老年心血管病、精神科疾病、胃腸功能異常、免疫學(xué)缺陷及腫瘤等具有相關(guān)性[5-7]，補(bǔ)充葉酸除能有效減少上述疾病外，還有增強(qiáng)記憶力，預(yù)防硝酸甘油耐藥性[8]等效用。因此，開發(fā)葉酸保健品及葉酸食品，有著廣闊的市場(chǎng)前景。目前美國(guó)已開發(fā)出一些新型營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品[9]。在我國(guó)，也已認(rèn)識(shí)到葉酸的重要性，含葉酸的兒童強(qiáng)化食品正在開發(fā)中，這方面的消費(fèi)將會(huì)有很大潛力。

人體所需的葉酸主要來源于食物，但食物中含量很少且并不穩(wěn)定，在烹調(diào)時(shí)極易破壞，損失率可達(dá)50%以上[10]。此外，食物的儲(chǔ)存方式對(duì)葉酸的損失程度也有影響。制備葉酸脂質(zhì)體，對(duì)增加藥物葉酸的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間、減小藥物添加劑量等有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合脂質(zhì)體作為新型藥劑載體的優(yōu)越性，以大豆卵磷脂和膽固醇作為膜材，采用薄膜水化-超聲法制備出包封率高、穩(wěn)定性好的水溶性葉酸脂質(zhì)體，旨在增強(qiáng)葉酸的穩(wěn)定性，提高葉酸的利用度和治療指數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉酸(純度97%，生化試劑) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膽固醇(分析純) 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；卵磷脂(分析純) 北京美亞思磷脂技術(shù)有限公司；無水乙醇、磷酸二氫鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；T6紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-50E超聲波震蕩儀 山東奧波超聲電器有限公司；NICOMP 380/ZLS納米粒度分析儀 美國(guó)Santa barbara公司。

1.3 方法

1.3.1 葉酸脂質(zhì)體的制備

精確稱取配方量的卵磷脂、膽固醇與適量無水乙醇混合后，置于250mL圓底燒瓶中減壓蒸發(fā)去除乙醇，使燒瓶壁上形成一層均勻的薄膜。然后加入一定量含有1.4mg/mL葉酸藥物的PBS溶液，旋轉(zhuǎn)洗膜15min左右，得到脂質(zhì)體懸液；最后將懸液水浴超聲一段時(shí)間即制得較均勻的淡黃色葉酸脂質(zhì)體懸浮液[11]。制備工藝流程如下：

1.3.2 制備葉酸脂質(zhì)體的單因素試驗(yàn)

分別以超聲時(shí)間、制備溫度、表面活性劑種類、表面活性劑用量、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比(卵膽比)、葉酸質(zhì)量濃度以及水相pH值為因素，考察各因素對(duì)葉酸脂質(zhì)體包封率和粒徑的影響。

1.3.3 葉酸脂質(zhì)體制備的正交試驗(yàn)

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對(duì)脂質(zhì)體包封率和粒徑影響較大的4個(gè)因素(卵膽比、制備溫度、葉酸質(zhì)量濃度和水相pH值)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)(表 1)。

1.3.4 葉酸脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用紫外分光光度法[12-13]測(cè)定葉酸含量。精密吸取1mg/mL的葉酸儲(chǔ)備液1mL，定容至50mL，配成質(zhì)量濃度為20μg/mL的葉酸溶液，置于1cm石英吸收池中，以pH7.8的PBS緩沖液為空白，在200～800nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸收曲線，得出282nm處有最大吸收峰。精密移取葉酸儲(chǔ)備液適量，分別用pH7.8的PBS緩沖液，稀釋配成1、2、4、5、10、15、20、25μg/mL的溶液，以磷酸鹽緩沖液為參比，用1cm石英池在282nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0163x＋0.0009，R2=0.9999。表明葉酸質(zhì)量濃度在1～25μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.3.4.2 包封率的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用透析法分離脂質(zhì)體和游離藥物葉酸，利用紫外分光光度法測(cè)定透析內(nèi)液中包封葉酸的含量和脂質(zhì)體懸液中總?cè)~酸量，從而計(jì)算脂質(zhì)體的包封率[14]。

測(cè)定方法：取10mL脂質(zhì)體于處理過的透析袋中，封口，置于100mL pH7.8的PBS緩沖溶液中于室溫下磁力攪拌透析8h，每隔2h更換一次透析介質(zhì)。然后分別取一定量的透析內(nèi)液和脂質(zhì)體懸液用甲醇破乳后，以pH7.8 PBS緩沖溶液為空白，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，計(jì)算出包封葉酸的含量和脂質(zhì)體中總?cè)~酸含量，并計(jì)算包封率。

1.3.5 葉酸脂質(zhì)體粒徑的測(cè)定

分別吸取50μL的脂質(zhì)體于比色皿中，用相應(yīng)的水相溶液稀釋后置于NICOMP 380/ZLS納米粒度分析儀中測(cè)定粒度及粒度分布[15]。

1.3.6 葉酸脂質(zhì)體貯藏穩(wěn)定性的考察

將脂質(zhì)體懸液置于4℃下貯藏，并于不同時(shí)間(0、3、6、9、12、15d)取樣進(jìn)行粒度及粒度分布的測(cè)定[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備葉酸脂質(zhì)體的單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間的影響

保持葉酸質(zhì)量濃度2mg/mL，總脂材質(zhì)量濃度20mg/mL，卵膽比4:1(m/m)，總脂材:表面活性劑10:3(m/m)，水相pH7.8，制備溫度60℃，用薄膜水化法制備好脂質(zhì)體后，分別超聲2、4、6、8、10min，再按1.3.4節(jié)和1.3.5節(jié)的方法分別測(cè)定葉酸脂質(zhì)體的包封率和粒度及粒度分布。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)包封率和平均粒度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on encapsulation efficiency and particle size

從圖1可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)體的平均粒度總體呈下降趨勢(shì)。超聲8min時(shí)，包封率最低(12.41%)，可能是此時(shí)超聲已經(jīng)破壞了脂質(zhì)體，使包封的葉酸釋放出來，包封率下降；超聲10min后，包封率有所上升的原因可能是，超聲的過程又促使游離的葉酸再一次包封。綜合考慮脂質(zhì)體的包封率、粒度及粒度分布，本實(shí)驗(yàn)采用超聲時(shí)間為4min。

2.1.2 制備溫度的確定

保持葉酸質(zhì)量濃度2mg/mL，總脂材質(zhì)量濃度20mg/mL，卵膽比4:1(m/m)，總脂材:表面活性劑10:3(m/m)，水相pH7.8，分別在制備溫度50、55、60、65、70℃，用薄膜水化法制備脂質(zhì)體，超聲4min后，按1.3.4節(jié)和1.3.5節(jié)的方法分別測(cè)定葉酸脂質(zhì)體的包封率和粒度及粒度分布。

圖2 制備溫度對(duì)包封率和平均粒度的影響Fig.2 Effect of preparation temperature on encapsulation efficiency and particle size

從圖2可以看出，在60℃以前，隨著溫度升高，包封率升高，平均粒度減小，但變化幅度都不大；而在60℃以后，隨著溫度升高，包封率下降，平均粒度增大，且變化幅度較大，分析原因可能是：當(dāng)溫度過低時(shí)，脂材的成膜速度過慢，導(dǎo)致脂材一直處在溶劑浸泡的狀態(tài)，這樣達(dá)不到成膜的致密性，因此，得到的脂質(zhì)體平均粒度大，包封率小；而在溫度過高時(shí)，脂材的成膜速度又過快，這時(shí)磷脂和膽固醇之間還沒有形成致密結(jié)合，在加入PBS溶液溶脹時(shí)，由于脂材膜比較松散，得到的脂質(zhì)體的平均粒度較大，包封率也不高。因此選擇60℃為脂質(zhì)體較適宜的制備溫度。

2.1.3 表面活性劑種類的選擇

保持葉酸質(zhì)量濃度2mg/mL、總脂材質(zhì)量濃度20mg/mL、卵膽比4:1(m/m)、總脂材:表面活性劑10:3(m/m)，水相pH7.8和制備溫度60℃，研究3種表面活性劑(Span-80、Tween-80和Tween-20)對(duì)葉酸脂質(zhì)體的影響。用Span-80作為表面活性劑制得的懸液不均勻，有肉眼可見的塊狀物，可能是由于Span-80不溶于水。其他兩種表面活性劑制備的脂質(zhì)體的包封率和平均粒度結(jié)果見表2。

表2 表面活性劑種類對(duì)包封率和平均粒度的影響Table 2 Effect of surfactant type on encapsulation efficiency and particle size

從表2可以看出，使用Tween-20為表面活性劑制備的脂質(zhì)體包封率低，平均粒度大，而使用Tween-80制得的脂質(zhì)體包封率較高且平均粒度較小，說明Tween-80對(duì)葉酸脂質(zhì)體這一懸浮體系具有較好的分散穩(wěn)定性，因此選取Tween-80作為本實(shí)驗(yàn)的表面活性劑。

2.1.4 卵磷脂和膽固醇比值的確定

保持葉酸質(zhì)量濃度2mg/mL，總脂材質(zhì)量濃度20mg/mL，總脂材:表面活性劑10:3(m/m)，水相pH7.8，在制備溫度60℃下，以Tween-80為表面活性劑，分別制備卵膽比2:1、3:1、4:1、5:1、6:1(m/m)的脂質(zhì)體，超聲4min后，按1.3.4節(jié)和1.3.5節(jié)的方法分別測(cè)定葉酸脂質(zhì)體的包封率和平均粒度及粒度分布。

圖3 卵膽比對(duì)包封率和平均粒度的影響Fig.3 Effect of lecithin/cholesterol mass ratio on encapsulation efficiency and particle size

從圖3可以看出，隨著卵膽比的增大，包封率先升高后降低，平均粒度先減小后增大，當(dāng)卵膽比為4:1(m/m)；包封率達(dá)到最大32.16%，且平均粒度最小為316.6nm，這是由于適量的膽固醇可以改變磷脂在脂質(zhì)雙分子層中的排列順序及流動(dòng)性，從而使包封率提高，平均粒度減小。

2.1.5 總脂材和Tween-80比值的確定

保持葉酸質(zhì)量濃度2mg/mL，總脂材質(zhì)量濃度20mg/mL，卵膽比4:1(m/m)，水相pH7.8，在制備溫度60℃下，采用總脂材:Tween-80分別為10:1、10:2、10:3、10:4、10:5(m/m)制備脂質(zhì)體，超聲4min后，按1.3.4節(jié)和1.3.5節(jié)的方法分別測(cè)定葉酸脂質(zhì)體的包封率和粒度及粒度分布。

從圖4可以看出，隨著Tween-80用量的增加，包封率先升高后降低，最高點(diǎn)為32.16%，對(duì)應(yīng)的總脂材:Tween-80為10:3(m/m)；平均粒度先減小后增大，最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)的總脂材:Tween-80為10:3(m/m)，分析認(rèn)為Tween-80是一種非離子表面活性劑，相對(duì)分子質(zhì)量在幾千左右，這種分子結(jié)構(gòu)在脂質(zhì)體的形成過程中起到空間位阻作用，所以很好地降低了脂質(zhì)體的粒徑，提高了脂質(zhì)體的分散穩(wěn)定性；但隨著表面活性劑加入量的增加，其又與脂質(zhì)體微球產(chǎn)生一定的物理結(jié)合，連接在脂質(zhì)體微球上，使平均粒徑又向大粒子方向移動(dòng)。

2.1.6 葉酸質(zhì)量濃度的確定

保持總脂材質(zhì)量濃度20mg/mL，卵膽比4:1(m/m)，總脂材:表面活性劑10:3(m/m)，水相pH7.8，在制備溫度60℃下，以Tween-80為表面活性劑，制備葉酸質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的脂質(zhì)體，超聲4min后，按1.3.4節(jié)和1.3.5節(jié)方法分別測(cè)定葉酸脂質(zhì)體的包封率和平均粒度及粒度分布。

從圖5可以看出，當(dāng)葉酸質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí)，包封率最高(28.34%)，但是此時(shí)的載藥量較低；當(dāng)葉酸質(zhì)量濃度高于1.0mg/mL時(shí)，隨著葉酸質(zhì)量濃度的增大，包封率先升高后降低，最高點(diǎn)為25.14%(葉酸質(zhì)量濃度為1.5mg/mL)，可能是由于葉酸質(zhì)量濃度過高，超過了脂質(zhì)膜飽和限度，包封率降低。葉酸為小分子藥物，對(duì)平均粒度影響不大，但是本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是，葉酸質(zhì)量濃度2.0mg/mL時(shí)平均粒度較小。

2.1.7 水相pH值的確定

保持葉酸質(zhì)量濃度2mg/mL，總脂材質(zhì)量濃度20mg/mL，卵膽比4:1(m/m)，總脂材:Tween-80為10:3(m/m)，在制備溫度60℃，分別制備水相pH7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的脂質(zhì)體，超聲4min后，按1.3.4節(jié)和1.3.5節(jié)的方法分別測(cè)定葉酸脂質(zhì)體的包封率和平均粒度及粒度分布。

從圖6可以看出，pH值對(duì)包封率有較大的影響。隨著pH值的上升，包封率先升高后降低，在pH7.8有最大值(27.16%)，原因可能是隨著水相的堿性增大，葉酸的溶解性有了較好的改善，這樣就有更多的葉酸穿過脂質(zhì)膜的雙分子層進(jìn)入到囊材里面，從而在一定程度上提高了脂質(zhì)體的包封率。結(jié)果顯示，在pH7.8時(shí)，脂質(zhì)體平均粒度也較小。

2.2 制備葉酸脂質(zhì)體的正交試驗(yàn)結(jié)果

從表3可以看出，用薄膜水化法制備葉酸脂質(zhì)體時(shí)，對(duì)包封率影響最大的因素是制備溫度；其次是水相pH值；影響最小的是卵膽比。對(duì)平均粒度影響最大的因素是葉酸質(zhì)量濃度；其次是制備溫度；影響最小的是卵膽比。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)制備的脂質(zhì)體的平均粒度一般都在300～400nm之間，基本符合粒度要求，因此本實(shí)驗(yàn)主要以包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表4 葉酸脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性Table 4 Storage stability of folic acid liposomesnm

表3 葉酸脂質(zhì)體正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design layout and experimental results

從包藥量方面考慮，當(dāng)葉酸質(zhì)量濃度為1.4mg/mL，即加藥量為112mg時(shí)，包藥量為21.43mg；當(dāng)葉酸質(zhì)量濃度為1.5mg/mL和1.6mg/mL，即加藥量為120mg和128mg時(shí)，包藥量分別為15.33mg和24.23mg。考慮到制備經(jīng)濟(jì)性，在此實(shí)驗(yàn)中當(dāng)葉酸質(zhì)量濃度為1.4mg/mL(加藥量為112mg)時(shí)，具有較好的效果，與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得結(jié)論相符。

得出用薄膜水化法制備葉酸脂質(zhì)體的最優(yōu)制備配方為保持總脂材質(zhì)量濃度20mg/mL，當(dāng)制備溫度60℃、水相pH8.0、卵膽比5:1(m/m)、葉酸質(zhì)量濃度1.4mg/mL時(shí)包封率為30.36%，平均粒度為335.4nm。

2.3 葉酸脂質(zhì)體穩(wěn)定性的考察

從表4可以看出，用薄膜水化法制備的葉酸脂質(zhì)體具有較好的冷藏穩(wěn)定性，貯藏15d平均粒度變化不大。

3 結(jié) 論

以卵磷脂、膽固醇為膜材，葉酸為芯材，采用單因素考察和正交設(shè)計(jì)對(duì)薄膜水化-超聲法進(jìn)行制備工藝的優(yōu)化，得到的最佳工藝條件為保持總脂材質(zhì)量濃度20mg/mL、制備溫度60℃、水相pH8.0、卵膽比5:1(m/m)、葉酸質(zhì)量濃度1.4mg/mL，制得的脂質(zhì)體包封率為30.36%，平均粒度為335.4nm，且有較好的穩(wěn)定性。

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Preparation and Stability of Folic Acid Liposomes

TONG Gui-hong，LIU Cheng-mei*，LIU Wei，YANG Shui-bing，LIU Wei-lin，YIN Ting-ting，ZHENG Hui-juan
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The combination of thin film hydration and ultrasonic treatment was used to prepare folic acid liposomes with lecithin and cholesterol as the membrane material and folic acid as the core material. Dialysis-spectrophotometry method was applied to determine the encapsulation efficiency of folic acid liposomes. Based on a series of single-factor experiments, the optimal conditions for preparing folic acid liposomes were explored by orthogonal array design to be preparation temperature of 60 ℃, pH 8.0, the mass ratio between lecithin and cholesterol of 5:1, and folic acid concentration of 1.4 mg/mL. The prepared liposomes under these optimal conditions had an entrapment efficiency of 30.36% with an average particle size of 335.4 nm. The liposomal suspension was sealed in a bottle and stored at 4 ℃ for 15 days for stability evaluation based on measurement of average particle size, and the results indicated that the average particle size had no significant change, which was in the range of 300 to 400 nm,and that the suspension had a good stability.

folic acid；liposome；thin film hydration-ultrasonic method；encapsulation efficiency；stability

R944.1

A

1002-6630(2010)20-0178-05

2010-07-08

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z330)；國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200808)作者簡(jiǎn)介：童桂鴻(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭澄?含生物質(zhì))資源的開發(fā)與利用。

E-mail：tong19860927@126.com

*通信作者：劉成梅(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭澄?含生物質(zhì))資源的開發(fā)與利用。

E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn