甘肅省風疹病毒基因型分析

付 鴻，甄曉榮，陳 瑛，劉建鋒，趙曉虹

（甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730000）

甘肅省風疹病毒基因型分析

付 鴻，甄曉榮，陳 瑛，劉建鋒，趙曉虹

（甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730000）

目的了解甘肅省2009年風疹病毒的分子生物學特征，確定其基因型別。方法用Vero/Slam細胞從風疹暴發(fā)和散發(fā)患者的標本中分離風疹病毒，通過逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和序列測定與分析鑒定其基因型。結果甘肅省首次分離出的3株風疹病毒鑒定為1E基因型。與2株世界衛(wèi)生組織1E基因型的參考株（T14-CH-02株、M1-MAL-01株）形成了一個分支，均屬于1E基因型，核苷酸同源性為99%～100%。結論此次疫情是由1E基因型風疹病毒引起的暴發(fā)疫情，此項研究為以后甘肅省風疹病毒的分子流行病學研究奠定了基礎。

風疹病毒；序列分析；基因型

風疹是由風疹病毒引起的急性呼吸道傳染病，風疹病毒屬于披膜病毒屬，單鏈，正鏈RNA，只有一個血清型，人是其自然宿主。妊娠期婦女感染風疹病毒后，易引起嬰兒先天性風疹綜合征（CRS）。在托幼機構和中、小學校也常有風疹流行或暴發(fā)，危害青少年健康。目前，我國對風疹病毒的流行病學研究多集中在血清流行病學上，而對分子流行病學的研究相對較少。為做好發(fā)熱出疹性疾病的病原學診斷，了解2009年甘肅省風疹暴發(fā)或散發(fā)疫情的風疹病毒分子生物學特征，現(xiàn)將分離到的風疹病毒進行基因型分析。

1 材料和方法

1.1 資料與標本來源

資料來源于暴發(fā)和散發(fā)病例5個縣區(qū)甘肅省疾病預防控制中心（CDC）個案調查表及標本送檢表，血清、咽拭子標本來自5個風疹暴發(fā)和散發(fā)的縣區(qū)的22份標本。咽拭子標本冷藏送省CDC麻疹實驗室進行病毒分離，分離血清進行風疹IgM抗體檢測，22例患者的基本信息見表1。

1.2 麻疹、風疹IgM抗體檢測

用捕獲法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測患者血清中的麻疹和風疹IgM抗體。檢測采用廣東省珠海市海泰生物制藥公司生產(chǎn)的試劑盒，具體操作見試劑盒說明書。

1.3 風疹病毒分離方法

將處理后的標本液接種到長成單層的Vero/Slam細胞（非洲綠猴腎細胞/淋巴信號激活因子轉染的非洲綠猴腎細胞）上，35℃吸附1h加維持液。隨后在35℃培養(yǎng)，同時做好陰性細胞對照，盲傳3代后送國家麻疹實驗室進行風疹病毒鑒定[1]。

1.4 風疹病毒株的鑒定

將盲傳3代的14株可疑風疹病毒再鑒定，序列測定和基因定型在國家麻疹實驗室進行。國家麻疹實驗室提取風疹病毒的RNA，用特異的PCR引物擴增EI基因，對PCR陽性產(chǎn)物的核苷酸片段進行序列測定和分析。

表1 22例患者基本信息

1.5 序列分析

調出世界衛(wèi)生組織（WHO）參考株E1基因739個核苷酸序列，分別使用BioEdit7.0和MEGA3.0生物學軟件對甘肅省分離到的3株毒株和參考株進行基因親緣性關系分析和核苷酸變異分析。

2 結果

2.1 麻疹、風疹IgM抗體檢測結果

對采集的22份患者血清標本進行麻疹和風疹IgM抗體檢測。麻疹IgM抗體陰性；風疹IgM抗體10份陽性，可疑1份，11份陰性，但與實驗室確診的風疹病例有流行病學聯(lián)系。

2.2 病毒分離結果

咽拭子標本，在Vero/Slam細胞上盲傳3代后未見典型的細胞病變，收獲、凍存于-70℃冰箱備用。

2.3 基因型鑒定結果

14株風疹病毒經(jīng)RT-PCR檢測，有3株鑒定為陽性標本。通過擴增風疹病毒E1基因的739個核苷酸片段和序列測定，分析證實為1E基因型（見表2）。

表2 3株風疹病毒鑒定結果及命名

2.4 基因親緣關系和核苷酸變異分析

利用BioEdit7.0和MEGA3.0生物學軟件對甘肅省2009年分離的3株風疹病毒與WHO RV 13個基因型的32株參考株相對應的核酸片段構建基因親緣關系樹（見圖1）。此次在我省鑒定出的3株風疹病毒基因型與2株WHO 1E基因型的參考株（T14-CH-02株、M1-MAL-01株）形成了一個分支，均屬于1E基因型，核苷酸同源性為99%～100%。

3 討論

WHO建議將風疹和CRS的實驗室監(jiān)測納入麻疹實驗室網(wǎng)絡中，病毒分離主要用于開展分子流行病學研究，鑒定病毒基因型，識別病毒來源和確定傳播途徑。

我國尚未全面開展系統(tǒng)的風疹和CRS的監(jiān)測，但我省麻疹實驗室已于2004年開始將風疹的實驗室檢測整合到麻疹監(jiān)測中去，基于ELISA的風疹IgM抗體檢測已基本成熟，2009年我省首次開展了風疹病毒的實驗室分離工作。

圖1 甘肅省3株風疹病毒株與WHO基因型構建的基因親緣關系樹

隨著分子流行病學監(jiān)測手段的不斷發(fā)展與完善，我國已初步建立了風疹病毒毒株庫和基因數(shù)據(jù)庫。風疹病毒有3個重要的結構蛋白，分別為位于包膜上的E1和E2兩種糖蛋白，和位于殼體上的非糖化蛋白C[2，3]。E1與風疹的血凝血融有關，又具有中和抗原作用，其基因全長1484bp，編碼風疹大部分位于抗原表位，WHO將E1基因其中的739個核苷酸片段作為分子流行病學研究的序列[4，5]。根據(jù)我國1999～2002年對風疹病毒進行的分子流行病學研究，發(fā)現(xiàn)至少有4個基因型（1E、1F、2A、2B）曾在中國流行[6]。但近5年的研究表明[7]，1E基因型已取代其他基因型，逐漸成為RV優(yōu)勢流行基因型。

此次分離出的1E基因型是我省渭源縣風疹暴發(fā)疫情，也是由1E基因型風疹病毒引起，這與我國近年來主要流行的風疹病毒基因型相符，未發(fā)生顯著變異。此外，將我省此次鑒定出的風疹病毒基因型與近幾年相鄰省份（四川、寧夏、青海）[7，8]鑒定出的風疹流行病毒基因型比較，未發(fā)現(xiàn)明顯的時間與地理分布傾向。

我國在風疹的病毒學檢測方面還比較薄弱，而我省的檢測工作屬于起步階段，此次研究為甘肅省風疹病毒的分子流行病學研究奠定了良好基礎，為今后風疹病毒檢測，建立甘肅省風疹病毒毒株庫和基因數(shù)據(jù)庫，鑒定甘肅省風疹病毒的傳播源和傳播鏈提供了科學依據(jù)。

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