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    遼東木對一次力竭小鼠血淋巴細胞DNA損傷的影響

    2010-10-26 00:56:36張孟紅李淑平杜曉萍
    沈陽體育學院學報 2010年2期
    關鍵詞:力竭自由基淋巴細胞

    張孟紅,李淑平,杜曉萍

    (1.沈陽大學 體育學院,遼寧沈陽110044;2.韓山師范學院 體育系,廣東 潮州521041;3.沈陽體育學院運動人體科學系,遼寧沈陽110102)

    張孟紅1,李淑平2,杜曉萍3

    (1.沈陽大學 體育學院,遼寧沈陽110044;2.韓山師范學院 體育系,廣東 潮州521041;3.沈陽體育學院運動人體科學系,遼寧沈陽110102)

    目的:急性運動可引起氧自由基產生增加,從而導致機體一系列病理損傷。通過給小鼠補充遼東木根皮提取物,5周后進行急性一次力竭運動,觀察運動源性自由基對血淋巴細胞DNA的損傷情況以及血清丙二醛(MDA)含量、血清超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的變化,探討遼東木對一次性力竭性運動后機體自由基代謝的影響。方法:昆明種小鼠64只,隨機分為四組:正常對照組(NC組)16只、運動對照組(EC組)16只、運動+遼東木組(EA組)16只,運動+人參組(EP組)16只、除正常對照組外,其他各組小鼠于最后一次灌胃后,次日晨進行一次力竭游泳運動后,取樣。采用單細胞凝膠電泳法、硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法分別測定血液淋巴細胞DNA的損傷、血清MDA的含量、血清SOD和GSH-Px的活性。結果:(1)與NC組相比,EC組大鼠血清MDA含量顯著增加(p<0.01),血清SOD和GSH-Px活性顯著下降(p<0.01)。與EC組相比,EA組大鼠血清MDA含量顯著下降(p<0.01),血清SOD和GSH-Px活性顯著增高(p<0.01);EP組大鼠血清MDA含量顯著下降(p<0.01),血清SOD和GSH-Px活性顯著增高(p<0.01)。(2)與NC組相比,EC組大鼠血液淋巴細胞尾長(Tail length)、尾矩(Tail moment)及橢圓矩(Olive moment)顯著增加(p<0.01)。與 EC組相比,EA組大鼠血液淋巴細胞Tail length、Tail moment、Olive moment顯著降低(p<0.01);EP組大鼠血液淋巴細胞尾長、尾短和橢圓矩顯著降低(p<0.01)。結論:1)遼東木可以提高小鼠血清SOD、GSH-Px的活性,降低血清MDA的含量,減少OH·等對DNA的直接損傷。2)遼東木對一次力竭運動導致的小鼠血液淋巴細胞DNA的損傷具有保護作用,與人參的作用效果相類似。

    遼東木;力竭,淋巴細胞;DNA

    近年來,有關活性氧的產生及其對生物分子的損傷機理研究受到運動醫(yī)學界的普遍重視。許多疾病與活性氧的參與有密切關系,尤其是羥自由基(OH·),作為最活潑的活性氧自由基并沒有專門的清除酶,它與任何生物分子都以極快的反應速率發(fā)生反應。雖然OH·對蛋白質、脂質、糖類等均可引起不同程度的損傷,但其對DNA的氧化損傷及其與疾病的關系越來越受到科學界更廣泛地關注。已有的研究結果直接或間接證明了急、慢性運動可引起氧自由基的增加,過多的自由基對細胞及亞細胞器的生物膜進行攻擊,從而造成了機體一系列病理損傷。本文通過給小鼠補充遼東木,服藥5周后進行一次力竭運動,觀察急性運動后運動源性自由基對血淋巴細胞DNA的損傷情況以及血清MDA含量、血清SOD和GSH-Px活性的變化,探討遼東木對力竭性運動后機體自由基代謝及對其的影響,為探討消除運動性疲勞的手段,為遼東木在訓練、比賽中的應用及消除運動疲勞中的作用提供理論和實驗依據(jù)。

    1 實驗材料與方法

    1.1 實驗對象

    實驗用雄性昆明種小鼠64只,體重18g左右,由沈陽市雙義實驗動物研究所提供,合格證號:SCXK(遼)2003-0012。

    常規(guī)分籠飼養(yǎng),環(huán)境溫度為(23±3)℃,相對濕度為70%~80%。每天定時通風,自由飲水,飼料由沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供。每日記錄飲食量、體重、清洗飲水器,隔日清洗、消毒籠具,更換墊料,每周室內消毒兩次[1]。

    1.2 藥物

    1.3 實驗設計

    根據(jù)隨機設計原則,將實驗小鼠按體重分層,隨機分為五組,分組情況如下:

    運動對照組和運動+服藥組小鼠于最后一次灌胃后,次日晨進行一次力竭游泳運動。玻璃池規(guī)格:100×60×70,水溫(34±2)℃,每天光照12h,水深45cm,約為小鼠身長的3倍[1,2]。記錄小鼠力竭時間,力竭判斷的標準為:小鼠頭下沉10s不上浮,放在平面上無法完成翻正反射[3]。

    1.4 主要試劑與儀器

    1)主要試劑:MDA、SOD、GSH-Px試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

    2)主要儀器:DYCP-38B型水平電泳槽(北京市六一儀器廠);VANOX型OLYMPUS熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);LUCIA Ver 4.71彗星實驗分析軟件系統(tǒng)(捷克Laborato ry Imaging公司);721分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

    1.5 實驗方法

    力竭游泳運動結束后,隨機剔除多余小鼠,每組保留8只,取樣測定。

    1.5.1 血清的制備及血清MDA含量、SOD和 GSH-Px活性的測定 采用眼眶取血方法,把血樣置于無抗凝劑的離心管中,于4℃靜置使其充分凝固,以3 500轉/分鐘的轉速離心 15min,取上清液備用[1、2]。血清 MDA含量和總 SOD(TSOD)活性測定,嚴格按照試劑盒的程序進行。

    1.5.2 小鼠血液淋巴細胞 DNA損傷的測定[4-6]避光條件下,采用眼眶取血法,取0.2 ml全血放入肝素抗凝管,用不含鈣、鎂的磷酸鹽緩沖液 (PBS)等量稀釋,輕輕混勻后,備用。

    ①制片;②細胞裂解;③DNA堿解旋;④電泳;⑤中和和染色;⑥閱片。

    EB染色后的樣本應盡快在熒光顯微鏡下觀察電泳圖像。在熒光顯微鏡下,DNA被染成紅色,若沒有發(fā)生DNA斷裂,無DNA斷片,則從頭向陽極遷移的細胞只有一個圓形的熒光頭;發(fā)生了DNA斷裂的細胞則表現(xiàn)為斷片離開頭部向陽極方向遷移,形成一個像彗星樣的拖尾。每個樣本隨機觀察40個細胞,使用LUCIA軟件分析。

    1.6 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據(jù)采用SPSS10.0數(shù)據(jù)軟件包進行處理,采用平均數(shù)±標準差(珋xSD)表示,組間采用單因素方差分析判斷總體顯著性差異,顯著性水平定在p<0.05和p<0.01。

    2 結果

    2.1 一次力竭運動后各組小鼠血清MDA含量、SOD和GSH-Px活性的變化

    與NC組相比,EC組小鼠血清MDA含量顯著增加(p<0.01);血清 SOD和 GSH-Px活性顯著下降(p<0.01)。與EC組相比:EA組小鼠血清MDA含量顯著下降(p<0.01),血清SOD和GSH-Px活性顯著增高(p<0.01);EP組小鼠血清MDA含量顯著下降(p<0.01),血清SOD和GSH-Px活性顯著增高(p<0.01)。與EP組相比,ECM和EA組小鼠血清MDA含量、SOD和GSH-Px的活性均無顯著性差異(表1)。

    2.2 一次力竭運動后各組小鼠血液淋巴細胞DNA損傷的情況

    本試驗采用單細胞凝膠電泳法檢測血液中單個淋巴細胞DNA的損傷情況,通過尾長、尾矩、橢圓矩[7]等指標來反映DNA的損傷情況。

    尾長(Tail length),即沿電泳方向“彗星”尾部最遠端與頭部中心間的距離[8],是損傷DNA碎片的遷移長度,在低損傷劑量范圍內與損傷劑量成線性關系。當損傷因素作用劑量大到一定程度時,DNA損傷程度明顯增加而尾長基本不變。尾矩(Tail moment)是指尾部DNA占總DNA的百分比與頭、尾部中心間距的乘積[9]。橢圓矩(Olive moment)是以“彗星”頭部中心點為零點,沿電泳方向將“彗星”按一定的間隔分成若干個區(qū)域(80個即可),分別測定每個區(qū)域熒光強度(Di,代表該區(qū)域DNA量)、該區(qū)域中心距零點的距離(Xi)、“彗星”總熒光強度(Dt,代表總 DNA量),則橢圓矩定義為 Σ(Di×Xi)/Dt[10]。由于定義尾矩時,將“彗星”尾部當作一個整體考慮,將頭尾部中心間距當作損傷DNA的平均遷移距離。但事實上尾部DNA的分布并不均勻,所以橢圓矩與作用劑量間的相關性比尾矩更密切。

    由表2可知,與NC組相比,EC組小鼠血液淋巴細胞的Tail length、Tail moment和 Olive moment顯著增高(p<0.01)。與 EC組相比:EA組小鼠血液淋巴細胞的 Tail length、Tail moment、Olive moment顯著降低(p<0.01);EP組小鼠血液淋巴細胞的 Tail length、Tail moment、Olive moment顯著降低(p<0.01)。與EP組相比,EP組小鼠血液淋巴細胞的 Tail length、Tail moment、Olive moment均無顯著性差異。

    表2 一次力竭運動后各組小鼠血液淋巴細胞DNA損傷情況

    2.3 小鼠血液各指標的相關分析

    由表3可知,血液淋巴細胞的Tail length、Tail moment和Olive moment與血清MDA含量顯著正相關(p<0.01)。血液淋巴細胞的Tail length、Tail moment和 Olive moment與血清SOD活性顯著負相關(p<0.01)。血液淋巴細胞的Tail length、Tail moment和 Olive moment與血清 GSH-Px活性顯著負相關(p<0.01)(表3)。

    表3 小鼠血液各指標的相關分析

    3 分析與討論

    3.1 一次力竭運動對小鼠血清自由基代謝、血液淋巴細胞DNA的影響

    3.1.1 一次力竭運動對小鼠血清自由基代謝的影響 自由基(free radical)是指外層軌道上含有未配對電子的分子、原子、離子等物質。在生物體內主要是指氧自由基。在生命活動全過程中,時時伴有內源性自由基的不斷產生和不斷清除,正常情況下,體內的自由基保持在低濃度的動態(tài)平衡中,對機體不會造成傷害,但在特殊情況下,如大強度或力竭運動會使體內自由基生成增多而抗氧化酶活性相對不足,結果導致體內大量的自由基堆積并對機體產生損傷作用。它的毒性作用主要是直接損傷細胞膜,使細胞膜磷脂結構內多不飽和脂肪酸(PUFA)發(fā)生脂質過氧化反應,也使具有膜結構的內質網(wǎng)膜、溶酶體膜、線粒體膜等生物膜系統(tǒng)的結構和功能發(fā)生改變,導致細胞的廣泛性損傷[11]。

    丙二醛(MDA)是機體內脂質過氧化的代謝產物,其含量可以間接反映運動時自由基的生成。目前對運動后血液MDA含量變化的報道不盡一致。普遍認為,血液MDA含量不僅與運動的模式、強度及持續(xù)時間有關,還與脂質過氧化物產生與消除的動態(tài)平衡有關。有報道,一次急性運動后血漿MDA含量明顯增加;在極量和亞極量負荷運動下血漿MDA的含量均比安靜時顯著地增加,且極量負荷運動后,MDA含量也非常明顯地高于亞極量負荷運動后[12-16]。但也有不同報道,倪耀華發(fā)現(xiàn)以30%和70%最大攝氧量的強度踏車至力竭時,血漿中MDA含量較安靜時顯著增加,但以90%最大攝氧量的強度運動至力竭時卻未發(fā)現(xiàn)MDA含量有顯著變化[17]。

    本實驗發(fā)現(xiàn)一次力竭運動后,與正常對照組相比,運動對照組小鼠血清MDA含量顯著增加,運動后血液MDA含量增加的原因可能是:急性運動中,線粒體氧利用率增加,為氧的單電子還原提供了可能。另外在氧運輸過程中,血紅蛋白和肌紅蛋白自動氧化成高鐵血紅蛋白和高鐵肌紅蛋白過程中也可以產生自由基。

    急性運動中組織相對缺氧和無氧代謝加強也是自由基產生增加的一個重要原因,在正常生理情況下,嘌呤核昔酸進行合成和分解,黃嘌呤脫氫酶催化黃嘌呤與NAD十結合生成尿酸和NADH,不產生自由基。缺氧時細胞內ATP分解加劇,AMP劇增,進一步使黃嘌呤、次黃嘌呤生成增加.同時細胞內Ca2+濃度增高激活鈣依賴性蛋白酶,黃嘌呤脫氫酶在此酶的作用下轉化成黃嘌呤氧化酶,激活的黃嘌呤氧化酶作用于黃嘌呤、次黃嘌呤便可使O2還原成O-2,并從而激發(fā)一系列的自由基反應.另外機體缺氧,乳酸生成增多,并在體內堆積乳酸的還原使胞漿NADH、NADPH濃度下降,體內自由基抗氧化酶受破壞,不足以清除生成增加的自由基[11]。

    其他組織器官的氧化應激產物釋放入血。關于急性運動后骨骼肌、肝臟、心肌、腎臟自由基產生已有大量的直接和間接證據(jù),并且已經證實,疲勞組織中產生的OFR可以在細胞外檢測到[18,19]。

    超氧化物歧化酶(SOD)是唯一以氧自由基為底物的酶類,胞漿中的CuSOD、ZnSOD等可以催化O-2·歧化為H2O2和O2,從而起到清除O-2·的作用,而MnSOD可以清除線粒體中80%以上的O-2·;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)可以分解過氧化氫及有機過氧化物,將其還原為H2O和無毒醇類[11]。

    運動對血液超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的影響,目前的研究結果尚存在分歧。楊陽等報道小鼠游泳力竭后即刻血液中SOD、GSH-Px活性顯著下降;吳宏軍等發(fā)現(xiàn)小鼠爬桿力竭運動后即刻血漿SOD活性明顯下降;王東輝等報道小鼠游泳力竭后即刻、6小時及24小時后,血清GSH-Px活性均顯著低于對照組[20-22]。但一些報道認為,運動可導致血液SOD,GSH-Px活性增強。運動強度愈高,SOD、GSH-Px活性增高愈明顯,認為運動導致其活性增高是機體適應的結果。這些研究結果的不一致,可能與運動方式、運動強度和運動持續(xù)時間等有關[23-24]。

    本實驗發(fā)現(xiàn)次力竭運動后,與正常對照組相比,運動對照組小鼠血清SOD、GSH-Px活性顯著下降。出現(xiàn)這種變化的原因可能是:運動后血液中的氧自由基顯著增加,血液中的抗氧化酶絕對或相對不足,而且氧自由基的還原產物H2O2對SOD本身也有殺傷作用[11]。

    3.1.2 一次力竭運動對小鼠血液淋巴細胞DNA的影響

    運動造成的細胞DNA損傷與運動強度、運動方式等有關[25]。有學者[26]選用12個健康的受試者做了一次大運動量的自行車訓練實驗,實驗后將淋巴細胞分離出來做DNA鏈斷裂的分析,發(fā)現(xiàn)在高原低氧環(huán)境中DNA的斷裂程度在運動后即刻增加;但在海平面的運動后卻沒有發(fā)現(xiàn)有DNA斷裂的現(xiàn)象。Hartmann A[27]等研究發(fā)現(xiàn)受試者在功率自行車上跑步直到力竭,運動后24小時取血樣,在所有的受試者血樣中都可見到明顯的白細胞的DNA鏈斷裂。

    本實驗發(fā)現(xiàn):一次力竭運動后,運動對照組與正常對照組相比,反映小鼠血液淋巴細胞 DNA損傷的指標(Tail length、Tail moment和 Olive moment)顯著增加,且與血清MDA含量顯著正相關,與血清SOD、GSH-Px活性顯著負相關,這與前人研究結果相一致[28]。其原因可能是:一次力竭運動后,機體自由基大量產生,超過SOD、GSH-Px的防御能力。O-2·雖然不直接作用于DNA,但O-2·通過超氧化物歧化酶(SOD)的作用可產生H2O2,當H2O2不能被及時清除時,H2O2可進一步通過反應產生活性更高的OH·,OH·中極為活潑的單電子容易與親核性的DNA分子結合,OH·可與脫氧核糖反應,產生核糖自由基,后者進一步導致堿基從DNA上脫落下來,甚至造成DNA鏈斷裂。脂質過氧化物可以同樣的方式造成DNA損傷。斷裂的DNA鏈需要不斷進行修復,而參與DNA修復的酶也同時會受到自由基的攻擊而影響其功能的發(fā)揮[29,30]。

    運動訓練或體育健身引起疲勞后,如果不采取有效措施予以消除,不僅會影響運動訓練和體育健身,還有可能引起病理性變化,使身體健康受到損害。由此可見,研究運動疲勞產生的機制對于減輕和消除運動性疲勞,促進身體健康是有重要意義的。

    隨著自由基研究不斷深入,已明確羥自由基是最活潑的氧自由基之一,可介導機體組織脂質過氧化,蛋白質解聚、聚合、核酸斷裂和多糖裂解等生化過程,引發(fā)組織細胞病變而導致各種疾病發(fā)生和加速機體衰老。已有的研究結果直接或間接證明了急、慢性運動可引起氧自由基的增加,從而造成了機體一系列病理損傷。適量補充外源性清除羥自由基藥物,可預防這類損傷和病變的發(fā)生與發(fā)展[31]。

    人參莖葉提取物抗自由基、抗脂質過氧化的作用已被證實[39,40]。本試驗發(fā)現(xiàn)一次力竭運動后,與運動對照組相比,人參組小鼠血清MDA含量顯著下降,血清SOD和GSH-Px活性顯著增高,這與有關的報道相一致[3]。蟲草和遼東木組與人參組相比,血清MDA含量、SOD及GSH-Px活性均沒有顯著性差異,提示北蟲草和遼東木具有與人參類似的抗氧化作用。

    有關人參莖葉提取物對遺傳物質損傷的保護作用已有報道[41],但對運動后血液淋巴細胞DNA損傷的保護作用的研究尚未見報道。本試驗觀察了人參莖葉提取物對一次力竭運動后小鼠血液淋巴細胞DNA損傷的影響,發(fā)現(xiàn)人參組小鼠反映血液淋巴細胞DNA損傷的指標:Tail length、Tail moment、Olive moment均顯著降低,說明人參莖葉提取物對此運動造成的血液淋巴細胞DNA損傷起到了一定的保護作用。與人參組相比,遼東木組反映DNA損傷的指標均沒有顯著性差異,提示遼東木對一次力竭運動小鼠血液淋巴細胞DNA損傷的保護作用與人參的作用相類似。

    4 結論

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    [40]梁華平,王正國,田豐群,等.黃芪多糖、人參莖葉皂甙對創(chuàng)傷小鼠淋巴細胞膜流動性及脂質過氧化作用的影響[J].中國中藥雜志,1995,20(9):558-561.

    [41]朱玉琢,邢沈陽,龐慧民,等.人參莖葉總皂甙對小鼠遺傳物質損傷的保護作用[J].白求恩醫(yī)科大學學報,1994,20(4):340-342.

    Effect of Aralia Elata on DNA Damage of Lymphocyte in Blood of Mouses After Exhaustive Exercise

    ZHANG Menghong1,LI Shuping2,DU Xiaoping3
    (1.Physical Education Institute of Shenyang University,Shenyang 110044,Liaoning,China;2.Department of Physical Education,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,Guangdong,China;3.Department of Human Exercise Science,Shenyang Sport University,Shenyang 110102,Liaoning,China)

    Objective:Free radical will increase after acute exercise,which will induce some damage in economy.This article was to observe that exhaustive exercise harms the DNA of lymphocyte and whether Aralia elata has a role in protecting the DNA damage of lymphocyte after exhaustive exercise,in order to provide the experimental evidences for Aralia elata stav ing and eliminating exercise induced fatigue.Methods:Eighty mouses were divided into 4 groups at random:normal con trast group(NC,n=16),exercise contrast group(EC,n=16),exercise and take Aralia elata group(EA,n=16),exercise and take Panax ginseng group(EP,n=16).We adopted exhaustive exercise.For making sure there were 8 rats in every group,the authors eliminated the superabundance rats randomly after the exercise.The rats were sacrificed and sampled af ter exercise.Measured the DNA damage of lymphocyte,malondialdehyde(MDA)content,superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH Px)activities in serum of rats by SCGE,TBA,XO and DTNB methods.Results:(1)Compared with NC group,the MDA content increased remarkably(p<0.01),the SOD and GSH Px activities in serum of rats decreased markedly in EC group(p<0.01).Compared with EC group,the MDA content decreased remarkably(p<0.01),the SOD and GSH Px activity in serum of rats increased markedly(p<0.01)in EA group;the MDA content de creased markedly(p<0.01),the SOD and GSH Px activities in serum of rats increased remarkably in EPgroup rats(p<0.01).(2)Compared with NC group,Tail length,Tail moment and Olive moment of lymphocyte increased observably in EC group rats(p<0.01).Compared with EC group,Tail length,Tail moment and Olive moment in EA group rats de creased markedly(p<0.01);there were an obvious decrease in Tail length,Tail moment and Olive moment(p<0.01)in EPgroup rats.Conclusion:(1)Aralia elata can eliminate the free radicals,enhance the SOD and GSH Px activities in ser um of rats and reduce the damage of DNA caused by OH· etc.(2)Aralia elata can attenuate exercise induced DNA dam age after exhaustive exercise.The function is similar with Panaxginseng.

    Aralia elata;exhaustive exercise;lymphocyte;DNA damage

    G804.7

    A

    1004-0560(2010)02-0080-05

    2010-02-12;

    2010-03-05

    遼寧省教育廳科學技術研究項目:不同中藥提取物對運動訓練鼠腦組織代謝和調節(jié)的實驗研究,編號:2009A670。

    張孟紅(1963-),女,副教授,學士,主要研究方向為體育教學與體育健康促進。

    責任編輯:喬艷春

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