溶膠-凝膠血紅蛋白電化學(xué)傳感器的研制

武五愛,郭滿棟,高寶平

(山西師范大學(xué)化學(xué)系,山西臨汾041004)

溶膠-凝膠血紅蛋白電化學(xué)傳感器的研制

武五愛,郭滿棟＊,高寶平

(山西師范大學(xué)化學(xué)系,山西臨汾041004)

運(yùn)用溶膠-凝膠技術(shù)將血紅蛋白(Hb)固載于玻碳電極(GC)表面,制得 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極,找出了制備 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的最佳實(shí)驗(yàn)條件,建立了一種測(cè)定過氧化氫的新的、靈敏的方法.同時(shí)對(duì)該電極與過氧化氫的作用機(jī)理進(jìn)行了探討.

血紅蛋白;溶膠-凝膠;生物傳感器;修飾電極

血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)是體血液中紅細(xì)胞的主要成分,盡管其不具備傳遞電子的功能,但由于它具有別構(gòu)效應(yīng)且對(duì)其結(jié)構(gòu)已有較清楚的認(rèn)識(shí)以及價(jià)廉易得,常常被選作探討生物大分子電化學(xué)行為的理想模型物,國(guó)內(nèi)外研究者對(duì) Hb的結(jié)構(gòu)與功能、電化學(xué)行為、小分子及金屬離子與 Hb的相互作用等方面進(jìn)行了大量的研究[1-4].近年來,人們發(fā)現(xiàn)溶膠-凝膠材料是一類非常適合于固定生物試劑的基質(zhì)材料[5-9].凝膠過程通常在溫和的條件下進(jìn)行,可以很大程度地保持酶等生物物質(zhì)的功能和活性[10-11].利用溶膠-凝膠技術(shù)固定各種生物試劑基質(zhì)材料,制成的生物傳感器具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)[12-15].作者采用硅溶膠-凝膠技術(shù)制備了溶膠-凝膠固載血紅蛋白的直接電化學(xué)傳感器,找出了制備的最佳條件,并用多種方法對(duì)其電化學(xué)行為進(jìn)行了研究.結(jié)果表明 Hb在膜中能夠保持良好的生物活性和催化性質(zhì),且電極具有穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好,制備方法簡(jiǎn)便易行的優(yōu)點(diǎn).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

正硅酸乙酯(TEOS,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);十六烷基三甲基溴化銨(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠),牛血紅蛋白(Hemoglobin,國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司);其他試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

L K98BⅡ微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng)(天津蘭力科化電子高技術(shù)有限公司);KQ-50超聲洗滌器(上海超聲儀器廠);UV-2201(日本島津);p HS-3C型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠).玻碳電極:直徑d=2 mm(工作電極);鉑絲電極(輔助電極);Ag/AgCl(飽和 KCl)電極(參比電極).

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 玻碳電極的處理

將玻碳電極用氧化鋁粉拋光,在二次水和無水乙醇中分別超聲洗滌5 min,并重復(fù)3次,然后進(jìn)行電化學(xué)活化處理,即在0.5 mol/L的 H2SO4中于-0.3 V～1.5 V進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描,直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng).

1.2.2 儲(chǔ)備液的配制

血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)儲(chǔ)備液:稱取50 mg牛血紅蛋白,用水稀釋,并定容至10 mL的容量瓶中,避光4℃保存,使用時(shí)逐級(jí)稀釋.

溶膠-凝膠儲(chǔ)備液:在室溫下將1 mL正硅酸乙酯,0.2 mL 0.1 mol/L的HCl和3 mL水、10 mL乙醇混合于20 mL密封瓶中,超聲震蕩30 min,至形成均一溶膠液,密封存放于陰暗處.

表面活性劑儲(chǔ)備液:稱取0.25 g十六烷基三甲基溴化銨,加10 mL乙醇溶解,用水定容至25 mL,密封保存.

1.2.3 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的制備

取配制好的溶膠-凝膠儲(chǔ)備液和表面活性劑儲(chǔ)備液各1 mL,攪拌均勻后加入0.5 mL血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)儲(chǔ)備液,置于一密閉容器中超聲震蕩5 min,使其分散均勻.吸取8μL該溶液,均勻涂敷在玻碳電極表面,置于4℃冰箱中干燥10 h以上,即可制得 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極.該電極不用時(shí)可將其置于鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H=6)中并放入4℃冰箱中保存.相同條件下制備Sol-Gel/GC電極作為比較電極.

1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用三電極體系:Ag/AgCl(飽和 KCl)電極為參比電極、鉑絲為輔助電極、Hb/Sol-Gel/GC修飾電極為工作電極;緩沖液為鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H=6).實(shí)驗(yàn)時(shí)先向溶液中通氮?dú)?0 min,并保持緩沖液在實(shí)驗(yàn)過程中的氮?dú)鈿夥?

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極的電化學(xué)行為

2.1.1 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的循環(huán)伏安行為

將干燥后的 Hb/Sol-Gel/GC電極從冰箱中取出,在空氣中放置不同時(shí)間后放入鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H=6)中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(掃描范圍 -1.5 V～0.4 V,掃速為100 mV/s),如圖1所示.圖中曲線1為從冰箱中取出立即掃描所得曲線,可以看出在-0.450 V附近有一不可逆還原峰;隨著電極在空氣中放置時(shí)間的增加,發(fā)現(xiàn)在-0.450 V處還原峰逐漸消失,而在-0.891 V處有一新的不可逆還原峰出現(xiàn),且隨放置時(shí)間延長(zhǎng)峰電流逐漸增大,在60 min后逐漸趨于穩(wěn)定(曲線4);在溶液中加入1×10-5mol/L過氧化氫后-0.891 V處還原電流又顯著上升(曲線5).而在相同條件下的Sol-Gel/GC修飾電極和裸電極上沒有明顯還原峰出現(xiàn)(曲線2,曲線3).

2.1.2 Hb和Sol-Gel的紫外-可見吸收光譜

用紫外-可見吸收光譜考察了 Hb在溶膠-凝膠溶液中的吸收曲線,結(jié)果如圖2所示.其中圖2a為溶膠-凝膠溶液的Soret吸收帶曲線,圖2b為 Hb的Soret吸收帶曲線,圖2c為 Hb在溶膠-凝膠溶液中的Soret吸收帶曲線,通過比較可以看出血紅蛋白在溶膠-凝膠中能夠保持良好的生物活性和催化性質(zhì),沒有發(fā)生變性.

圖1 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的循環(huán)伏安行為Fig.1 Cyclic voltammograms of Hb/Sol-Gel/GC modified electrode after different placed time

圖2 Sol-Gel和 Hb的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of Sol-Gel and Hb

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 H2O與 TEOS的體積比對(duì)成膜性質(zhì)的影響

H2O與 TEOS體積比是一個(gè)重要參數(shù),直接與水解縮聚物的結(jié)構(gòu)和溶膠的黏度和凝膠的時(shí)間有密切關(guān)系.較低的比值使Sol-Gel膜表面形成一些小的團(tuán)聚,很難形成均一的薄膜,而且這樣形成的Sol-Gel膜非常容易開裂.過高的比值使Sol-Gel膜表面的團(tuán)聚過大,以至于血紅蛋白很容易從表面上流失.為防止干燥過程較長(zhǎng)產(chǎn)生較大的收縮張力,本實(shí)驗(yàn)制備Sol-Gel溶液時(shí) H2O與 TEOS的最佳體積比為3∶1.

2.2.2 表面活性劑濃度對(duì)成膜性質(zhì)的影響

在構(gòu)建Sol-Gel膜的過程中,表面活性劑是一個(gè)非常重要的因素.因?yàn)槟z中包裹著大量的溶劑和水,當(dāng)它們從小孔中蒸發(fā)時(shí),由于液體的表面張力造成的應(yīng)力差易導(dǎo)致凝膠的開裂.表面活性劑由于揮發(fā)性低,吸附于電極表面能把不同孔徑中醇的不均勻蒸發(fā)大大降低,有效地減少內(nèi)部應(yīng)力和表面張力,從而避免膜的開裂,并能夠改善溶膠-凝膠表面的團(tuán)聚現(xiàn)象.

本實(shí)驗(yàn)中采用不同濃度的十六烷基三甲基溴化銨為表面活性劑進(jìn)行各種對(duì)比實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明當(dāng)十六烷基三甲基溴化銨濃度為1 g/L,并與所配Sol-Gel溶液及 Hb溶液(或水)以體積比1∶1∶0.5混合時(shí)所制膜最穩(wěn)定,不易開裂,且 Hb峰電流響應(yīng)最好.

2.2.3 Hb在電極上的固載量對(duì)峰電流的影響

在其他條件固定的情況下,通過計(jì)算研究了玻碳電極(d=2 mm)上 Hb固載量對(duì)峰電流的影響,結(jié)果如圖3所示,由圖3可看出,隨著 Hb固載量的增加,還原峰電流逐漸增大.但當(dāng)固載量超過1.6μg時(shí)峰電流呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這是由于當(dāng)Hb固定量過大時(shí),使包埋Hb的環(huán)境發(fā)生改變,電極表面的分布趨于復(fù)雜,膜的厚度也隨之增加,降低了電子的傳遞能力,從而造成了電極響應(yīng)電流有下降的趨勢(shì).因此本實(shí)驗(yàn)選1.6μg為Hb在電極上的最佳固載量.

2.2.4 測(cè)定介質(zhì)對(duì)峰電流的影響

研究了Hb/Sol-Gel/GC電極分別在不同緩沖溶液如磷酸鹽緩沖溶液、Tris緩沖溶液以及鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H調(diào)至約6、掃速100 mV/s)中的電化學(xué)行為,結(jié)果發(fā)現(xiàn) Hb/Sol-Gel/GC電極在三種緩沖溶液中均表現(xiàn)為不可逆還原,且在鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中電流響應(yīng)最大,峰電流最高.故選擇鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液為支持電解質(zhì).

2.2.5 掃描速率對(duì)峰電位的影響

研究了掃描速率對(duì)-0.891 V處峰電位的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),還原峰電位 E(V)隨掃描速率v(V/s)的增大而負(fù)移.在0.005 V/s～0.7 V/s范圍內(nèi),E與lgv的線性方程為 E =0.062 2 lgv+1.126 7(R2=0.992 8),從曲線的斜率[0.5×2.303R T×(anF)-1],可得αn=0.475,取α=0.5,可計(jì)算得 n≈1;由此可見該峰為1電子不可逆的還原峰.

2.2.6 p H對(duì)峰電位、峰電流的影響

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,用循環(huán)伏安法研究了不同酸度對(duì)-0.891 V處還原峰電流的影響,結(jié)果見圖4.由圖4可以看出,當(dāng)p H ≤6時(shí),傳感器的響應(yīng)電流隨著p H值的增加而增大,而當(dāng)p H過大時(shí)峰電流又逐漸減小,這主要是因?yàn)檠t蛋白的活性依賴于p H范圍(正常人體生理范圍為6～8.5),過低或過高的p H降低了血紅蛋白的活性.因此,選p H=6作為本實(shí)驗(yàn)的最適p H.

實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了p H在4～8范圍內(nèi)酸度對(duì)-0.891 V處峰電位的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著p H的增大,還原峰電位正移,表明電極反應(yīng)中有質(zhì)子參與.并根據(jù)公式dEp/dp H=0.059X/n(式中 X為質(zhì)子數(shù),n為電子數(shù)),求得 X≈1.

圖3 Hb固載量與峰電流的關(guān)系Fig.3 Relation between Hb quantity and peak current

圖4 p H對(duì)峰電流的影響Fig.4 Effects of p H on peak current

2.3 電極機(jī)理反應(yīng)探討

結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,本文對(duì)血紅蛋白在 Hb/Sol-Gel/GC電極上的電化學(xué)行為進(jìn)行了詳細(xì)探討,得出以下結(jié)論:

Hb/Sol-Gel/GC電極先后在-0.450 V和-0.891 V處產(chǎn)生的還原峰是由包埋在修飾物中的 Hb產(chǎn)生,且由于電極表面有機(jī)介質(zhì)和表面活性劑的影響,電子轉(zhuǎn)移的可逆性受到抑制,為不可逆過程;而-0.450 V處還原峰的消失和-0.891 V處還原峰的出現(xiàn)則是由于Hb具有別構(gòu)效應(yīng),高親氧態(tài)(R態(tài),0.450 V處)與低親氧態(tài)(T態(tài),0.891 V)間的構(gòu)象轉(zhuǎn)變[16-17]:

在-0.891 V處產(chǎn)生還原峰電流,是由于Hb Fe heme(T)中一個(gè)血紅素輔基在電化學(xué)驅(qū)動(dòng)下被溶液中殘氧氧化,發(fā)生一個(gè)電子轉(zhuǎn)移:

在加入過氧化氫后-0.891 V處還原電流顯著上升,則是Hb Fe(T)中一個(gè)血紅素輔基在電化學(xué)驅(qū)動(dòng)下被 H2O2氧化所導(dǎo)致:

實(shí)驗(yàn)表明,將使用過的Hb/Sol-Gel/GC電極懸置在緩沖溶液中一段時(shí)間(約30 min)可發(fā)現(xiàn)其又恢復(fù)至初態(tài),體現(xiàn)了較好的重復(fù)性.其反應(yīng)機(jī)理可能是:

2.4 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是衡量電極實(shí)用性的重要指標(biāo).因此,我們考察了 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極與其還原電流在緩沖溶液中保存時(shí)間的關(guān)系.結(jié)果發(fā)現(xiàn),將 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極密封懸置在鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(p H=6)中,在4℃冰箱中保存23天,其峰電流僅下降12%,表明電極是比較穩(wěn)定的.

2.5 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極對(duì) H2O2的響應(yīng)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,用方波伏安法(電位范圍:-0.4～ -1.2 V,電位增量50 mV,方波頻率5Hz,方波幅度50 mV)考察了修飾電極對(duì) H2O2的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)還原峰電流與 H2O2濃度分別在4.0×10-6～4.3×10-5mol/L(R2=0.993 6)及4.3×10-5mol/L～6.5×10-5mol/L(R2=0.986 1)范圍內(nèi)成線性關(guān)系,檢測(cè)限為2×10-6mol/L(S/N=3).

3 結(jié)論

利用溶膠-凝膠技術(shù)將血紅蛋白固載于玻碳電極表面,并用循環(huán)伏安法、方波伏安法和紫外-可見吸收光譜研究了血紅蛋白在修飾電極上的電化學(xué)行為.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血紅蛋白包埋在溶膠-凝膠中,能在玻碳電極上實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移,表明溶膠-凝膠與血紅蛋白有較好的生物兼容性.實(shí)驗(yàn)同時(shí)找出了 Hb/Sol-Gel/GC修飾電極的最佳制備條件,表明該傳感器具有制作方法簡(jiǎn)單,有較好重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及高靈敏度等優(yōu)點(diǎn),在生化和臨床過氧化氫檢測(cè)中可望得到較為廣泛的應(yīng)用.

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Preparation of Modified Glassy Carbon Electrode with Hemoglobin Immobilized via Sol-Gel Route

WU Wu-ai,GUO Man-dong,GAO Bao-ping
(Department of Chemistry,Shanxi Normal University,Linf en041004,Shanxi,China)

Hemoglobin(Hb)was modified on the surface of glassy carbon(GC)electrode by sol-gel technology to generate a steady Hb/Sol-Gel/GC electrode.The optimal condition for preparing Hb/Sol-Gel/GC electrode was investigated,and a new sensitive analysis method for determination of H2O2is established based on the modified GC electrode.At the same time,the response mechanism between Hb/Sol-Gel/GC and H2O2is discussed.

hemoglobin;sol-gel;biosensor;modified electrode

O 657.1

A

1008-1011(2010)05-0063-05

2010-06-08.

山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20001057).

武五愛(1977-),男,副教授,主要從事電分析化學(xué)研究.＊

.E-mail:guomd@dns.sxnu.edu.cn.