側(cè)扁軟柳珊瑚(Subergorgia suberosa)乙醇提取物抗氧化和抑菌活性研究

劉 蕾, 魏玉西, 王長(zhǎng)云, 郭 奇, 萬(wàn)慧一, 趙 玲

(1. 青島大學(xué) 生物系, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院 海洋藥物研究所, 海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003)

側(cè)扁軟柳珊瑚(Subergorgia suberosa)乙醇提取物抗氧化和抑菌活性研究

劉 蕾1, 魏玉西1, 王長(zhǎng)云2, 郭 奇1, 萬(wàn)慧一1, 趙 玲1

(1. 青島大學(xué) 生物系, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院 海洋藥物研究所, 海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003)

對(duì)中國(guó)南海側(cè)扁軟柳珊瑚(Subergorgia suberosa)乙醇提取物及其石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相進(jìn)行了抗氧化和抑菌兩種生物活性研究。結(jié)果表明： 中國(guó)南海側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相對(duì)羥自由基的清除效果好, 在50 mg/L時(shí)清除效率均高于同濃度的合成抗氧化劑TBHQ和BHT; 石油醚相、乙酸乙酯相對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除效率優(yōu)于正丁醇相和乙醇提取物。另外, 對(duì)5種海洋細(xì)菌、4種陸地細(xì)菌進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定, 發(fā)現(xiàn)乙醇提取物及其各萃取相對(duì)海洋細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)為100 g/L左右, 對(duì)受試陸地細(xì)菌未見抑菌作用。

側(cè)扁軟柳珊瑚(Subergorgia suberosa); 乙醇提取物; 抗氧化; 抑菌

我國(guó)遼闊的海域蘊(yùn)藏著豐富的珊瑚資源,其中,軟珊瑚是熱帶及亞熱帶海洋中常見的海洋腔腸動(dòng)物。隨著近幾年對(duì)該種屬生物活性研究的逐步深入,不但發(fā)現(xiàn)了軟珊瑚中含有豐富的天然代謝產(chǎn)物(如萜類、甾體類和膽固醇類[1～4]等), 且這些代謝產(chǎn)物的化學(xué)防御功能也相繼被發(fā)現(xiàn), 主要表現(xiàn)在抗氧化、抗病原微生物、克生及附著等方面, 如短足軟珊瑚(Cladiella sp.)中的孕甾醇具有抗早孕及抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性[5], 肉芝軟珊瑚(Sarcophyton crassocaule Mosre)中的一種多羥基甾醇對(duì)胃癌細(xì)胞(MGC-803)有中等程度的抑制活性[6]。

側(cè)扁軟柳珊瑚(Subergorgia suberosa), 俗稱紅海樹珊瑚, 分布于太平洋海域, 屬于腔腸動(dòng)物門, 珊瑚蟲綱, 八放珊瑚亞綱, 海雞頭目, 軟珊瑚亞目, 軟珊瑚科。目前, 國(guó)內(nèi)對(duì)側(cè)扁軟柳珊瑚的研究報(bào)道僅見其提取物堿水不溶部分可使動(dòng)物產(chǎn)生全身發(fā)軟, 重者四肢震顫、翻正反射消失等反應(yīng)[7]。作者對(duì)一種中國(guó)南海側(cè)扁軟柳珊瑚的乙醇提取物及其各萃取相進(jìn)行了抗氧化及抑菌活性的初步研究, 以豐富對(duì)該種屬珊瑚的生物活性研究資料, 進(jìn)而為一些新的抗氧化及抑菌藥物的發(fā)現(xiàn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

側(cè)扁軟柳珊瑚(Subergorgia suberosa)(Pallas 1766)于 2006年 11月采自北海潿洲島并冷凍保存,種屬由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所鄒仁林研究員鑒定, 標(biāo)本(GDNZ-1-14)存放于中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)一室。

菌種： 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ,枯草桿菌(Bacillus subtilis), 四聯(lián)微球菌(Micrococcus tetragenus), 大腸桿菌(Escherichia coli);副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 鰻弧菌(Vibrio anguillarum), 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 哈維氏弧菌(Vibrio harveyi), 沙蠶弧菌(Vibrio nereis)。以上菌種均由中國(guó)水科院黃海水產(chǎn)研究所提供。

1.1.2 主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52A, 上海亞榮生化儀器廠;TU-1810紫外可見分光光度計(jì), 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司; 雙列四孔水浴鍋, 北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠; 立式壓力蒸氣滅菌器, 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠; SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺(tái), 蘇州凈化設(shè)備有限公司; CHA-S氣浴恒溫振蕩器,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.1.3 試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂, 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司; 特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)標(biāo)準(zhǔn)樣品、2, 6-二叔丁基-甲基苯酚(BHT), 美國(guó)Merck公司;1,1-二苯基苦基苯肼基自由基(DPPH·)標(biāo)準(zhǔn)品, 美國(guó)Sigma公司; 七水硫酸亞鐵、水楊酸、30%雙氧水、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、濃 HCl、無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相的制備

將新鮮的側(cè)扁軟柳珊瑚(干質(zhì)量1.2 kg)經(jīng)淡水沖洗、切碎后, 用95%的乙醇在室溫下浸泡3次, 每次7 d, 合并提取液, 減壓濃縮后得到深褐色提取物(13.5 g)[8,9]。該提取物除部分直接用于活性測(cè)定外,余者全部混懸于 300 mL水中, 依次用石油醚(400 mL × 3)、乙酸乙酯(400 mL × 3)、正丁醇(400 mL × 3)萃取。萃取液分別減壓濃縮得到石油醚相浸膏(9.2 g)、乙酸乙酯相浸膏(2.0 g)和正丁醇相浸膏(1.2 g)。

1.2.2 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相不同

濃度溶液的配制

取側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相少許,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中真空加熱蒸干(45℃), 然后用水及適量的二甲基亞砜配制成濃度為1 g/L的母液, 供生物活性測(cè)定時(shí)稀釋后使用。

1.2.3 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定

H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng), 生成具有很高反應(yīng)活性的·OH, 其能被水楊酸有效捕捉并生成有色物質(zhì); 但若加入具有·OH清除作用的物質(zhì), 便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng), 從而使有色產(chǎn)物生成量減少[10,11]。本實(shí)驗(yàn)以 Smironff 等的方法為基礎(chǔ)并加以適當(dāng)改進(jìn),在10 mL的試管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL, 不同濃度的提取物樣品溶液2 mL, 6 mmol/L的 H2O2溶液 2 mL, 搖勻, 靜置 10 min, 再加入 6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL, 搖勻, 靜置30 min 后于510 nm 處測(cè)其吸光值。

清除率計(jì)算公式為： 清除率S %=[1- (Ai-Aj)/A0] ×100%

其中, A0為空白對(duì)照, Ai為含水楊酸時(shí)樣品液的吸光值; Aj為不含水楊酸時(shí)樣品液的吸光值。

1.2.3.2 對(duì)DPPH·自由基清除率的測(cè)定

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基, 其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán), 1個(gè)N原子有1個(gè)孤對(duì)電子, 其乙醇溶液呈紫色, 在517 nm附近有強(qiáng)吸收, 當(dāng)溶液中加人自由基清除劑時(shí), 孤對(duì)電子被配對(duì), 顏色由紫色向黃色變化, 在517 nm處的吸光度變小, 而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈定量關(guān)系, 因而可用分光法進(jìn)行定量分析[12]。

取DPPH?0.099 2 g以無(wú)水乙醇定容于25 mL容量瓶作為儲(chǔ)備液(0.01 mmol/mL), 4 ℃避光保存。使用時(shí)取2 mL儲(chǔ)備液用無(wú)水乙醇定容于100 mL容量瓶中, 搖勻備用。向不同試管加入等體積不同濃度的溶劑、提取物樣品液, 25 ℃下恒溫反應(yīng)30 min后于λ＝517 nm處測(cè)定其吸光值。

清除率計(jì)算公式為： S%＝[1－(Ai－Aj)/A0] ×100%

其中, Ai為樣品液和 DPPH?混合液的吸光值, Aj為樣品液和無(wú)水乙醇混合液的吸光值, A0為 DPPH?和無(wú)水乙醇混合液的吸光值。

1.2.3.3 對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

鄰苯三酚在堿性條件下能發(fā)生自氧化, 生成有色中間產(chǎn)物( 在325 nm 處有最大吸收) 和O2-·, 后者對(duì)自氧化又起催化作用, 依據(jù)有色中間物生成量的多少, 可判斷O2-·生成量的多少。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí), 有色產(chǎn)物的生成量減少, 可測(cè)定該自由基清除劑的活性。用10 mmol/L HCl配制3 mmol/L鄰苯三酚溶液, 0.2 mol/L Tris與0.2 mol/L HCl配制Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2)。于各試管中分別先加入不同濃度的提取物樣品液、Tris-HCl緩沖溶液、雙蒸水, 于28℃下恒溫反應(yīng)25 min。取出試管后立即滴加鄰苯三酚(28℃下預(yù)熱), 用紫外分光光度計(jì)測(cè)量滴加鄰苯三酚后第100 s時(shí)在λ＝325 nm處的吸光值[13,14]。

清除率計(jì)算公式為： 清除率 S%＝[1－(Ax－Ax0)/(A0－A) ] × 100%

其中, Ax為Tris-HCl、樣品液、雙蒸水和鄰苯三酚混合液的吸光值; Ax0為Tris-HCl、樣品液和雙蒸水混合液的吸光值, A0為Tris-HCl、雙蒸水和鄰苯三酚混合液的吸光值, A為 Tris-HCl、雙蒸水和 HCl(0.3 mL, 10 mmol/L)混合液的吸光值。

1.2.4 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相的抑菌活性測(cè)定

取活化好的菌種, 用無(wú)菌水將枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和四聯(lián)微球菌四種陸地菌, 用海水將副溶血弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌和沙蠶弧菌5種海洋菌, 分別制成一定密度(108～109cfu/mL)的菌懸液。取已滅菌的培養(yǎng)皿, 倒入溶化后冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基 20 mL, 隨即快速而輕巧地晃動(dòng)平皿, 待培養(yǎng)基冷卻后取100 μL的菌懸液注入培養(yǎng)皿中用涂布棒將其均勻地涂抹在培養(yǎng)基上[15,16]。參照Bulet等[17]的平板生長(zhǎng)抑制法, 用無(wú)菌玻璃吸管在含菌平板上打直徑3 mm 的孔穴, 每孔穴加提取物10 μL, 平行做3組。加樣后, 枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和四聯(lián)微球菌置于37℃培養(yǎng)24 h, 量取抑菌圈直徑(扣除所打孔徑)并取平均值; 副溶血弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、哈維氏菌和沙蠶弧菌置于28 ℃培養(yǎng)48 h, 量取抑菌圈直徑(扣除所打孔徑)并取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相的抗氧化活性

2.1.1 對(duì)羥自由基的清除率

側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相對(duì)羥自由基的清除效果見圖1。由圖1可見, 各樣品對(duì)羥自由基的清除率均較高,在 50 mg/L時(shí)清除率均達(dá)到50%以上, 其中乙醇提取物和正丁醇相的清除率相近(分別為 66.26%和 66.26%), 乙酸乙酯相次之(63.84%), 石油醚相為 54.43%, 均高于相同濃度下合成抗氧化劑 TBHQ(12.00%)和 BHT(8.12%)。說(shuō)明側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相對(duì)羥自由基具有極強(qiáng)清除活性。

圖1 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相與TBHQ、BHT對(duì)羥自由基的清除率比較Fig.1 OH-scavenging capacities of various organic extracts of Subergorgia suberosa, TBHQ and BHT

2.1.2 對(duì)DPPH自由基的清除率

側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相對(duì) DPPH自由基的清除效果見圖2。可見, 在相同濃度下各樣品對(duì) DPPH自由基均有一定的清除效果, 乙酸乙酯相的清除率明顯高于其他兩相及乙醇提取物。但與合成抗氧化劑TBHQ和BHT相比, 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相的清除率明顯偏低。

圖2 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各有機(jī)相與TBHQ、BHT對(duì)DPPH自由基的清除率比較Fig. 2 DPPH-scavenging capacities of various organic extracts of Subergorgia suberosa, TBHQ and BHT

2.1.3 對(duì)超氧陰離子自由基的清除率

側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果見圖3。由圖3可見, 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物的石油醚相和乙酸乙酯相對(duì)超氧陰離子自由基的清除率明顯高于正丁醇相和乙醇提取物。在50 mg/L時(shí), 石油醚相和乙酸乙酯相的清除效果(分別為 22.18%和 23.95%)與合成抗氧化劑TBHQ(26.667%)相近, 但低于合成抗氧化劑 BHT(47.143%)。

圖3 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各有機(jī)相與TBHQ、BHT對(duì)超氧陰離子自由基的清除率比較Fig. 3 O2?--scavenging capacities of various organic extracts of Subergorgia suberosa, TBHQ and BHT

2.2 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相的抑菌活性

側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相對(duì) 5種海洋細(xì)菌的抑菌活性見表1?？梢? 各樣品在100 g/L時(shí)對(duì)鰻弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌均有抑菌活性。其中, 石油醚相的抑菌活性最強(qiáng)。此外, 乙酸乙酯相在此濃度下對(duì)沙蠶弧菌和副溶血弧菌也有微弱的抑菌效果。

表1 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及其各萃取相對(duì)5種海洋細(xì)菌的抑菌效果Tab. 1 Bacteriostatic effects various organic extracts of Subergorgia suberosa

3 結(jié)論

通過(guò)浸提法得到側(cè)扁軟柳珊瑚的乙醇提取物,再將提取物經(jīng)過(guò)萃取分別得到石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相浸膏。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在 50 μg/mL濃度下, 對(duì)羥自由基的清除效果側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物(66.76%)及其各萃取相(石油醚相54.43%, 乙酸乙酯相63.84%, 正丁醇相66.26%)均優(yōu)于相同濃度下合成抗氧化劑 BTH(8.12%)、TBHQ(12%); 對(duì)超氧陰離子的清除效果石油醚相(22.18%)和乙酸乙酯相(23.95%)與合成抗氧化劑 TBHQ(26.67%)相近, 其具體抗氧化活性成分尚有待進(jìn)一步研究。另外, 側(cè)扁軟柳珊瑚乙醇提取物及各萃取相對(duì)鰻弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌均有一定抑菌活性, 并且石油醚相的抑菌活性相對(duì)優(yōu)于其他兩相及乙醇提取物; 乙酸乙酯相對(duì)沙蠶弧菌和副溶血弧菌表現(xiàn)出微弱抑菌活性。

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Anti-oxidation and bacteriostasis activity of the ethanol extract of Subergorgia suberosa

LIU Lei1, WEI Yu-xi1, WANG Chang-yun2, GUO Qi1, WAN Hui-yi1, ZHAO Ling1
(1. Biological Department of Qingdao University, Qingdao 266071, China; 2. Institute of Marine Drugs, Ocean University of China; Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education, Qingdao 266003, China)

Dec., 30, 2009

Subergorgia suberosa; ethanol extract; anti-oxidation; bacteriostasis

Ethanol extract from Subergorgia suberosa from the South Sea of China was obtained and was partitioned with petroleum ether , ethyl acetate, and n-butanol. The ethanol extract and the three organic phases showed better ·OH-scavenging efficiency than the synthetic antioxidants, TBHQ and BHT, at 50 mg/L. The scavenging efficiencies of the petroleum ether phase and the ethyl acetate phase to DPPH· and O2—· were higher than those of the ethanol extract and the n-butanol phase, respectively. Furthermore, for all samples the bacteriostasis activities against five marine bacteria and four terrestrial bacteria were also detenmined. All samples’ MICs against the five marine bacteria were about 100mg/ml and, no bacteriostasis activity was found against the terrestrial bacteria tested.

Q93

A

1000-3096(2010)09-0019-04

2009-12-30;

2010-04-08

國(guó)家海洋局“908”專項(xiàng)項(xiàng)目(908-01-ST12; 908-02-05-04)作者簡(jiǎn)介： 劉蕾(1985-), 女, 山東德州人, 碩士研究生, 研究方向： 海洋微生物檢測(cè)與控制; 魏玉西, 通信作者, E-mail： yuxiw729@163.com;王長(zhǎng)云,通信作者, E-mail：changyun@ouc.edu.cn

(本文編輯： 康亦兼)