兩種海藻提取物抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌活性的初步研究

路 遠(yuǎn), 閆茂倉(cāng), 徐宏翔, 南春容

(1. 溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325035; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005)

兩種海藻提取物抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌活性的初步研究

路 遠(yuǎn)1, 閆茂倉(cāng)2, 徐宏翔1, 南春容1

(1. 溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325035; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005)

研究了兩種大型海藻——羊棲菜(Sargassum fusiforme)、條滸苔(Enteromorpha clathrata)提取物對(duì)11種水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的抑制活性。結(jié)果顯示： 羊棲菜乙醇粗提物乙酸乙酯相對(duì)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑制作用最明顯, 抑菌圈可達(dá)21.6 mm; 薄層層析表明羊棲菜乙醇粗提取物乙酸乙酯相有6條層析帶, 其中Rf=0.54帶對(duì)哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑制作用最強(qiáng), 抑菌圈可達(dá)13.6 mm; 條滸苔乙醚粗脂對(duì)11種水產(chǎn)動(dòng)物病原菌均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用, 其中對(duì)燦爛弧菌(Vibrio splendidus)的抑制作用最強(qiáng), 抑菌圈可達(dá)24.7 mm; 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示, 條滸苔乙醚粗脂3種洗脫組分抗菌性均比粗脂減弱了, 而其95%乙醇洗脫組分對(duì)惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的抑菌圈仍可達(dá)13.8 mm。說(shuō)明利用羊棲菜、條滸苔為開(kāi)發(fā)海洋藥物資源提供了可能。

羊棲菜(Sargassum fusiforme); 條滸苔(Enteromorpha clathrata); 提取物; 水產(chǎn)動(dòng)物病原菌; 抗菌活性

近20年來(lái), 我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到了飛速發(fā)展,但隨著集約化養(yǎng)殖程度的不斷提高, 養(yǎng)殖水域的污染逐漸加重, 水產(chǎn)病害日益嚴(yán)重, 用藥量也越來(lái)越大[1]。細(xì)菌性疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)最主要的病害之一[2], 其中弧菌病尤為嚴(yán)重, 給我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的危害。長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)主要依靠各種農(nóng)藥、抗生素、喹諾酮類(lèi)等化學(xué)藥物及各種消毒劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病害進(jìn)行控制和防治?？咕幬锏拇罅渴褂貌粌H使藥物的作用效果受到制約, 使致病菌產(chǎn)生耐藥性, 而且一些藥物殘留于水產(chǎn)動(dòng)物的體內(nèi)及養(yǎng)殖水域, 給養(yǎng)殖環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染, 同時(shí)也會(huì)引發(fā)一系列的水產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題[3]。

羊棲菜(Sargassum fusiforme)和條滸苔(Enteromorpha clathrata)是浙江沿海常見(jiàn)的大型藻類(lèi)。羊棲菜隸屬于褐藻門(mén)(Phaeophyta)、馬尾藻科(Sargassaceae)、馬尾藻屬(Sargassum), 在我國(guó)溫州洞頭地區(qū)大量栽培。已有的研究發(fā)現(xiàn), 海藻中不僅存在許多抑制細(xì)胞毒活性、抗炎等作用的物質(zhì)[4,5], 而且具有較好的抗細(xì)菌、抗病毒的作用[6], 如從羊棲菜中分離出來(lái)的 SP4-2組分對(duì) HIV-1感染有較好的抑制作用[7]。條滸苔隸屬綠藻門(mén)(Chlorophyta)、石莼科(Ulvaceae)、滸苔屬(Enteromorpha), 不僅是沿海人民采集食用或用作飼料的藻類(lèi), 可以鮮食, 而且其乙醇提取物乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用[8]。但近年來(lái)隨著海洋生態(tài)環(huán)境污染及水體富營(yíng)養(yǎng)化程度的加重, 滸苔大量繁殖, 造成了嚴(yán)重的“綠潮”災(zāi)害, 對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了巨大的威脅[9]。因此如何加大對(duì)該藻類(lèi)的開(kāi)發(fā)和利用成為目前亟待解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)以羊棲菜和條滸苔為材料, 用不同有機(jī)溶劑提取其活性物質(zhì), 并驗(yàn)證各種提取物對(duì) 11種水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的抑制效果, 為更好地開(kāi)發(fā)利用羊棲菜和條滸苔資源開(kāi)辟新的途徑, 同時(shí)為將其開(kāi)發(fā)為海洋天然藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 供試海藻

羊棲菜(Sargassum fusiforme), 購(gòu)自浙江省溫州市洞頭縣羊棲菜養(yǎng)殖戶。

條滸苔(Enteromorpha clathrata), 采自浙江省寧波市北侖港, 野生。

1.2 指示菌

實(shí)驗(yàn)所用指示菌由浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所,浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)和保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。具體如下：

(1) 需鈉弧菌[10](Vibrio natriegens), 源于文蛤(Meretrix meretrix);

(2) 副溶血弧菌[11](Vibrio parahaemolyticus), 源于文蛤(Meretrix meretrix);

(3) 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 源于青蛤(Cyclina sinensis);

(4) 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 源于黃姑魚(yú)(Nibea albiflora);

(5) 哈氏弧菌[10](Vibrio harveyi), 源于文蛤(Meretrix meretrix);

(6) 哈氏弧菌(Vibrio harveyi), 源于美國(guó)紅魚(yú)(Sciaenops ocellatus);

(7) 哈氏弧菌(Vibrio harveyi), 源于凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei);

(8) 哈氏弧菌(Vibrio harveyi), 源于管角螺(Hemifusus tuba)。

(9) 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida), 源于條石鯛(Oplegnathus fasciatus);

(10) 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 源于鋸緣青蟹(Scylla serrata);

(11) 燦爛弧菌(Vibrio splendidus), 源于美國(guó)紅魚(yú)(Sciaenops ocellatus);

2 方法

2.1 海藻提取物的制備

將新鮮健康羊棲菜、條滸苔去除表面雜藻、泥沙及附著物, 用蒸餾水清洗去除表面鹽分, 50℃下烘干, 粉碎至40目。取兩種海藻粉末各30 g分別置于150 mL的無(wú)水乙醇中, 50 ℃溫浴浸提6 d, 分兩次浸提合并提取液, 過(guò)濾, 得兩種海藻乙醇浸提液, 真空旋轉(zhuǎn)蒸干, 得到黑褐色的固體浸膏, 質(zhì)量分別為1.18、3.00 g; 兩種海藻石油醚提取物操作同上, 質(zhì)量分別為0.60、0.24 g。將得到的兩種海藻乙醇粗提物分別混懸于10倍的蒸餾水中, 充分混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取, 得到乙酸乙酯相和水相, 分別蒸干, 乙酸乙酯相質(zhì)量分別為0.06、0.13 g; 水相質(zhì)量分別為0.41、0.87 g。

2.2 活性組分的TLC制備層析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)羊棲菜乙酸乙酯相, 用薄層層析法(TLC)分離, 薄層層析板采用硅膠G型。對(duì)于羊棲菜的乙酸乙酯相選用的是石油醚： 丙酮(3 ： 1)作為層析液進(jìn)行層析分離。用碘缸和石英紫外檢測(cè)儀檢測(cè)出特征帶, 刮取特征帶(特征帶用層析后化合物移動(dòng)的距離與展層劑移動(dòng)距離的比值用 Rf表示共得 6個(gè)帶)Rf值分別為 0.00、0.24、0.34、0.40、0.45、0.54, 質(zhì)量分別為 0.01、0.01、0.02、0.01、0.02、0.03 g。

2.3 索氏抽提粗脂的制備

取兩種海藻各30 g置于索式抽提器中, 底部容器分別裝入150 mL的乙醚、氯仿, 分別在45 ℃和72 ℃的水浴條件下回流抽提 3天, 真空旋轉(zhuǎn)蒸干,得到粗脂提取物, 羊棲菜、條滸苔乙醚粗脂質(zhì)量分別為 0.62、0.25 g; 氯仿粗脂的質(zhì)量分別為0.39、0.31 g。

2.4 海藻乙醚粗脂柱層析洗脫制備

羊棲菜、條滸苔乙醚粗脂經(jīng)硅膠(G60型)柱層析分離, 先后用苯、乙酸乙酯和 95%的乙醇進(jìn)行洗脫,將洗脫下來(lái)的洗脫液分別蒸干, 得苯組分質(zhì)量分別為0.03、0.10 g; 乙酸乙酯組分質(zhì)量分別為0.18、0.05 g; 乙醇組分質(zhì)量分別為0.10、0.08 g。

2.5 抗菌實(shí)驗(yàn)

采用平板擴(kuò)散法[12]。將各種病原菌接種到2216E液體培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)18 h后, 用0.85%無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為 5.0×106CFU/mL, 分別取 200 μL菌液均勻涂布于 2216E固體培養(yǎng)基平板上。將提取物溶解到相對(duì)應(yīng)的浸提溶劑或洗脫劑配成 0.1 g/mL濃度的藥液, 用移液槍吸取藥液10 μL滴于已滅菌的圓形紙片上(Φ6 mm)待完全擴(kuò)散后, 晾干, 貼于涂布有病原菌的固體培養(yǎng)基平板上, 28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后, 觀察并測(cè)量抑菌圈的大小。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩種海藻不同有機(jī)溶劑提取物抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌活性

表 1顯示, 羊棲菜的較高極性浸提物要比低極性浸提物活性略強(qiáng)。如羊棲菜乙醇粗提物乙酸乙酯相和氯仿抽提物對(duì)溶藻弧菌的抑制作用最強(qiáng), 而石油醚和乙醚提取物對(duì)其的抑制作用次之。

表 2顯示, 條滸苔的低極性浸提物要比高極性浸提物的活性要強(qiáng)。如條滸苔石油醚提取物對(duì)需鈉弧菌和哈氏弧菌(文蛤)的抑制作用最強(qiáng); 乙醚粗脂對(duì)燦爛弧菌的抗性最強(qiáng); 乙醇提取物乙酸乙酯相和水相對(duì)11種水產(chǎn)病原菌均沒(méi)有抗性。

3.2 羊棲菜乙酸乙酯相薄層層析分離組分抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌活性

表3顯示, 羊棲菜乙酸乙酯相經(jīng)薄層層析(TLC)

分離后各層帶對(duì)溶藻弧菌仍保持較強(qiáng)的活性, 而且Rf0.45帶、Rf0.54帶對(duì)11種水產(chǎn)動(dòng)物病原菌均具有較好的抗性。

表1 羊棲菜提取物抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌活性結(jié)果Tab. 1 Antimicrobial activities of the extracts from S. fusiforme against aquatic animal pathogens

表2 條滸苔提取物抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌活性結(jié)果Tab. 2 Antimicrobial activities of the extracts from E. clathrata against aquatic animal pathogens

3.3 兩種海藻乙醚粗脂洗脫組分抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌活性

表4和表5顯示, 兩種海藻乙醚粗脂三種洗脫組分的抗菌性比粗脂的抗菌性略有減弱, 原因可能是共同起作用的活性物質(zhì)被分開(kāi), 從而在分離后降低了其抗菌能力。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)顯示, 大型海藻羊棲菜、條滸苔體內(nèi)含有抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的活性物質(zhì), 其中羊棲菜不同提取液浸提物對(duì)溶藻弧菌具有最明顯的抑制作用, 條滸苔乙醚粗脂對(duì)燦爛弧菌的抑制作用最強(qiáng)。但有活性的提取物均為粗提物, 含有多種成分, 化學(xué)性質(zhì)復(fù)雜, 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。如在薄層層析分離實(shí)驗(yàn)當(dāng)中發(fā)現(xiàn),Rf值最大的兩條帶的抗性最好, 而林雄平等[13]在羊棲菜提取物抗動(dòng)植物病原菌活性的實(shí)驗(yàn)中提到較低的Rf值對(duì) 3種動(dòng)物病原菌具有較好的抑制作用, 可能是不同的實(shí)驗(yàn)菌種對(duì)羊棲菜乙醇粗提物乙酸乙酯相各層帶敏感性不同造成的, 其中Rf=0.45帶、0.54帶的化學(xué)成分還有待進(jìn)一步的研究分析; 從柱層析分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看, 粗脂中的活性物質(zhì)分別在各洗脫組分當(dāng)中, 各組分抗菌性略有減弱說(shuō)明粗提物中的抑菌物質(zhì)可能為多種成分共同起作用, 而且有幾種洗脫組分的基團(tuán)它們之間可能存在相互作用, 或者被其他基團(tuán)所屏蔽, 分離后屏蔽基團(tuán)被分開(kāi), 抗菌活性才顯現(xiàn)出來(lái)。

徐年軍等在研究海藻乙醇提取物抗菌活性實(shí)驗(yàn)中提到, 從不同門(mén)類(lèi)海藻的抗菌活性看, 褐藻最強(qiáng),紅藻次之, 而綠藻活性最弱[8]。而從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看, 綠藻條滸苔乙醇提取物對(duì)本實(shí)驗(yàn)指示菌沒(méi)有抗性, 但乙醚提取物中表現(xiàn)出的抗菌活性一定程度上超過(guò)了褐藻羊棲菜的活性, 可見(jiàn)不同藻類(lèi)使用不同的溶劑提取得到的活性物質(zhì)及其抗菌能力也不一樣。

表4 羊棲菜乙醚粗脂洗脫組分抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌活性結(jié)果Tab. 4 Antimicrobial activities of three elution fractions of S. fusiforme against aquatic animal pathogens

表5 條滸苔乙醚粗脂洗脫組分抗水產(chǎn)動(dòng)物病原菌活性結(jié)果Tab. 5 Antimicrobial activities of three elution fractions of E. clathrata against aquatic animal pathogens

利用海藻提取物添加到飼料中以替代抗生素等化學(xué)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治方面已有一些研究。如 Immanuel 等[14]曾研究發(fā)現(xiàn)熱帶海藻石莼(Ulva luctucal)和馬尾藻屬的圍氏馬尾藻(Sargassum wightii)提取物具有抗副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的活性, 其抑菌圈高達(dá)17.5 mm±0.81 mm、16.3 mm±0.47 mm, 并將提取物添加到飼料中喂養(yǎng)印度對(duì)蝦(Penaeus indicus), 發(fā)現(xiàn)印度對(duì)蝦體中的副溶血弧菌明顯地減少了。本文羊棲菜乙醇粗提物乙酸乙酯相和條滸苔乙醚粗脂分別對(duì)溶藻弧菌和燦爛弧菌有很強(qiáng)的抑制作用, 其有效成分的分離純化, 有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

[1] 趙明軍, 黃志斌. 無(wú)公害漁藥研發(fā)面臨的問(wèn)題和急需研究的課題[J]. 中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì), 2008, 26(1)： 52-60.

[2] 黃琪琰. 中國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物疾病學(xué)研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1996, 20(1)： 51-57.

[3] 徐維海, 朱校斌, 王新亭. 抗菌藥物在魚(yú)、蝦體內(nèi)的殘留及代謝動(dòng)力學(xué)研究[J]. 海洋科學(xué), 2003, 28(9)： 62-65.

[4] 史大永, 李敬郭, 郭書(shū)舉,等. 5種南海海藻醇提取物活性初步研究[J]. 海洋科學(xué), 2009, 33(12)： 40-43.

[5] 史大永, 李曉紅, 李敬,等. 海藻提取物環(huán)氧加酶-2抑制活性研究[J]. 海洋科學(xué), 2009, 33(7)： 30-32.

[6] 林雄平, 鄭怡, 陳曉清. 三種褐藻乙醇提取物抗動(dòng)植物病原菌活性[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005, 21(1)： 112-116.

[7] Elena E Paskaleva, Xudong Lin, Karen Duus, James J McSharry. Sargassum fusiforme fraction is a potent and specific inhibitor of HIV-1 fusion and reverse transcriptase[J]. Virology Journal, 2008, 5(8)： 1-9.

[8] 徐年軍, 范曉,等. 海藻乙醇提取物抗菌活性的研究[J]. 海洋與湖沼, 2002, 33(3)： 265-270.

[9] Hiraoka M, Ohno M, Kawaguchi S, et a1. Crossing test among floating Ulva thalli forming ‘green tide’ in Japan[J]. Hydrobiologia, 2004, 512： 239-245.

[10] 劉連生, 閆茂倉(cāng), 林志華,等. 引起文蛤暴發(fā)性死亡病原菌的分離和鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2009, 36(1)：71-77.

[11] 李國(guó), 閆茂倉(cāng), 常維山,等. 文蛤副溶血弧菌間ELISA檢測(cè)技術(shù)的研究[J]. 海洋通報(bào), 2008, 27(5)： 85-90.

[12] Nagashima Y, Kikuchi N, Shimakura K, et al. Purification and characterization of an antibacterial protein in the skin secretion of rockfish Sebastes schlegeli[J].Comparative Biochemistry and Physiology C:Pharmacology Toxicology and Endocrinology, 2003,136, 63-71.

[13] 林雄平, 鄭怡, 陳曉清. 羊棲菜提取物抗動(dòng)植物病原菌活性及化學(xué)成分初步分析[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào), 2009,28(2)： 77-80.

[14] Immanuel G, Vincybai V C, Sivaram V, et al. Effect of butanolic extracts from terrestrial herbs and seaweeds on shrimp Penaeus indicus juveniles[J]. Aquaculture,2004, 236： 53-65.

Antimicrobial activities of extracts from Sargassum fusiforme and Enteromorpha clathrata against aquatic animal pathogens

LU Yuan1, YAN Mao-cang2, XU Hong-xiang1, NAN Chun-rong1
(1. Life Science School, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035 China; 2. Zhejiang Mariculture Reseach Institute, Wenzhou 325005, China)

Sep., 30, 2009

Sargassum fusiforme; Enteromorpha clathrata; extract; aquatic animal pathogen; antimicrobial activity

Antimicrobial activities of extracts from two macro-algae, Sargassum fusiforme and Enteromorpha clathrata were assayed against 11 aquatic animal pathogens. The results showed that the ethyl acetate phase of ethanol extracts from S. fusiforme exhibited the strongest inhibition effect on Vibrio alginolyticus with an inhibition zone of 21.6 mm; the ethyl acetate phase of ethanol extracts from S. fusiforme had six chromatographic bands,among which the band with Rf=0.54 showed the strongest inhibition effect on Vibrio harveyi, with an inhibition zone was 13.6 mm; the crude fat of E. clathrata could inhibit all 11 aquatic animal pathogens, and the strongest inhibition effect was toward Vibrio splendidus with an inhibition zone of 24.7 mm. Moreover, the antimicrobial activities of the three elution fractions of the crude fat from E. clathrata was weaker than that of the crude fat, the inhibition zone of the 95% ethanol elution fractions to Pseudomonas putida was still up to 13.8 mm. Our results support the feasibility of developing marine drugs from S. fusiforme and E. clathrata.

R931.77

A

1000-3096(2010)10-0028-05

2009-09-30;

2009-12-11

浙江省自然科學(xué)基金(Y506224); 溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(S20100020)

路遠(yuǎn)(1984-), 男, 山東淄博人, 碩士, 主要從事海藻提取物活性的研究, 電話： 15858832152, E-mail： luyuan11@126.com; 南春容, 通信作者, 電話： 0577-86699360, E-mail： nanchunrong@163.com

(本文編輯：張培新)