可見分光光度法測定刺山柑花蕾中總黃酮含量

姜秀娟，唐金成，白紅進(jìn),*

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

可見分光光度法測定刺山柑花蕾中總黃酮含量

姜秀娟1,2，唐金成2，白紅進(jìn)1,2,*

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

通過不同方法提取刺山柑花蕾中總黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，NaNO3-Al(NO3)3-NaOH體系顯色，可見分光光度法測定其含量，檢測波長為500nm。結(jié)果表明，甲醇回流法提取效果最好，在0～32mg/L(r=0.9997)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加標(biāo)回收率為100.3%，RSD=0.98%(n=6)，測得樣品中總黃酮平均含量為1.13%。該法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于總黃酮的含量測定。

刺山柑花蕾；總黃酮；分光光度法；含量測定

Abstract：Different extraction methods were coupled with visible spectrophotometry to develop a simple and accurate method for quantifying total flavonoids inCapparis spinosaL. buds. The detection wavelength was set at 500 nm. Rutin was used as the standard sample and NaNO3, Al(NO3)3 and NaOH was used to compose the coloration system. Results indicated that the methanol reflux method exhibited the highest extraction rate for total flavonoids. A good linear relationship was observed in the range of 0 to 32 mg/L (r=0.9997) and average recovery rate was 100.3% with a relative standard deviation of 0.98% (n=6). The average content of total flavonoids in the samples from Kuche county, Xinjiang autonomous region was 1.13%.

Key words：Capparis spinosaL. buds；total flavonoids；spectrophotometry；determination

刺山柑(Capparis spinosaL.)為白花菜科山柑屬植物，又名老鼠瓜、野西瓜、槌果藤等。主要分布于亞洲西部、歐洲、北美和大洋洲。在我國主產(chǎn)于西北干旱地區(qū)，尤其是新疆各沙漠地區(qū)。刺山柑最早報道于《新疆中草藥》，是一種常用的民族藥物[1-2]，其次還是優(yōu)良的固沙植物[3]。據(jù)國外文獻(xiàn)報道，在地中海地區(qū)，刺山柑花蕾被腌制食用，腌制的花蕾以它獨(dú)特的香味作為調(diào)味品在涼拌菜、面食、肉類及醬汁等中長期使用[4-6]；用甲醇法提取低溫凍干的刺山柑花蕾，在體外的炎癥過程中對軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用，認(rèn)為與提取物中含有的黃酮類化合物有關(guān)，它具有明顯的抗炎、抗氧化作用，其保護(hù)作用明顯優(yōu)于常用的消炎藥[7-8]。在新疆，刺山柑果實作為一種抗風(fēng)濕藥物在民間廣泛應(yīng)用[3,9]，而其花蕾作為食品的應(yīng)用開發(fā)還處于起步階段[10]，為進(jìn)一步開發(fā)利用該植物資源，本實驗研究新疆南疆產(chǎn)刺山柑花蕾中總黃酮的提取方法并對其含量進(jìn)行測定，為深入研究其化學(xué)成分和藥理活性提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

刺山柑花蕾于2008年5月采于新疆庫車縣，樣品經(jīng)陰干，粉碎，密封冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

甲醇、三氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為國產(chǎn)分析純)；蘆丁對照品 德國Dr.Ehrenstorfer有限公司。

Cary100紫外-可見分光光度計 澳大利亞瓦里安公司；SK3200H超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器公司；ZP-200振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；RE-50B水浴鍋 上海申生科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃酮類化合物的定性鑒別

通過顏色反應(yīng)和紙層析的方法來鑒別黃酮類化合物[11]。

1.2.2 總黃酮含量的測定

利用NaNO3-Al(NO3)3-NaOH比色法測定試液中總黃酮的含量。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取120℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇50mL，超聲溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，其質(zhì)量濃度為0.1mg/mL。

1.2.2.2 供試品溶液的制備

方法一(超聲波提取法)：精密稱取刺山柑花蕾粉末1.000g于100mL具塞三角瓶中，加甲醇30mL，超聲提取30min，濾過，殘渣再加入30mL甲醇超聲提取30min，濾過，合并濾液，定容于100mL的容量瓶中。平行提取3次。

方法二(熱回流提取法)：精密稱取刺山柑花蕾粉末1.000g于圓底燒瓶中，加甲醇30mL，回流提取1h，濾過，殘渣再加入30mL甲醇回流提取1h，濾過，合并濾液，定容于100mL的容量瓶中。平行提取3次。

方法三(振蕩浸提法)：精密稱取刺山柑花蕾粉末1.000g于100mL具塞三角瓶中，加甲醇30mL，振搖提取30min，濾過，殘渣再加入30mL甲醇振搖提取30min，濾過，合并濾液，定容于100mL的容量瓶中。平行提取3次。

根據(jù)含量比較結(jié)果，選擇總黃酮含量高的進(jìn)行提取測定精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率及含量。

1.2.2.3 吸收波長的確定

圖1 蘆丁和樣品的掃描光譜Fig.1 Scanning spectra of rutin and samples

精密量取方法一中的供試品溶液6mL置于25mL量瓶中。加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%亞硝酸鈉溶液lmL，混勻，放置6min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%氫氧化鈉溶液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min。以相應(yīng)試劑為空白，在420～700nm波長范圍內(nèi)掃描光譜，同上操作得同條件下蘆丁對照品光譜圖。經(jīng)比較，該法顯示供試品與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在波長500nm處有相同的最大吸收，故選用本法來顯色。其最大吸收波長為500nm(圖1)。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[12]

精密吸取1.2.2.1節(jié)中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL分別置于25mL容量瓶中，加甲醇補(bǔ)到10mL，按1.2.2.3節(jié)方法操作，以第1份溶液為空白，在500nm波長處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.01825C+0.00493，r=0.9997，RSD=0.49%。表明樣品檢測濃度在0～32mg/L的范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.2.2.5 精密度實驗

精密吸取1.2.2.1節(jié)中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5mL，置于25mL容量瓶中，共6份，按1.2.2.3節(jié)操作，分別測定吸光度。

1.2.2.6 穩(wěn)定性實驗

精密吸取1.2.2.2節(jié)方法二中樣品溶液2mL，按1.2.2.3節(jié)操作，每隔10min測定1次吸光度，共測6次。

1.2.2.7 重現(xiàn)性實驗

精密稱取一定質(zhì)量的樣品粉末，按1.2.2.2節(jié)方法二中方法制備成供試品溶液6份，分別從中精密吸取2mL，按1.2.2.3節(jié)操作，測定吸光度。

1.2.2.8 回收率實驗

精確稱取已知含量的樣品0.500g，平行6份，再分別精確加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1.04mg/mL)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，按1.2.2.2節(jié)方法二中方法制備成供試品溶液，分別從中精密吸取2mL，按1.2.2.3節(jié)操作，測定吸光度，計算回收率。

1.2.2.9 樣品含量測定

精確吸取1.2.2.2節(jié)方法二中樣品溶液2.0mL，共3份，分別置于25mL容量瓶中，按1.2.2.3節(jié)操作，測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮的定性鑒別

2.1.1 顯色反應(yīng)結(jié)果

表1 顯色反應(yīng)結(jié)果Table 1 Results of color reaction

由表1可知，樣品液中含有黃酮類化合物。

2.1.2 紙層析

取樣品溶液10μL點(diǎn)在濾紙上，用V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=4:1:5為展開劑，上行展開5h，取出晾干。噴1%氯化鋁乙醇溶液，吹干。紫外燈下觀察，有黃色熒光斑點(diǎn)。結(jié)果表明，樣品液中含有黃酮類化合物。

定性檢測表明刺山柑花蕾中含有黃酮類化合物，這與文獻(xiàn)報道的刺山柑花蕾中含有山奈黃素和槲皮素等黃酮類化合物相一致[7,13-14]。

2.2 不同提取方法的考察

表2 不同提取方法的總黃酮含量Table 2 Contents of total flavonoids in methanol extracts fromCapparis spinosaL. buds prepared by different extraction methods mg/L

由表2可知，熱回流提取法總黃酮含量明顯高于超聲和振搖，故采用熱回流提取法。與傳統(tǒng)的熱回流相比，雖然超聲提取法和振搖提取法具有提取時間短、無需加熱等優(yōu)點(diǎn)，但對刺山柑花蕾中總黃酮的提取率不高，這可能與花蕾中含有的黃酮類化合物的種類與結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.3 精密度實驗

表3 精密度實驗Table 3 Precision test

由表3可知，6個平行測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%，說明用該方法測定標(biāo)準(zhǔn)溶液中蘆丁的含量精密度較好。

2.4 穩(wěn)定性實驗

表4 穩(wěn)定性實驗Table 4 Stability test

由表4可知，樣品顯色后在60min內(nèi)的吸光度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.14%，說明熱回流法提取的樣品液穩(wěn)定性較好。

2.5 重現(xiàn)性實驗

表5 重現(xiàn)性實驗Table 5 Reproducibility test

由表5可知，6次重復(fù)實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.17%，說明熱回流法提取的試液重現(xiàn)性良好。

2.6 回收率實驗

表6 回收率實驗Table 6 Spike recovery test

由表6可知，6個回收率實驗結(jié)果的平均值為100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.98%，說明熱回流法提取的總黃酮回收率高。

2.7 樣品中總黃酮含量的測定

表7 樣品含量測定結(jié)果Table 7 Determination results of real samples

由表7可知，采用熱回流法提取的總黃酮平均含量為1.13%，說明其花蕾中總黃酮含量較高。

3 結(jié) 論

本實驗以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了刺山柑花蕾中總黃酮的含量測定方法。該方法具有線性范圍寬、靈敏度高、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

[1] 高瑩瑩, 敖明章, 萬軍梅, 等. 維藥刺山柑醇提物抗炎鎮(zhèn)痛作用的實驗研究[J]. 中藥材, 2007, 30(6):702-704.

[2] 吾斯曼·吐爾遜. 刺山柑(老鼠瓜)的藥用探索[J]. 中國民族醫(yī)藥雜志, 2006, 12(4):33.

[3] 張立運(yùn), 楊春. 保護(hù)風(fēng)蝕地的刺山柑[J]. 植物雜志, 2004(1):3-4.

[4] ZARGARI A. Medicinal plants[M]. Tehran:Tehran University Publications, 1986.

[5] ROMEO V, ZIINO M, GIUFFRIDA D, et al. Flavour profile of capers(Capparis spinosaL.) from the Eolian Archipelago by HS-SPME/GCMS[J]. Food Chemistry, 2007, 101(3):1272-1278.

[6] 敖明章, 高瑩瑩, 余龍江. 刺山柑化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2007, 38(3):463-467.

[7] GADGOL C, MISHRA S H. Antihepatotoxic activity ofp-methoxy benzoic acid fromCapparis spinosa[J]. Journal of Ethnopharmacol,1999, 66(2):187-192.

[8] PANICO A M, CARDILE V, GARUFI F, et al. Protective effect ofCapparis spinosaon chondrocytes[J]. Life Sciences, 2005, 77(20):2479-2488.

[9] 羅俊, 謝陽. 維藥刺山柑果治療痛風(fēng)風(fēng)濕病15例[J]. 中國民族醫(yī)藥雜志, 1999, 5(2):3.

[10] 賈進(jìn)京, 白紅進(jìn), 蔣卉. 刺山柑花蕾化學(xué)成分的初步研究[J]. 塔里木大學(xué)學(xué)報, 2007, 19(4):35-37.

[11] 高錦明. 植物化學(xué)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2003.

[12] 郁建生, 郁建平. 草珊瑚總黃酮提取工藝及其含量動態(tài)變化[J]. 中國中藥雜志, 2007, 32(4):307-309.

[13] RODRIGO M, LAZARO M J, ALVARRUIZl A, et a1. Composition of capers (Capparis spinosa):influence of cultivar, size and harvest date[J].Journal of Food Science, 1992, 57:l152-l154.

Visible Spectrophotometric Determination of Total Flavonoids inCapparis spinosaL. Buds

JIANG Xiu-juan1,2，TANG Jin-cheng2，BAI Hong-jin1,2,*
(1. Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resource in Tarim Basin of Xinjiang Production and Construction Corps,Alar 843300, China；2. College of Life Science, Tarim University, Alar 843300, China)

O657.32

A

1002-6630(2010)18-0252-03

2009-11-03

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科學(xué)技術(shù)局政策引導(dǎo)項目(2006YD29)；塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實驗室開放項目(BR0609)

姜秀娟(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mial：jxjuan2010@126.com

*通信作者：白紅進(jìn)(1967—)，男，教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：bhj67@163.com