氣相色譜微池電子捕獲檢測器測定蜂蠟中6種殺螨劑藥物殘留

陳 芳，李 丹， 張金振，黃京平，趙 靜，吳黎明,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，國家農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂業(yè)分中心，北京 100093；2.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥系，北京 100083)

氣相色譜微池電子捕獲檢測器測定蜂蠟中6種殺螨劑藥物殘留

陳 芳1，李 丹2， 張金振1，黃京平1，趙 靜1，吳黎明1,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，國家農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂業(yè)分中心，北京 100093；2.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥系，北京 100083)

建立一種準(zhǔn)確、快速、簡便的蜂蠟中殺螨劑類藥物多殘留檢測技術(shù)。樣品經(jīng)恒溫水浴液-液萃取、低溫冷凍離心凈化后用氣相色譜微池電子捕獲檢測器測定。對提取溶劑的種類、體積及提取次數(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：30.0mL乙腈-正己烷(V/V，2:1)是最佳提取溶劑。經(jīng)兩次冷凍及高速離心能將大部分的脂類基質(zhì)去除。該方法的線性范圍為0.01～4mg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.9878。檢出限為0.96～4.69μg/kg，定量限為2.56～13.12μg/kg。該方法在3個不同濃度水平的添加均有很好的回收率(83.8%～110.4%)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.70%～6.60%。

殺螨劑；蜂蠟；氣相色譜微池電子輔獲檢測器

Abstract：An accurate, fast and convenient method for simultaneous determination of 6 acaricide residues in beeswax by gas chromatography coupled with a micro-electron capture detector (GC-MECD) was established. The sample was saturated with hexane and acetonitrile in water bath with constant temperature. After frozen and centrifugation at 10000 r/min, the extract was analyzed by GC-MECD. Effects of extraction solvent, solvent volume and extraction times on extraction efficiency were explored. The best extraction solvent was 30.0 mL of acetonitrile-hexane (V∶V, 2:1). Twice freezing and high speed centrifugation could remove the interference of lipid matrix. This method exhibited an excellent linear relationship over the range of 0.01 to 4.0 mg/L with a correlation coefficient of larger than 0.9878. The limits of detection (LOD) for the 6 acaricides varied from 0.96 to 4.69 μ g/kg. The average recovery rates of these analytes spiked at three different levels ranged from 83.8% to110.4%, and the relative standard deviations (RSD) from 1.70% to 6.60%.

Key words：acaricide；beeswax；gas chromatography coupled with a micro-electron capture detector (GC-MECD)

蜂螨是蜜蜂的天敵，也是最為嚴(yán)重的敵害。螨害發(fā)生時，輕則群勢受損，重則全群覆滅。為防治蜂螨，溴螨酯、蠅毒磷、氟胺氰菊酯等殺螨劑已成為養(yǎng)蜂業(yè)廣泛施用的藥物。這幾種藥物的使用促進(jìn)了養(yǎng)蜂業(yè)快速發(fā)展，但由于殺螨劑脂溶性特點(diǎn)，容易蓄積于蜂蠟中，蜂蠟的循環(huán)使用導(dǎo)致巢脾中藥物殘留種類、殘留量不斷增加，直接影響了蜂蠟質(zhì)量安全。同時，通過蜜蜂與巢脾的接觸，殺螨劑藥物殘留能夠轉(zhuǎn)移至蜂蜜、蜂王漿、蜂膠等蜂產(chǎn)品中，進(jìn)而造成蜂產(chǎn)品污染。

因此各種組織和各個國家紛紛制定殘留限量來應(yīng)對蜂產(chǎn)品質(zhì)量問題。美國規(guī)定雙甲脒在蜂蜜、蜂巢中的限量分別為1mg/kg和6mg/kg，蠅毒磷在蜂蜜、蜂巢中的限量分別為0.15、45mg/kg, 氟胺氰菊酯在蜂蜜中的限量為0.05mg/kg。澳大利亞規(guī)定氟胺氰戊菊酯、氟胺氰菊酯在蜂蜜中的限量為0.005、0.01mg/kg；日本規(guī)定了蜂蜜(包括蜂王漿)中雙甲脒、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯暫定標(biāo)準(zhǔn)為0.2、0.01、0.05mg/kg[1-2]；其他國家及我國尚未制定。在檢測方法方面，國外對蜂蠟中農(nóng)藥殘留研究主要為有機(jī)氯類、親脂性農(nóng)藥及少數(shù)殺螨劑藥物等；國內(nèi)對殺螨劑類藥物的研究主要集中于蜂蜜產(chǎn)品，先后制定了蜂蜜中雙甲脒及其代謝物、溴螨酯、4,4＇-二溴二苯甲酮及氟胺氰菊酯殘留量檢驗方法等6個標(biāo)準(zhǔn)，種類較為單一、有限。

由于國內(nèi)、外使用的殺螨劑藥物的品種不同，建立適合我國國情的蜜蜂巢脾及蜂蠟中殺螨劑類藥物多殘留檢測方法十分必要。本研究擬建立一種快速、高效且具有普遍適用性的蜂蠟中常用殺螨劑多殘留檢測方法，為蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控提供有力的技術(shù)儲備和支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溴螨酯、蠅毒磷、氟氯苯氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；丙酮、乙腈、正己烷、甲醇、二氯甲烷(均為色譜級) 美國J.T.Baker公司；石油醚(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

7890a-μECD 氣相色譜儀[配備7683自動進(jìn)樣器，色譜柱為HP-5 (30m×0.25mm，0.25μm)] Agilent公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；BCD-539WT冰箱 海爾公司；Himac-CR22GII高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司 。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

取6種標(biāo)準(zhǔn)品適量，用正己烷溶解后，分別配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20℃冰箱中保存。分別取適量的6種標(biāo)準(zhǔn)品于同一容量瓶中，用正己烷定容為10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20℃冰箱中保存。

1.4 蜂蠟樣品的制備

市售蜂蠟樣品，于－20℃冰箱中冷凍1h后粉碎，于－4℃冰箱中保存；巢蠟，以每100g蜂蠟加1L水的比例在大燒杯中煮沸后冷卻，將底部雜質(zhì)用小刀削除，重復(fù)提純一次。制備好的純蜂蠟樣品如市售蜂蠟，冷凍后粉碎保存。

1.5 樣品提取與凈化

稱取1.0g蜂蠟樣品于50.0mL離心管中，加入20.0mL乙腈，在75℃水浴鍋中充分加熱溶解后，加入10.0mL正己烷充分搖勻。于－22℃冰箱內(nèi)冷凍約45 mi n，10000r/min離心5min，取乙腈相于50.0mL離心管中，再次冷凍約45min，10000r/min離心5min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1.0mL正己烷復(fù)溶，0.45μm濾膜過濾備用。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備

取不含該實(shí)驗測定的6種殺螨劑殘留的蜂蠟樣品，按上述樣品提取與凈化方法制備好空白蜂蠟樣品，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成一定質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 氣相色譜條件

進(jìn)樣口：260℃，不分流進(jìn)樣；檢測器：300℃；程序升溫：100℃恒溫1min，25℃/min升至200℃、恒溫1min，5℃/min升到260℃、恒溫5min，4℃/min升到300℃、恒溫4min；載氣：高純氮(＞99.999%)；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積：1.0μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取和凈化條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)顯示，乙腈、甲醇和丙酮、正己烷、二氯甲烷、石油醚常作為蜂蠟殺螨劑類藥物殘留的提取溶劑[3-4]，因此本實(shí)驗對這6種溶劑的提取效率進(jìn)行驗證。結(jié)果表明，乙腈、甲醇和丙酮均有滿意的提取效率(表1)，二氯甲烷和石油醚的提取效率偏低(19.2%～88.0%)，而正己烷只能提取出微量的氰戊菊酯、氟氨氰菊酯和溴螨酯。甲醇對氟氨氰菊酯和蠅毒磷的提取可能受基質(zhì)的影響，回收率高達(dá)130%。為去除基質(zhì)影響，在經(jīng)提取的空白基質(zhì)上添加標(biāo)樣(標(biāo)準(zhǔn)加入法)，以此來消除基質(zhì)干擾。校正后的結(jié)果顯示，乙腈、甲醇和丙酮均有更好的回收率(69.3%～119.4%)，尤其是氟氨氰菊酯和蠅毒磷的回收率從外標(biāo)法中的130%、119.8%和124%分別變?yōu)?19.4%、114.6%和94.9%，由此可見氟氨氰菊酯和蠅毒磷受基質(zhì)影響最大。由于上述6種提取溶劑中，正己烷基本對目標(biāo)化合物提取無效且又與乙腈或甲醇不互溶，本實(shí)驗將正己烷與乙腈或甲醇配比進(jìn)行液-液分配提取研究其凈化效率。結(jié)果顯示，乙腈或甲醇與正己烷配比的提取溶劑具有很好的提取效率且有效地降低基質(zhì)干擾，其中乙腈與正己烷配比的溶劑提取效率更高(表2)。因此，本實(shí)驗選擇乙腈和正己烷作為此方法的提取溶劑。

表1 6種溶劑不同定量方法的提取效率Table 1 Extraction rates of six kinds of solvents using different quantification methods

表2 兩種不同液-液提取溶劑提取效率比較Table 2 Comparison of extraction rates using two different solvent extraction methods

研究提取溶劑的體積和提取次數(shù)，5.0mL正己烷和10.0mL乙腈提取，能夠?qū)⒊弪ヒ酝獾钠渌?種藥物充分提取出來，且提取效率達(dá)到88.0%～126.0%， 而第1次溶劑提取中溴螨酯的提取效率僅達(dá)到了60%，且在第2次提取液中仍然提取到了少量的溴螨酯。在第3次提取液中沒有發(fā)現(xiàn)任何目標(biāo)化合物。為了簡化提取步驟，同時比較兩次5.0mL正己烷和10.0mL乙腈提取與一次10.0mL正己烷和20.0mL乙腈提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取效率沒有差異。

由于蜂蠟的組成以烴類、脂類和醇類為主，低溫冷凍和高速離心的方法能將大部分的大分子脂類基質(zhì)干擾物去除。因此，本實(shí)驗對冷凍次數(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，經(jīng)一次冷凍后，可以將大部分的脂類物質(zhì)去除。二次冷凍離心后，離心液基本澄清，且色譜圖(圖1)顯示，目標(biāo)化合物出峰時段內(nèi)的干擾物更少。三次冷凍離心后，基本未見離心管壁上有脂類附著物，且色譜圖與二次冷凍離心后的差異不大。因此，本實(shí)驗選擇兩次冷凍離心作為凈化方法。從樣品的色譜圖上可知，經(jīng)液-液提取、冷凍離心后的樣品基質(zhì)雜質(zhì)主要是一些小分子的極性物質(zhì)，易氣化且出峰時間較早，對目標(biāo)化合物基本不干擾，也不會因殘留在色譜柱中而污染色譜柱。因此，從實(shí)驗簡便易操作和實(shí)驗成本的角度考慮，本方法將不進(jìn)一步采用固相萃取的方法對樣品進(jìn)行凈化。

圖1 6種殺螨劑標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.1 GC-MECD chromatogram of six kinds of acaricide residues

2.2 方法學(xué)研究

2.2.1 方法的線性范圍和檢出限

表3 方法的線性、檢出限及定量限Table 3 Linear relationship and limit of detection (LOD) of the established method

殺螨劑是蜜蜂飼養(yǎng)過程中的常用藥物，由于大部分的殺螨劑是脂溶性的，易累積在巢脾中[5]。且國外的研究資料表明，蜂蠟中的殺螨劑殘留量通常在mg/kg的數(shù)量級上[6-7]。且各種組織和國家的殘留限量也表明，雙甲脒和蠅毒磷在蜂巢中的限量分別為6mg/kg和45mg/kg。本實(shí)驗在0.01～4mg/L范圍內(nèi)選擇了0.01、0.1、0.5、1、

2、4mg/L 6個質(zhì)量濃度，以峰面積為X軸、質(zhì)量濃度為Y軸建立標(biāo)準(zhǔn)加入工作曲線(表3)。6種殺螨劑均有很好的線性。斜率范圍為3.92×10－5～10.5×10－5，截距為0.0013～0.0428，相關(guān)系數(shù)為0.9878。檢出限是在空白加標(biāo)的基礎(chǔ)上測得的3倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度，定量限為10倍信噪比對應(yīng)質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示6種殺螨劑的檢出限為0.96～4.69μg/kg，其中氰戊菊酯的檢出限最低為0.96μg/kg，氟氯氰菊酯的檢出限最高。定量限為2.56～13.12μg/kg。

2.2.2 準(zhǔn)確性和精密度

表4 不同質(zhì)量濃度水平添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Average recovery rates and relative standard deviations (RSD)of spiked samples with various concentration levels (n=6)

選擇3個不同質(zhì)量濃度添加水平的回收率來驗證方法的準(zhǔn)確性及精密度。結(jié)果顯示，3個質(zhì)量濃度均有很好的回收率，尤其是在10μg/L(氟氯氰菊酯添加了20μg/L)的添加水平上，其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均略高于其他兩個水平的添加，分別為89.2%～110.4%、3.61%～6.60%(表 4)。

3 結(jié) 論

用20.0mL乙腈和10.0mL正己烷在75℃水浴溶解后的液-液提取，能夠快速、完全地將目標(biāo)化合物提取出來。提取液在冷凍后經(jīng)高速離心等凈化步驟，能夠有效地去除樣品基質(zhì)中的脂類及其他大分子的干擾物質(zhì)。方法學(xué)研究表明，本方法的定量限為2.56～13.12μg/kg，且在3個不同質(zhì)量濃度添加水平上均取得很好的回收率。本方法具有快速、準(zhǔn)確及試劑消耗少等特點(diǎn)。

[1] Food and Drug Administration of the United States. Pesticides tolerances[DB/OL]. http://www.cfsan.fda.gov.

[2] WTO/TBT-SPS Notification and Enquiry of China[DB/OL]. http://www.tbt-sps.gov.cn/foodsafe/xlbz/Pages/pesticide.aspx.

[5] FRIES I, WALLNER K, ROSENKRANZ P. Effects on varroa jacobsoni from acaricides in beeswax[J]. Apicult Res, 1998, 37(2):85-90.

[6] KAMEL A, AL-GHAMDI A. Determination of acaricide residues in saudi arabian honey and beeswax using solid phase extraction and gas chromatography[J]. Journal of Environmental Science and Health Part B, 2006, 41:159-165.

[7] KORTA E, BAKKALI A, BERRUETA L A, et al. Determination of amitraz and other acaricide residues in beeswax[J]. Analytica Chimica Acta, 2003, 475:97-103.

Determination of Six Acaricide Residues in Beeswax by Gas Chromatography Coupled with a Micro-electron Capture Detector

CHEN Fang1，LI Dan2，ZHANG Jin-zhen1，HUANG Jing-ping1，ZHAO Jing1，WU Li-ming1,*
(1. Apiculture Sub-Centers, National Agricultural Products Processing Center, Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Biological Medicine Department, Beijing City University, Beijing 100083, China)

TS207.53

A

1002-6630(2010)18-0244-04

2010-02-11

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(NYCYTX-43)

陳芳(1979—)，女，助理研究員，碩士，研究方向為蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：fangchen326@126.com

*通信作者：吳黎明(1973—)，男，副研究員，博士，研究方向為蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：apiswu@126.com