離子色譜法測定白菜中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽及總磷、總氮

楊 敏，楊樹科，王 炯，楊 偉，王紅斌*

(云南民族大學化學與生物技術(shù)學院，云南 昆明 650031)

離子色譜法測定白菜中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽及總磷、總氮

楊 敏，楊樹科，王 炯，楊 偉，王紅斌*

(云南民族大學化學與生物技術(shù)學院，云南 昆明 650031)

以白菜為例建立超聲輔助提取(UAE)離子色譜法(IC)測定蔬菜中硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、總氮、總磷含量的方法，并對白菜各部位的硝酸鹽、亞硝酸鹽及磷酸鹽含量的分布進行研究。結(jié)果表明：當進樣量為20 μL，使用Na2CO3-NaHCO3為淋洗液，NO2－、NO3－、PO43－、總氮(TN)、總磷(TP)的最小檢出限分別為0.015、0.014、0.030、0.014、0.061mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.9990～0.9999，RSD為0.22%～0.94%，回收率為80.0%～110.0%。該法簡便快速、精密度和準確度高，15min就可完成白菜中硝酸鹽與亞硝鹽、磷酸鹽含量的分析。

離子色譜；超聲；白菜；氮；磷

Abstract：Chinese cabbage was used as the sample to establish a method for determining nitrate, nitrite, phosphate, total phosphorus (TP) and total nitrogen (TN) through ultrasound-assisted extraction and ion chromatography (UAE-IC). The distribution of these compounds in different parts of Chinese cabbage was also investigated. The detection limits for nitrate,nitrite, phosphate, TP and TN were 0.015, 0.014, 0.030, 0.014 mg/L and 0.061 mg/L, respectively, at a sample injection volume of 20 μL using an elution system composed of Na2CO3 and NaHCO3. The determination coefficients of the developed linear equations of these analytes and the precision relative standard deviations (RSDs) were in the range of 0.9990 to 0.9999 and 0.22% to 0.94%. The spike recovery rates of these analytes were between 80.0% and 110.0%. This method is characteristic of simple operation, fast detection, and accurate and reliable results.

Key words：ion chromatography；ultrasound；Chinese cabbage；nitrogen；phosphorus

近年來，蔬菜的安全性問題備受人們關(guān)注，我國已對無公害蔬菜中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量作了限量標準[1]：葉菜類亞硝酸鹽≤4.0mg/kg、硝酸鹽≤3000mg/kg。蔬菜是人體硝酸鹽的主要來源，人體攝入的硝酸鹽有70%～80%來自蔬菜[2]，在正常情況下，蔬菜從土壤中吸收的硝酸鹽在體內(nèi)經(jīng)硝酸還原酶的作用，轉(zhuǎn)化為氨和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[3]。此外，在體內(nèi)細菌的作用下硝酸鹽可還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽可與仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸結(jié)合，形成亞硝胺，亞硝酸鹽可使血液的載氧能力下降，導致高鐵血紅蛋白癥；亞硝胺會誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變。因此，對蔬菜中無機鹽的控制，是當前國內(nèi)外的重要研究課題。

超聲輔助萃取(ultrasonic-assisted extraction，UAE)是利用空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機械攪拌、強化擴散、乳化作用、凝聚作用等理化特性對目標產(chǎn)物進行提取，具有快速、常溫、能耗低、提取率高等優(yōu)點[4]而越來越受到人們的重視。本實驗利用梅花布點法對白菜進行采樣，超聲提取，SPE-C18小柱凈化，離子色譜法分析白菜中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、總氮(TN)、總磷(TP)，旨在為白菜中氮、磷的測定提供方法學參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮白菜 昆明市呈貢縣郎家營農(nóng)貿(mào)市場。

KNO3、KNO2、KH2PO4、Na2HPO4(均為優(yōu)級純)；K2S2O8、NaOH(均為分析純)。

標準貯備液(1000mg/L)：硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、總磷磷酸鹽(Na2HPO4)等溶液用超純水配制，于4℃條件下保存；氧化液：0.074mol/L過硫酸鉀和0.075mol/L氫氧化鈉混合溶液[5]。使用時用超純水稀釋至所需濃度，配制不同濃度的混合標準溶液。

ICS-1500型離子色譜儀、DS6溫控電導檢測器、IonPac AS14(250mm×4.0mm)離子交換柱、IonPac AG14(50mm×4.0mm)保護柱、ASRS-300自動再生抑制器、chromeleon工作站(軟件帶空白扣除) 美國戴安公司；AS10200AD超聲波清洗機 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；0.45μm微孔過濾器、SPE-C18固相萃取小柱、尼龍0.22μm微孔濾膜 天津富集科技有限公司。

1.2 色譜條件

儀器平衡時間為10～15min；柱溫為30℃；定量進樣環(huán)為20μL；淋洗液為3.5mmol/L Na2CO3+1.0mmol/L NaHCO3；抑制器電流為24mA；流速為1.2mL/min，以峰面積定量。

采動應(yīng)力對巷道底板的變形量影響很大，五陽礦76采區(qū)2號專用回風巷在相鄰工作面開采超前支承應(yīng)力的作用下，巷道底板載荷急劇增加。取巷道寬度b=5.0 m，埋深H=560 m，P為1.5γH，得出五陽采區(qū)2號專用回風巷底鼓破壞滿足上述條件④，說明其底板會發(fā)生如圖5d所示的破壞形式，即全斷面擠壓流動底鼓。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的提取(硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽)

取新鮮白菜樣品，用自來水洗凈后用蒸餾水沖洗，再用超純水沖洗，晾干。準確稱取20.00g樣品放于研缽中，研磨至勻漿，然后加入適量超純水(控制在90mL以下)，制成勻漿系統(tǒng)，超聲波提取0～30min后，0.45μm濾膜過濾，取全部濾液定容于100mL容量瓶中。樣品取主體濃度(中間部分)10mL于50mL容量瓶中稀釋定容，待去除干擾物。

1.3.2 TN、TP的提取[6-7]

取上述采樣的白菜，經(jīng)清洗、晾干后，四分法取樣20.00g，研磨、超聲提取后，加入氧化液2.5mL，同時以試劑空白作參比，密封后放入高壓蒸汽消毒器中，加熱至120℃時維持30min，取出冷卻至室溫，0.45μm濾膜過濾，取濾液定容于100mL容量瓶中，從中取10mL溶液于50mL容量瓶中稀釋定容，待去除干擾物。

1.3.3 樣品的凈化

蔬菜汁中含有許多大分子有機物、色素和一些影響待測離子出峰的無機離子，不僅會污染分離柱，還會縮短柱的使用壽命，降低靈敏度。SPE-C18固相萃取小柱不含陰、陽離子交換位點，能強保留疏水性物質(zhì)。因此，用經(jīng)活化(甲醇)的SPE-C18小柱凈化樣品，棄去前10mL，收集后2mL樣品溶液經(jīng)0.22μm濾膜過濾，測定。

1.4 測定方法

采用標準曲線法測定[8]。分別用標準儲備液配混合標準系列，以質(zhì)量濃度對電導響應(yīng)值做線性回歸進行定量計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品離子色譜圖

亞硝酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽的三元標準樣品色譜圖見圖1。由圖1(a)、2(a)可知，標準品的基線平穩(wěn)、峰形對稱、分離效果好。蔬菜中基體組成復雜，干擾物質(zhì)多，會使出峰時間延遲，峰拖尾，變形，由圖1(b)、2(b)可見，用本實驗的樣品前處理方法和色譜條件，各離子都得到了較好的分離。比較圖1、2可知，用碳酸鈉、碳酸氫鈉(pH=9.5±2)為淋洗液體系，TP的定性和定量以計，保留時間均為10.5min。

圖1 離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of nitrate, nitrite and phosphate

圖2 TN、TP離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of total phosphorus and total nitrogen

2.2 線性范圍、精密度和檢出限

依上述1.2節(jié)色譜條件，待測各離子的線性范圍、精密度(RSD)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 5種物質(zhì)的線性范圍、精密度、回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear range, precision, regression equation and correlation coefficient of five materials

表2 回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 2 Results of recovery experiments (n=6)%

2.3 加標回收率實驗[9-15]

同時進行所有樣品的制備，向其中一份菜莖(總共2份)中加入混標標準，使成為0.50、0.70、0.90mg/kg 3個質(zhì)量濃度梯度，每個梯度6個平行樣品，經(jīng)前處理過柱凈化后測其加標回收率，結(jié)果如表2所示。

由回收率統(tǒng)計結(jié)果可知：使用超聲提取，C18小柱凈化測定蔬菜中的氮和磷，不僅提取速度快，而且加標回收率都在80%～110%之間，說明該方法準確度較好。

2.4 提取條件的優(yōu)化

蔬菜中的無機陰離子易溶于水形成離子態(tài)，連續(xù)性超聲水提在實驗過程中無污染、提取速度快，使用IonPac AS14色譜分離柱易實現(xiàn)前處理和分離。按文獻[16-17]報道的方法，對顯著性影響因素超聲時間進行優(yōu)化選擇。

取蔬菜樣品，分別在0、10、15、20、25、30min時間段里用菜莖進行超聲實驗。

圖3 硝酸鹽超聲輔助萃取曲線Fig.3 UAE curve of nitrate

圖4 亞硝酸鹽超聲輔助萃取曲線Fig.4 UAE curve of nitrite

圖5 磷酸鹽超聲輔助萃取曲線Fig.5 UAE curve of phosphate

從圖3～5可以看出，超聲時間在20min內(nèi)，硝酸鹽、亞硝酸鹽和磷酸鹽隨萃取時間增加萃取量增加，20min后萃取量基本不再增加，本實驗選擇萃取時間25min。

2.5 樣品穩(wěn)定性實驗

取經(jīng)前處理好的腐葉，分別保存0、2、4、6、10、12h后進行IC測定，其含量變化如圖6～8所示。

由圖6可知，儲備后，硝酸鹽含量在0～2h下降，2～4h微升，4～10h上升稍快，10～12h下降。而圖7中亞硝酸鹽含量的變化基本與之相反，這說明在微生物的作用下，硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽[18]。圖8中磷酸鹽樣品在0～4h含量逐漸減少，4～9h上升，9～12h含量無變化，但高于現(xiàn)測的水平。

圖6 硝酸鹽穩(wěn)定性曲線Fig.6 Stability curve of nitrate

圖7 亞硝酸鹽穩(wěn)定性曲線Fig.7 Stability curve of nitrite

圖8 磷酸鹽穩(wěn)定性曲線Fig.8 Stability curve of phosphate

2.6 樣品的測定

2.6.1 不同部位樣品的測定

表3 樣品中不同部位含量的測定Table 3 Contents of nitrate, nitrite and phosphate in different parts of Chinese cabbage mg/kg

由表3可知，除了腐葉中亞硝酸鹽含量超標[1]，正?？墒巢糠种校跛猁}集中在菜莖、亞硝酸鹽集中在菜葉，磷酸鹽集中在菜根。

取不同部位的樣品四分法取樣進行TN、TP測定，TN含量為509.95mg/kg，TP含量為1080mg/kg。

2.6.2 15個樣品的測定

用梅花布點法[19]和隨機取樣法分別采集昆明市呈貢縣郎家營菜地和農(nóng)貿(mào)市場15個樣品，在優(yōu)化條件下用相同的樣品前處理方法和色譜條件測定，結(jié)果見表4。

表4 15個樣品含量的測定Table 4 Contents of nitrate, nitrite, phosphate, TP and TN in 15 samples mg/kg

待測樣品中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽經(jīng)超聲提取后，溶于水相，以形式存在，經(jīng)IC分析可知：15個樣品中除農(nóng)貿(mào)市場樣品的亞硝酸鹽含量大于國家限量標準(4.0mg/kg)外，其他樣品均低于限量標準，總體平均值在3.78mg/kg。硝酸鹽含量均低于國家標準限量(3000mg/kg)。磷酸根是人體合成細胞壁的基礎(chǔ)物質(zhì)，蔬菜中的磷酸鹽安全、無毒，對人體有補鈣、補鐵、補鋅等作用，是人體從食物中獲取的主要途徑。

3 結(jié) 論

本實驗用UAE-IC法對白菜中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、TN、TP進行了分析測定研究，在樣品的預處理過程中，選擇了適宜的前處理、提取、凈化方法，避免了不必要的待測組分流失。在樣品測定過程中，選擇了合適的稀釋倍數(shù)、淋洗液及濃度、流量，獲得了較好的分離效果。相關(guān)系數(shù)和回收率都很好。表明了該檢測方法簡便易行、結(jié)果可靠、適用于大批量進樣。可為其他植物中無機陰離子的快速檢測提供參考。

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Determination of Nitrate, Nitrite, Phosphate, Total Phosphorus and Total Nitrogen in Vegetables Using Ion Chromatography

YANG Min，YANG Shu-ke，WANG Jiong，YANG Wei，WANG Hong-bin*
(School of Chemistry and Biotechnology, Yunnan University of Nationalities, Kunming 650031, China)

O611.5

A

1002-6630(2010)18-0216-04

2009-12-31

國家自然科學基金項目(60963026)；云南省社會發(fā)展科技(應(yīng)用基礎(chǔ)研究)項目(2009CD100)；云南民族大學大學生創(chuàng)新型實驗計劃項目(2010HSCX01)

楊敏(1966—)，女，教授，碩士，研究方向為色譜分離分析。E-mail：yangm4849@tom.com

*通信作者：王紅斌(1966—)，男，教授，碩士，研究方向為分離分析技術(shù)及應(yīng)用。E-mail：wanghb2152@tom.com