• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    反相高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法測定滸苔中的葉黃素

    2010-10-19 05:27:08程紅艷陳軍輝趙恒強(qiáng)王小如臧家業(yè)
    食品科學(xué) 2010年18期
    關(guān)鍵詞:葉黃素丙酮提取液

    程紅艷,陳軍輝,*,趙恒強(qiáng),史 倩,王小如,2,臧家業(yè)

    (1.國家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心,山東 青島 266061;2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,福建 廈門 361005)

    反相高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法測定滸苔中的葉黃素

    程紅艷1,陳軍輝1,*,趙恒強(qiáng)1,史 倩1,王小如1,2,臧家業(yè)1

    (1.國家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心,山東 青島 266061;2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,福建 廈門 361005)

    建立反相高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法(RP-HPLC-DAD-ESI-MS)定性、定量測定綠潮藻滸苔中葉黃素的新方法。滸苔樣品經(jīng)超聲輔助提取后,采用RP-HPLC-DAD-ESI-MS聯(lián)用技術(shù)對其進(jìn)行分離鑒定,HPLC采用Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm,5μm)色譜柱,以含0.2%乙酸的甲醇溶液-水為流動(dòng)相,線性梯度洗脫,檢測波長450nm。在選定的最佳儀器條件下,葉黃素與滸苔中的其他化合物分離良好,葉黃素在0.10~20.0mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9994),能對滸苔提取液中的葉黃素進(jìn)行準(zhǔn)確定量;采用電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用分析能快速獲得葉黃素的分子量信息,可為滸苔中葉黃素的快速鑒別提供依據(jù)。

    滸苔;葉黃素;高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法

    Abstract:A reversed-phase high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization mass spectrometry (RP-HPLC-DAD-ESI-MS) method was established for qualitative identification and quantitative determination of lutein inEnteromorpha prolifera. Lutein was extracted fromEnteromorpha proliferathrough ultrasound-assisted extraction,and then analyzed by RP-HPLC-DAD-ESI-MS. HPLC was carried out at the conditions of Eclipse XDB-C18 (4.6 mm × 150 mm) column, MeOH-0.2% acetic acid-water (V/V) as the mobile phase with linear gradient elution and detection wavelength of 450 nm. Results indicated that the developed method could be used for the determination of lutein inEnteromorpha proliferawith a good resolution and linear relationship in the range from 0.10 to 20.0 mg/L (R2=0.9994). Molecular weight of lutein was rapidly evaluated by ESI-MS detection. Combined with literature information, lutein inEnteromorpha proliferacould be rapidly identified. This developed method is specific, simple, fast, sensitive and feasible for rapid identification and quantification of lutein, which can eliminate the interference of other pigments and derivatives fromEnteromorpha prolifera.

    Key words:Enteromorpha prolifera;lutein;HPLC-ESI-MS

    葉黃素是類胡蘿卜素的一種,廣泛存在于蔬菜、花卉、水果及某些藻類生物中,在植物光合作用中起到保護(hù)作用[1]。近些年研究表明,葉黃素具有多種重要的生理功能[2-3],可治療白內(nèi)障,調(diào)節(jié)人體免疫力,預(yù)防癌癥以及視黃斑退化,還具有明顯的防輻射、護(hù)膚、潤膚和抗衰老等作用,此外,葉黃素還是一個(gè)很好的天然著色劑,因而引起人們的重視。盡管大部分植物的葉片、花朵及果實(shí)中均含有葉黃素,但我國當(dāng)前主要將萬壽菊、金盞菊作為葉黃素分離提取的資源[4],來源有限,導(dǎo)致葉黃素的價(jià)格居高不下,開發(fā)新的資源尤為重要。

    海洋植物中葉綠素和輔助色素的含量高于陸生植物,而且海洋植物生長快、產(chǎn)量大,是天然葉黃素開發(fā)的良好原料[5]。近兩年青島附近海域爆發(fā)的滸苔綠潮,打撈出大量滸苔藻,為天然葉黃素的開發(fā)提供了豐富的資源。然而目前國內(nèi)還沒有關(guān)于綠潮藻滸苔中葉黃素定性、定量測定的報(bào)道,也缺乏滸苔中葉黃素快速測定的有效方法。目前,對于葉黃素的分析和檢測國內(nèi)外已有一些方法[6],如分光光度法、薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜法(MS)等。其中HPLC法作為一種快速的分析方法,具有樣品處理簡單、分離效果好、選擇性強(qiáng)、檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[7-8]被應(yīng)用于部分植物和食品的葉黃素的定量測定[9-10]。高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)是天然產(chǎn)物有效成分定性、定量分析強(qiáng)有力的工具[11-12]。至今,采用LCMS法測定葉黃素的報(bào)道還極少,僅Lakshminarayana等[13]利用液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法分析人體內(nèi)黃斑葉黃素的代謝產(chǎn)物。但對于利用高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法(HPLC-ESI-MS)法分析測定滸苔中的葉黃素研究國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道。本研究采用超聲波輔助提取法對滸苔中的葉黃素進(jìn)行高效快速提取,通過對色譜條件的系統(tǒng)優(yōu)化,建立滸苔中葉黃素HPLC-DAD定量測定方法,并建立HPLC-ESI-MS鑒別滸苔中葉黃素的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    滸苔樣品為2008年7月份采自青島海域近岸,在-76℃的超低溫冰箱中冷凍保存。

    甲醇、乙腈和丙酮(均為色譜純) 德國Merck公司;乙酸(優(yōu)級(jí)純);抗壞血酸(VC)及其他試劑均為國產(chǎn)分析純;蘆丁(純度98%,葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品) 中國藥品生物制品檢定所;實(shí)驗(yàn)中所用溶液均用超純水配制,HPLC用試劑均經(jīng)過0.45μm微孔濾膜過濾及超聲脫氣處理。

    1200高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器(DAD)、自動(dòng)進(jìn)樣器、四元梯度泵)、G6320型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀、Eclipse XDB-C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm) 美國Agilent公司; KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司;R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;FA1104型電子天平 上海精天電子儀器廠;Milli-Q(18.2MΩ)超純水處理系統(tǒng) 美國Millipore公司。

    1.2 方法

    1.2.1 色譜條件

    Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm,5μm)色譜柱;流動(dòng)相:水(A),含0.2%乙酸的甲醇溶液(B),梯度洗脫程序?yàn)椋?~8min,98% B;8~10min,98%~100%B;10~25min;100% B。柱溫25℃,流速0.8mL/min,DAD檢測器在450nm波長處檢測,進(jìn)樣量為50μL。

    1.2.2 質(zhì)譜條件

    HPLC-MS條件:電噴霧離子源(ESI),正離子電離,參數(shù)設(shè)定方式:智能設(shè)定(Smart),干燥氣溫度350℃,噴霧氣壓40psi,干燥氣(N2)流速10.0L/min,目標(biāo)質(zhì)荷比為m/z600,化合物穩(wěn)定性100%,捕集效率100%,質(zhì)量掃描范圍m/z100~1000。

    HPLC-MS2條件:電噴霧離子源(ESI),正離子電離,參數(shù)設(shè)定方式:智能設(shè)定(Smart),干燥氣溫度350℃,噴霧氣壓40psi,干燥氣(N2)流速10.0L/min,目標(biāo)質(zhì)荷比為m/z600,化合物穩(wěn)定性100%,捕集效率100%;檢測方式:手動(dòng)多級(jí)質(zhì)譜檢測(Manual MSn),二級(jí)質(zhì)譜母離子m/z589,二級(jí)質(zhì)譜碰撞電壓1.00V,碰撞氣體為氦氣。

    1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    準(zhǔn)確稱取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg,置于100mL容量瓶中,用丙酮定容至100mL得到質(zhì)量濃度為50mg/L的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,取少量標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋至合適質(zhì)量濃度,用于色譜條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液密封后置于冰箱中-4℃冷藏保存。

    1.2.4 供試品溶液的制備

    將滸苔冷凍干燥,存放于冰箱冷藏狀態(tài)下備用。平行精密稱取3份干滸苔樣品各0.05g,置于15mL玻璃離心管中,加入1mL的質(zhì)量濃度不高于1.0g/L的VC溶液,避光浸潤5min后,加入5mL丙酮,采用避光冰浴超聲,超聲功率320W,提取時(shí)間8min,用0.45μm微孔濾膜過濾,置于棕色進(jìn)樣瓶中,待測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 色譜條件的優(yōu)化

    2.1.1 色譜柱的選擇

    據(jù)文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道,反相HPLC技術(shù)較常用于葉黃素的分析測定,而甲醇-水-丙酮以及甲醇-丙酮混合液多作為分離葉黃素的流動(dòng)相;考慮到葉黃素是一種極性較小、易于被反相柱保留的化合物,而滸苔粗提物所含的化合物又較為復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)以不同比例的水-甲醇混合液為流動(dòng)相,對4根不同特點(diǎn)的反相C18柱進(jìn)行比較優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同特點(diǎn)的色譜柱對滸苔中葉黃素分離結(jié)果差異較大,4根色譜柱當(dāng)中Agilent公司的Eclipse XDB-C18所獲得的分離結(jié)果最為理想(各峰分離度高,峰型對稱),這就說明在滸苔中葉黃素的HPLC分析中,選擇合適的色譜柱是非常關(guān)鍵的。

    2.1.2 流動(dòng)相的選擇

    在選定色譜柱之后,對以水-甲醇以及甲醇-水-丙酮為流動(dòng)相進(jìn)行比較,結(jié)果表明以水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)分離效果較好;在流動(dòng)相中添加一定量的酸或緩沖鹽可以改善分離效果以及色譜峰形。在本研究中分別將少量的磷酸、乙酸、乙酸氨、磷酸鹽加入流動(dòng)相中,結(jié)果表明在流動(dòng)相中添加0.2%的乙酸就能獲得理想的分離結(jié)果,并且使用乙酸配制流動(dòng)相簡單方便、不損壞柱子和儀器硬件,乙酸具有揮發(fā)性與質(zhì)譜檢測器兼容,利于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析葉黃素方法的開發(fā)。

    2.1.3 測定波長的選擇

    圖1 葉黃素的DAD掃描光譜圖Fig.1 DAD scan spectrum of lutein

    葉黃素在可見光區(qū)有較強(qiáng)的特征吸收峰,為了使葉黃素能獲得較高的靈敏度,本研究通過DAD全波段掃描(300~800nm),考察不同檢測波長對葉黃素測定靈敏度的影響(葉黃素的掃描光譜圖見圖1),結(jié)果表明450nm為檢測波長時(shí),葉黃素檢測的靈敏度較高,并且能排除其他化合物的干擾,因此選擇450nm作為滸苔中葉黃素測定的最佳檢測波長,與文獻(xiàn)[10]報(bào)道結(jié)果一致。

    2.2 超聲波輔助提取條件的優(yōu)化

    2.2.1 超聲功率對葉黃素提取效果的影響

    常溫條件下,稱取滸苔干樣品0.05g,置于15mL玻璃離心管中,加入1mL的超純水,避光浸潤5min后,加入5mL丙酮,超聲波提取3min,進(jìn)行測定,根據(jù)葉黃素峰面積考察超聲功率對滸苔中葉黃素提取效果的影響。

    圖2 超聲功率對葉黃素提取效率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency of lutein fromEnteromorpha prolifera

    從圖2可以看出,超聲功率對葉黃素的提取效果的影響不大。隨著功率的增加,葉黃素色譜峰峰面積逐漸升高,當(dāng)超聲波功率為320W時(shí),葉黃素的峰面積升至最高,而后略有下降。超聲波功率小,葉黃素提取不完全,功率太大可能造成葉黃素分解,含量下降。由此可知,采用超聲波提取滸苔葉黃素,最適頻率應(yīng)選擇在320W左右。

    2.2.2 超聲時(shí)間對葉黃素提取效果的影響

    常溫條件下,稱取滸苔干樣品0.05g,置于15mL玻璃離心管中,加入1mL的超純水,避光浸潤5min后,加入5mL丙酮,超聲功率為320W,進(jìn)行不同時(shí)間超聲提取,進(jìn)行測定,根據(jù)葉黃素峰面積考察超聲時(shí)間對滸苔中葉黃素提取效果的影響。

    圖3 超聲時(shí)間對葉黃素提取效率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction efficiency of lutein fromEnteromorpha prolifera

    從圖3可以看出,超聲時(shí)間對葉黃素的提取效果影響較大。隨著提取時(shí)間的逐漸增大,滸苔葉黃素的提取量也逐漸增大。提取時(shí)間為8min時(shí),葉黃素的峰面積最高;8min之后隨著提取時(shí)間的延長,葉黃素的提取量反而逐漸下降。由此可知,采用超聲波提取滸苔葉黃素,最適提取時(shí)間在8min左右。

    2.2.3 超聲方式對葉黃素提取效果的影響

    常溫條件下,稱取滸苔干樣品0.05g,置于15mL玻璃離心管中,加入1mL的超純水,避光浸潤5min后,加入5mL丙酮,超聲功率為320W,超聲提取8min,進(jìn)行測定,根據(jù)葉黃素峰面積考察超聲方式對滸苔中葉黃素提取效果的影響。

    表1 不同超聲方式葉黃素提取效率結(jié)果(n=3)Table 1 Extraction efficiency of lutein using different ultrasonic modes (n=3)

    從表1可以看出,避光超聲對滸苔中葉黃素提取優(yōu)于不避光超聲提取。冰浴超聲提取可以提高葉黃素的提取效果。由此可知,采用避光冰浴超聲提取滸苔葉黃素是最佳的超聲提取方式。

    2.3 滸苔提取液中葉黃素的穩(wěn)定性考察

    2.3.1 提取溶劑對葉黃素穩(wěn)定性的影響

    據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道,由于葉黃素是一種抗氧化劑,在溶液中不穩(wěn)定,且在不同溶液中的穩(wěn)定性不同;本研究取3份0.05g的干滸苔,其中兩份用1mL超純水避光浸潤后,再分別用15mL的甲醇、丙酮超聲提取;另外一份用1mL VC溶液避光浸潤后,用15mL的丙酮超聲提取,按1.2.4節(jié)方法將其制成供試品溶液,按1.2.1節(jié)色譜條件,在0、2、4、8、12、24h分別進(jìn)樣測定,測得葉黃素的峰面積。根據(jù)葉黃素峰面積與其0h的面積相對值考察其穩(wěn)定性。

    圖4 提取溶劑對葉黃素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of different solvents on the stability of lutein

    從圖4可以看出,不同的提取溶劑對葉黃素的穩(wěn)定性影響顯著。在10h內(nèi),丙酮提取液中的葉黃素穩(wěn)定性在90%以上,高于甲醇提取液中的葉黃素。超過10h后,甲醇和丙酮提取液中的葉黃素的穩(wěn)定性都在90%以下,但甲醇的葉黃素提取液的穩(wěn)定性稍好。而丙酮+VC作為提取溶劑得到的葉黃素在24h內(nèi)其穩(wěn)定性都達(dá)到90%以上??梢?,VC可以作為葉黃素的穩(wěn)定劑。所以,本實(shí)驗(yàn)選擇丙酮+VC作為最佳的提取溶劑。

    2.3.2 VC溶液的質(zhì)量濃度對葉黃素穩(wěn)定性的影響

    圖5 VC質(zhì)量濃度對葉黃素穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of ascorbic acid concentration on the stability of lutein

    由文獻(xiàn)[14-15]可知,VC對葉黃素的存放有一定保護(hù)作用。配制從0.1~2.5g/L不同的9個(gè)質(zhì)量濃度的VC溶液,按1.2.4處理方法將其制成供試品溶液,按1.2.1節(jié)色譜條件,在0、24h分別進(jìn)樣測定,測得葉黃素的峰面積。根據(jù)葉黃素峰面積的相對值考察其穩(wěn)定性。

    從圖5可知,VC溶液質(zhì)量濃度小于1.0g/L,葉黃素在24h內(nèi)的穩(wěn)定性在95%以上,質(zhì)量濃度高于1.0g/L,葉黃素穩(wěn)定性下降。可見,VC作為抗氧劑對葉黃素的穩(wěn)定性有一定保護(hù)作用,但是其質(zhì)量濃度不宜高于1.0g/L。

    2.4 樣品測定

    2.4.1 滸苔中葉黃素的色譜測定

    圖6 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(A)及滸苔提取液(B)高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of lutein standard and the extract fromEnteromorpha prolifera

    根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對滸苔中葉黃素的色譜峰初步定性,將樣品測定色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行比較,以確定葉黃素相應(yīng)峰位。按1.2.1節(jié)色譜條件測定對照品溶液和供試品溶液,色譜圖如圖6所示,在選定色譜條件下葉黃素色譜峰對稱性好,與其他組分達(dá)到基線分離,可準(zhǔn)確測定其峰面積,以峰面積進(jìn)行定量分析。

    2.4.2 滸苔中葉黃素的質(zhì)譜鑒別

    對葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品和滸苔提取液進(jìn)行HPLC-MS檢測,通過比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(圖6)和質(zhì)譜圖(圖7)可以看出,滸苔提取液在同樣的條件下該保留時(shí)間處的質(zhì)譜碎片及其特征離子豐度(圖7B)與標(biāo)準(zhǔn)品(圖7A)一致,從而進(jìn)一步證明該滸苔中含有葉黃素。葉黃素的分子量為568,電噴霧一級(jí)質(zhì)譜分析特征離子為m/z589、306,其中m/z589峰為基峰,根據(jù)質(zhì)量數(shù)確定m/z589離子為[M+Na-2H]+離子峰,而葉黃素分子離子峰m/z568[M]+信號(hào)十分微弱,沒有看到準(zhǔn)分子離子峰m/z569[M+H]+,說明采用電噴霧質(zhì)譜分析葉黃素不易產(chǎn)生分子離子峰和準(zhǔn)分子離子峰,易產(chǎn)生[M+Na-2H]+離子峰,另外,初步確定m/z306峰為[M+Na-2H]+離子峰的碎片峰。

    圖7 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和滸苔中葉黃素(B)HPLC-MS質(zhì)譜圖Fig.7 HPLC-MS spectra of lutein standard and lutein in the extract fromEnteromorpha prolifera

    圖8 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和滸苔中葉黃素(B)HPLC-MS2質(zhì)譜圖Fig.8 HPLC-MS-MS spectra of lutein standard and lutein in the extract fromEnteromorpha prolifera

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證m/z306離子峰的來源,并探明葉黃素的電噴霧質(zhì)譜分析裂解規(guī)律,以m/z589([M+Na-2H]+)離子峰為母離子,對葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液和滸苔提取液中的葉黃素峰進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜分析,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜見圖8。樣品在該保留時(shí)間處的二級(jí)質(zhì)譜特征離子(圖8B)與標(biāo)準(zhǔn)品(圖8A)一致,確定m/z306([M+Na-C20H28O-H]+)峰為m/z589([M+Na-2H]+)離子峰的碎片峰,更進(jìn)一步證明滸苔中含有葉黃素。根據(jù)葉黃素電噴霧一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜特征,推斷葉黃素電噴霧質(zhì)譜分析可能的質(zhì)譜裂解方式見圖9。

    圖9 葉黃素裂解規(guī)律圖Fig.9 Fragmentation pathways of lutein

    2.5 方法學(xué)考察

    2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限

    本研究采用外標(biāo)法對滸苔中葉黃素進(jìn)行定量,用峰面積對質(zhì)量做工作曲線,由試樣峰面積求出其實(shí)際含量。取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液(質(zhì)量濃度為50.00mg/L)再用色譜純丙酮分別稀釋成0.1、0.4、1.0、2.0、5.0、20.0mg/L,按1.2.1節(jié)色譜條件,以測定的峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.7281x-7.0804,R2=0.9994。

    說明本方法測定葉黃素在0.10~20.0mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋進(jìn)樣,測其峰高響應(yīng)值及基線噪音強(qiáng)度,以RSN=3計(jì)算檢出限。葉黃素的檢出限為0.03mg/L。

    2.5.2 精密度

    取一份供試品溶液,重復(fù)測定5次(進(jìn)樣量為10μL),記錄各次的峰面積和保留時(shí)間,葉黃峰面積的RSD值為1.13%,保留時(shí)間的RSD值為0.38%,表明儀器的精密度良好。

    2.5.3 重復(fù)性

    精密稱取同一樣品5份,按1.2.4節(jié)方法將其制成供試品溶液,分別進(jìn)樣測定,測得葉黃素的峰面積和保留時(shí)間,計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,葉黃素峰面積的RSD值為3.41%,保留時(shí)間的RSD值0.41%,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.5.4 穩(wěn)定性

    取一份供試品溶液,分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、8、16、24h進(jìn)樣測定,測得葉黃素的峰面積和保留時(shí)間,計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,葉黃素峰面積的RSD值為4.91%,保留時(shí)間的RSD值0.32%,顯示供試品溶液至少在24h穩(wěn)定。

    2.5.5 加標(biāo)回收率

    表2 滸苔葉黃素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Recovery experiments for lutein fromEnteromorpha prolifera(n=3)

    精密稱取已知葉黃素含量的滸苔樣品6份,加入一定量的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,然后按1.2.4節(jié)供試品溶液的制備方法處理,用1.2.1節(jié)色譜條件測定加樣回收率。由表2可以看出,方法回收率較高,葉黃素的回收率均在97%以上,進(jìn)一步說明本方法可用于滸苔樣品中葉黃素含量的測定。

    2.6 滸苔樣品中葉黃素的含量測定

    取5個(gè)不同采集地點(diǎn)的滸苔樣品,每個(gè)樣品取質(zhì)量相等的3份,按1.2.4節(jié)方法將其制備成供試品溶液,按1.2.1節(jié)色譜條件測定供試品溶液,將測得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算滸苔中葉黃素的含量,5個(gè)不同采集地點(diǎn)滸苔樣品中葉黃素的測定結(jié)果見表3。

    表3 滸苔樣品中葉黃素的含量(n=3)Table 3 Lutein contents in differentEnteromorpha proliferasamples(n=3)

    3 結(jié) 論

    本研究建立反相高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法定性、定量測定綠潮藻滸苔中葉黃素的新方法。利用質(zhì)量濃度不高于1.0g/L的VC溶液浸潤滸苔樣品,解決了葉黃素提取液不穩(wěn)定的難題。經(jīng)超聲波提取優(yōu)化選定提取滸苔中的葉黃素最佳條件,該方法簡便易操作、提取效率高;所建立的HPLC-DAD測定滸苔中葉黃素的方法,在選定的色譜條件下,葉黃素分離度高,方法重復(fù)性好、回收率高,可作為滸苔中葉黃素含量快速測定的方法;采用HPLC-ESI-MS和HPLC-ESI-MS2可實(shí)現(xiàn)滸苔中葉黃素的快速鑒別,并由此推斷出葉黃素的可能質(zhì)譜裂解規(guī)律,該質(zhì)譜分析方法專屬性強(qiáng),適用于天然產(chǎn)物中葉黃素快速鑒別。

    [1] 王仁雷, 劉友良, 華春. 植物葉黃素循環(huán)的組成、功能和調(diào)節(jié)[J]. 亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2000, 29(4):59-66.

    [2] ISLAM S. Sweetpotao (Ipomoea batatasL.) leaf:Its potential effect on human health and nutrition[J]. Journal of Food Science, 2006, 71(2):13-21.

    [3] del CAMPO J A, MORENO J, RODRIGUEZ H, et al. Carotenoid content of chlorophycean microalgae:factor determining lutein accumulation inMuriellopsissp. (Chlorophyta)[J]. Journal of Biotechnology,2000, 76:51-59.

    [4] 李大婧, 劉春泉. 萬壽菊葉黃素的提取及分析方法的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(9):582-585.

    [5] 諶素華, 王維民, 蔡清. 綠藻石莼葉綠素提取工藝的研究[J]. 食品科技, 2008(2):172-175.

    [6] 王琦, 許洪高, 高彥祥. 葉黃素分析方法研究進(jìn)展[J]. 中國食品添加劑, 2007(6):100-104.

    [7] 王克勤, 羅軍武, 陳靜萍, 等. 芹菜提取物中芹菜素HPLC和HPLC定量分析研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(4):291-295.

    [8] 劉宏程, 萬至飛, 黎其萬, 等. 基質(zhì)量固相分散-HPLC測定松花蛋中的蘇丹紅[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(3):400-402.

    [9] 趙志紅, 張逢秋, 朱慧. 反相高相液相色譜法測定食品中的葉黃素[J]. 食品科技, 2009, 34(1):261-263.

    [10] 石晉, 欒雨時(shí), 王靜云, 等. HPLC法測定甘薯葉片中的葉黃素[J]. 植物研究, 2008, 28(6):767-769.

    [11] 陳軍輝, 李文龍, 王小如, 等. 高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜分析娑羅子中皂苷成分[J]. 分析化學(xué), 2008, 36(3):285-291.

    [12] 李文龍, 陳軍輝, 王小如, 等. 加速溶劑萃取-高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析蓮子心中生物堿[J]. 分析化學(xué), 2008, 36(1):79-82.

    [13] LAKSHMINARAYANA R, ARUNA G, SANGEETHA R K, et al.Possible degradation of luteinin vitroandin vivo:isolation and structural elucidation of lutein metabolites by HPLC and LC-MS[J].Free Radical Biology and Medicine, 2008, 45:982-993.

    [14] 稱志行, 王建平, 黃創(chuàng)興. 葉黃素提取和穩(wěn)定性研究[J]. 食品科學(xué),2005, 26(9):264-287.

    [15] 杜桂彩, 郭群群, 滕大衛(wèi), 等. 高純度葉黃素的制備及其穩(wěn)定性研究[J]. 精細(xì)化工, 2004, 21(6):447-449.

    Determination of Lutein inEnteromorpha proliferaby Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector-Electrospray Ionization Mass Spectrometry

    CHENG Hong-yan1,CHEN Jun-hui1,*,ZHAO Heng-qiang1,SHI Qian1,WANG Xiao-ru1,2,ZANG Jia-ye1
    (1. Research Center for Marine Ecology, The First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration People’ s Republic of China,Qingdao 266061, China;2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

    TS207.3

    A

    1002-6630(2010)18-0206-06

    2009-12-09

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20905017);科技部海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200705011;200805039);國家海洋局第一海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(GY-022008T32;2010G25);國家海洋局青年基金資助項(xiàng)目(2010140)

    程紅艷(1983—),女,碩士研究生,主要從事海洋天然產(chǎn)物研究。E-mail:chenghongyan710@163.com

    *通信作者:陳軍輝(1978—),男,助理研究員,博士,主要從事海洋天然產(chǎn)物研究。E-mail:jhchen@fio.org.cn

    猜你喜歡
    葉黃素丙酮提取液
    亞麻木脂素提取液滲透模型建立與驗(yàn)證
    天然葉黃素在水產(chǎn)飼料中的研究與應(yīng)用
    穿山龍?zhí)崛∫翰煌兓椒ǖ谋容^
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:20:06
    山香圓葉提取液純化工藝的優(yōu)化
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:28
    葉黃素的功能及在飼料中的應(yīng)用
    廣東飼料(2016年4期)2016-12-01 03:43:17
    冷凍丙酮法提取山核桃油中的亞油酸和亞麻酸
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:37:06
    乙酰丙酮釹摻雜聚甲基丙烯酸甲酯的光學(xué)光譜性質(zhì)
    HBV-DNA提取液I的配制和應(yīng)用評價(jià)
    PVA膜滲透汽化分離低濃度丙酮/水溶液的實(shí)驗(yàn)研究
    葉黃素的抗氧化-促氧化作用研究
    av在线老鸭窝| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久人妻av系列| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美又色又爽又黄视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 此物有八面人人有两片| 18+在线观看网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 1024手机看黄色片| 日韩高清综合在线| 亚洲欧洲日产国产| 日日撸夜夜添| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲人成网站高清观看| 欧美极品一区二区三区四区| 51国产日韩欧美| 国产高清有码在线观看视频| 国产成人91sexporn| 欧美一区二区精品小视频在线| 在线观看66精品国产| 伊人久久精品亚洲午夜| 一级毛片aaaaaa免费看小| 高清在线视频一区二区三区 | 99国产极品粉嫩在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲在线观看片| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美成人精品欧美一级黄| 午夜爱爱视频在线播放| 最近手机中文字幕大全| 亚洲av一区综合| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美不卡视频在线免费观看| 中文资源天堂在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 午夜精品一区二区三区免费看| 性欧美人与动物交配| 性色avwww在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 嫩草影院精品99| 我要搜黄色片| 搡老妇女老女人老熟妇| 中国国产av一级| 久久久久久久午夜电影| 国产一区亚洲一区在线观看| 免费观看a级毛片全部| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲色图av天堂| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产探花在线观看一区二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日本一二三区视频观看| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲自偷自拍三级| 欧美bdsm另类| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| av在线观看视频网站免费| 成人毛片a级毛片在线播放| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲成人av在线免费| 伦精品一区二区三区| 伦精品一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 97超碰精品成人国产| 亚洲最大成人中文| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 中出人妻视频一区二区| 可以在线观看的亚洲视频| 97热精品久久久久久| 免费搜索国产男女视频| 一区二区三区四区激情视频 | 日本一本二区三区精品| 51国产日韩欧美| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲精品国产成人久久av| 国产一区亚洲一区在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产一区二区三区av在线 | 最近手机中文字幕大全| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 毛片一级片免费看久久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 午夜亚洲福利在线播放| 舔av片在线| 日韩强制内射视频| 国产高清有码在线观看视频| 国产黄片视频在线免费观看| 久久久久久久久久久丰满| .国产精品久久| 97超碰精品成人国产| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产亚洲精品av在线| 欧美人与善性xxx| 国产精品国产高清国产av| 国语自产精品视频在线第100页| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产男人的电影天堂91| 天堂√8在线中文| 99在线人妻在线中文字幕| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久精品国产亚洲网站| 亚洲最大成人手机在线| 高清毛片免费观看视频网站| 一个人观看的视频www高清免费观看| 91久久精品国产一区二区成人| 最后的刺客免费高清国语| 久99久视频精品免费| 桃色一区二区三区在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品蜜桃在线观看 | kizo精华| 亚洲国产精品合色在线| 国语自产精品视频在线第100页| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲欧美日韩无卡精品| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 99热精品在线国产| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 尾随美女入室| 免费无遮挡裸体视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 男人舔奶头视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 免费av毛片视频| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲欧洲日产国产| 精品久久久久久久末码| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 三级毛片av免费| 婷婷色av中文字幕| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 免费看日本二区| 一本精品99久久精品77| 青春草视频在线免费观看| 国产午夜精品论理片| 插逼视频在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲欧洲国产日韩| av国产免费在线观看| 最新中文字幕久久久久| avwww免费| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久99热这里只有精品18| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一区福利在线观看| avwww免费| 精品久久久久久久久亚洲| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲av.av天堂| 国国产精品蜜臀av免费| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲最大成人av| 舔av片在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费观看在线日韩| 国内精品美女久久久久久| 九九在线视频观看精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 男女边吃奶边做爰视频| 国产一区二区在线av高清观看| 久久久久久国产a免费观看| 久久久久久大精品| 日本av手机在线免费观看| 日本av手机在线免费观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 免费观看人在逋| 日本爱情动作片www.在线观看| 免费观看人在逋| 99riav亚洲国产免费| 欧美色欧美亚洲另类二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久这里有精品视频免费| 欧美+日韩+精品| 亚洲成人av在线免费| 成人毛片60女人毛片免费| 在线观看av片永久免费下载| 熟女电影av网| 在线免费观看不下载黄p国产| 熟女电影av网| 国产真实乱freesex| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲18禁久久av| 天堂√8在线中文| av卡一久久| 精品无人区乱码1区二区| 免费黄网站久久成人精品| 日韩视频在线欧美| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 中文字幕av成人在线电影| avwww免费| 日韩强制内射视频| 一区二区三区免费毛片| 精品无人区乱码1区二区| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品不卡视频一区二区| 小说图片视频综合网站| 国产亚洲5aaaaa淫片| 深夜精品福利| 搡老妇女老女人老熟妇| 好男人在线观看高清免费视频| 成人二区视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日韩人妻高清精品专区| 国产一区二区在线观看日韩| 久久久久久久午夜电影| 午夜老司机福利剧场| 久久精品久久久久久久性| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品国产高清国产av| 日韩一本色道免费dvd| 99久久中文字幕三级久久日本| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 最后的刺客免费高清国语| 国产一级毛片在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 中文资源天堂在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| eeuss影院久久| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲国产色片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美三级亚洲精品| 免费看a级黄色片| АⅤ资源中文在线天堂| 一区二区三区四区激情视频 | 国产成人一区二区在线| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 草草在线视频免费看| 一级二级三级毛片免费看| 能在线免费观看的黄片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 在线播放无遮挡| 国产精品一区二区性色av| 久久99热这里只有精品18| 乱人视频在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲经典国产精华液单| 久久人人精品亚洲av| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美成人a在线观看| 久久99热6这里只有精品| 免费人成在线观看视频色| 免费av不卡在线播放| av国产免费在线观看| 亚洲av成人av| 国产黄片视频在线免费观看| 乱系列少妇在线播放| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产精品一区二区三区四区久久| 嫩草影院新地址| 51国产日韩欧美| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 亚洲精品影视一区二区三区av| 春色校园在线视频观看| 如何舔出高潮| 国产伦理片在线播放av一区 | 亚洲av免费在线观看| 一区二区三区四区激情视频 | 三级国产精品欧美在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 一级毛片电影观看 | av免费观看日本| a级毛片a级免费在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品野战在线观看| 91久久精品电影网| 亚洲18禁久久av| 在现免费观看毛片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美区成人在线视频| 日日撸夜夜添| 精品久久久久久久末码| 国产乱人偷精品视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | а√天堂www在线а√下载| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久精品综合一区二区三区| 欧美性感艳星| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 日韩欧美国产在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 哪个播放器可以免费观看大片| 日本爱情动作片www.在线观看| 中文字幕制服av| 亚洲国产精品合色在线| 少妇丰满av| 美女内射精品一级片tv| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 人体艺术视频欧美日本| 亚州av有码| 国产淫片久久久久久久久| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品一区二区性色av| 国产亚洲91精品色在线| 久久国内精品自在自线图片| 免费观看精品视频网站| 悠悠久久av| 亚洲最大成人av| 青春草国产在线视频 | 国产极品精品免费视频能看的| 色吧在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 精品一区二区三区人妻视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲精品456在线播放app| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久久久国产a免费观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲第一区二区三区不卡| 高清日韩中文字幕在线| 一本久久精品| 亚洲三级黄色毛片| 悠悠久久av| 欧美性猛交黑人性爽| 久久久久性生活片| 特级一级黄色大片| av免费观看日本| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久久久久久久丰满| 女同久久另类99精品国产91| 99久久精品热视频| 国内精品宾馆在线| 国产在线男女| 亚洲真实伦在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美丝袜亚洲另类| 赤兔流量卡办理| 久久99精品国语久久久| 舔av片在线| 国产日本99.免费观看| 岛国毛片在线播放| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美人与善性xxx| 少妇被粗大猛烈的视频| 一级毛片我不卡| 欧美一级a爱片免费观看看| 成年女人看的毛片在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品久久久久久精品电影| 99久久精品国产国产毛片| 联通29元200g的流量卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲无线在线观看| 99热全是精品| 亚洲在久久综合| 欧美精品国产亚洲| 在现免费观看毛片| 国产黄片美女视频| 久久久久久久午夜电影| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 黄色配什么色好看| 99热网站在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 黄色欧美视频在线观看| 波多野结衣高清无吗| 日本爱情动作片www.在线观看| 成年免费大片在线观看| 久久九九热精品免费| 国产高清三级在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 全区人妻精品视频| 亚洲最大成人av| 99热这里只有精品一区| 1000部很黄的大片| 免费观看人在逋| 久久精品国产亚洲av天美| 插逼视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 一夜夜www| 成年av动漫网址| 日本黄色视频三级网站网址| 九九热线精品视视频播放| 欧美高清性xxxxhd video| 一区二区三区高清视频在线| 一夜夜www| 丝袜喷水一区| 此物有八面人人有两片| 男女视频在线观看网站免费| 国产在视频线在精品| 国产爱豆传媒在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 男女那种视频在线观看| 久久人人精品亚洲av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 可以在线观看毛片的网站| av免费观看日本| 亚洲四区av| 国产精品野战在线观看| 高清午夜精品一区二区三区 | 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 麻豆av噜噜一区二区三区| av天堂中文字幕网| 欧美一区二区国产精品久久精品| 内地一区二区视频在线| 午夜福利高清视频| 国产成人a∨麻豆精品| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩精品有码人妻一区| 精品人妻熟女av久视频| 在线观看66精品国产| 成年女人永久免费观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 22中文网久久字幕| 天天躁日日操中文字幕| 久久久欧美国产精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 深夜精品福利| av视频在线观看入口| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 禁无遮挡网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲精品色激情综合| 国产精品久久久久久久久免| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 简卡轻食公司| 看十八女毛片水多多多| 亚洲无线在线观看| 级片在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 午夜爱爱视频在线播放| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美性感艳星| 黄色欧美视频在线观看| 精品一区二区免费观看| 嘟嘟电影网在线观看| 悠悠久久av| 天天躁日日操中文字幕| 日韩成人伦理影院| 长腿黑丝高跟| 日本三级黄在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 全区人妻精品视频| 色播亚洲综合网| 国产成人一区二区在线| 变态另类丝袜制服| 欧美极品一区二区三区四区| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩高清综合在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产av不卡久久| 午夜福利成人在线免费观看| 国产三级中文精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 九草在线视频观看| a级毛片a级免费在线| 国产在视频线在精品| 91av网一区二区| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 69人妻影院| 久久亚洲国产成人精品v| 国产成年人精品一区二区| 日本在线视频免费播放| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产真实乱freesex| 精品熟女少妇av免费看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 看黄色毛片网站| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 人妻少妇偷人精品九色| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲七黄色美女视频| 国产探花极品一区二区| 欧美性猛交黑人性爽| 国产在视频线在精品| 久久国产乱子免费精品| 免费在线观看成人毛片| 精品熟女少妇av免费看| а√天堂www在线а√下载| 欧美变态另类bdsm刘玥| 丰满的人妻完整版| 国产精品久久久久久久久免| 久久99精品国语久久久| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| av在线蜜桃| 国产亚洲av嫩草精品影院| 色综合色国产| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲在线自拍视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精品99久久久久久久久| 国国产精品蜜臀av免费| 日韩视频在线欧美| 精品一区二区免费观看| 老司机福利观看| 26uuu在线亚洲综合色| 成人二区视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 毛片女人毛片| 伊人久久精品亚洲午夜| 淫秽高清视频在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 午夜久久久久精精品| 国产精品一及| 国产精品永久免费网站| eeuss影院久久| 91精品国产九色| 只有这里有精品99| 亚洲成a人片在线一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产精品久久久久久久电影| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 91在线精品国自产拍蜜月| 中国美白少妇内射xxxbb| a级毛片a级免费在线| 日韩欧美在线乱码| 激情 狠狠 欧美| 中文资源天堂在线| 国产视频首页在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 91久久精品国产一区二区三区| kizo精华| 激情 狠狠 欧美| 国产伦在线观看视频一区| 一级二级三级毛片免费看| 久久亚洲国产成人精品v| 久久综合国产亚洲精品| 伦精品一区二区三区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲在久久综合| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久久久久久久久成人| 一夜夜www| 白带黄色成豆腐渣| 69av精品久久久久久| 三级经典国产精品| 性色avwww在线观看| 国产免费男女视频| 国产成人福利小说| 成人综合一区亚洲| 美女黄网站色视频| 免费黄网站久久成人精品| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本在线视频免费播放| 国产精品一及| 日韩视频在线欧美| 成年女人永久免费观看视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| av在线天堂中文字幕| 欧美激情国产日韩精品一区| 岛国在线免费视频观看| 少妇高潮的动态图| 97热精品久久久久久| 不卡一级毛片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久午夜欧美精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美bdsm另类| 高清在线视频一区二区三区 | 天堂中文最新版在线下载 | 精品免费久久久久久久清纯| 欧美不卡视频在线免费观看| 好男人视频免费观看在线| 女同久久另类99精品国产91| 久久久久网色| 99国产极品粉嫩在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一本精品99久久精品77| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美高清成人免费视频www| 搡老妇女老女人老熟妇| 波野结衣二区三区在线|