野馬追類黃酮的超聲提取及其抗氧化活性研究

王衛(wèi)東，王乃馨，李姣姣，張同天，李 超*

(徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008)

野馬追類黃酮的超聲提取及其抗氧化活性研究

王衛(wèi)東，王乃馨，李姣姣，張同天，李 超*

(徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008)

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計優(yōu)化超聲提取野馬追類黃酮的最佳工藝參數，并研究野馬追類黃酮對DPPH自由基的清除效果，最后與其他提取方法進行比較。結果表明：超聲提取野馬追類黃酮的最佳工藝參數為液料比11.3:1(mL/g)、超聲溫度58℃和超聲時間29min，此時得率為1.142%；當野馬追類黃酮質量濃度在6.556～32.78μg/mL范圍內，其對DPPH自由基的清除率為46.90%～61.06%，且存在明顯的量效關系。與其他提取方法比較，超聲提取時間短、得率高。

野馬追；類黃酮；超聲提?。籅ox-Behnken試驗設計；抗氧化活性

Abstract：Ultrasonic extraction (UE) of flavonoids from the whole plant ofEupatorium lindleyanumDC was optimized using Box-Behnken design and response surface methodology on the basis of single factor experimental results. The scavenging effect of the extract against DPPH free radicals was also studied. Results indicated that the optimal extraction conditions of flavonoids from the whole plant ofEupatorium lindleyanumDC were liquid-to-ratio of 11.3:1, ultrasonic extraction temperature of 58 ℃and ultrasonic treatment time of 29 min. The extraction rate of flavonoids under these optimal extraction conditions was 1.142%.It was calculated that the content of flavonoids inEupatorium lindleyanumDC ranged from 6.556 to 32.78 μg/mL. The scavenging rate of flavonoids fromEupatorium lindleyanumDC against DPPH free radicals was between 46.90% and 61.06% in a dosedependent manner. Compared with other extraction techniques, UE exhibited higher yield and shorter extraction time.

Key words：Eupatorium lindleyanumDC；flavonoid；ultrasonic extraction；Box-Behnken design；antioxidant activity中圖分類號：O623.54 文獻標識碼：A 文章編號：1002-6630(2010)18-0050-05

野馬追(Eupatorium lindleyanumDC.)是菊科植物輪葉澤蘭的全草，中醫(yī)藥理認為本品苦、平，具有清熱解毒、祛痰、定喘、降血壓和提高人體免疫力等功效，可用于治療慢性氣管炎、支氣管炎、高血壓等疾病[1-2]。野馬追主要含有類黃酮等生物活性成分，常用的類黃酮提取方法有水煎煮法、乙醇回流提取等，但都存在提取時間長等缺點；而超聲提取作為一種優(yōu)良的提取方法，具有操作簡便快捷、提取時間短、提出率高等特點，目前己廣泛應用在生物活性物質的提取方面[3-8]。本實驗對野馬追類黃酮的超聲提取及抗氧化活性進行研究，旨在為野馬追類黃酮的進一步研究與開發(fā)應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野馬追 安徽亳州藥材市場；蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所；乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等皆為分析純。

1.2 儀器與設備

標準檢驗篩 浙江上虞華美儀器紗篩廠；風選中藥粉碎機 山東省青州市精誠機械制造有限公司；FA2104N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司；SHZ-D(Ш)循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；熱回流裝置自行組裝；數顯式電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫(yī)療器械廠；KBS-250型數控超聲波細胞粉碎機(20KHz，250W)昆山市超聲儀器有限公司；756紫外-可見分光光度計上海成光儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

按文獻[2]方法稍加修改：精密稱取蘆丁20mg置于250mL容量瓶中，加60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，配成0.08mg/mL的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL具塞刻度試管中，先依次分別加60%乙醇溶液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0mL，再加入0.3mL 5% NaNO2溶液搖勻后靜止6min，再加入0.3mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻后靜止6min，最后加入4mL 1mol/L NaOH溶液后用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻后靜止10min，以60%乙醇溶液為空白參比，于波長510nm處測定吸光度。以蘆丁質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，得回歸方程：A=11.688C－0.0301，R2＝0.9990，結果表明在0.008～0.040mg/mL之間線性良好。

1.3.2 提取方法

1.3.2.1 超聲提取

野馬追粉碎后過40目篩，精確稱取約3g，置于燒杯中，加入一定體積一定體積分數乙醇溶液后，按照試驗設計設置好超聲功率、超聲溫度和超聲時間(占空比固定為5s/5s)后開動超聲制樣，然后將提取液過濾，定容，測定。

1.3.2.2 水煎煮法

野馬追粉碎后過40目篩，精確稱取約3g，置于圓底燒瓶中，加入水50mL，沸騰1.5h后，過濾，定容，測定。

1.3.2.3 乙醇回流提取

野馬追粉碎后過40目篩，精確稱取約3g，置入圓底燒瓶中，加入60%乙醇溶液50mL，100℃水浴加熱回流2.5 h后，過濾，定容，測定。

1.3.3 工藝優(yōu)化設計

1.3.3.1 單因素試驗

分別以乙醇體積分數、液料比、超聲功率、超聲溫度和超聲時間為影響因素考察其對得率的影響。

1.3.3.2 Box-Behnken試驗設計

表1 Box-Behnken試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken design

根據Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，選取液料比、超聲溫度和超聲時間3個影響因素，采用3因素3水平的響應曲面分析方法，試驗因素與水平設計見表1。共15個試驗點：其中12個為析因點，3個為中心點。

設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為：

式中：EY為預測響應值；xi和xj為自變量代碼值；β0為常數項；βi為線性系數；βij為交互項系數；βii為二次項系數；ε為隨機誤差。按照Box-Behnken試驗設計的統(tǒng)計學要求，對上述方程的各項回歸系數進行回歸擬合。

1.3.4 得率的計算

1.3.5 DPPH法測定野馬追類黃酮的抗氧化性

按文獻[9]方法稍加修改：將1mL不同質量濃度野馬追類黃酮(6.556、13.112、19.668、26.224、32.780μg/mL)與 3mL 1.44×10-4moL/L的DPPH自由基反應，測定反應平衡時(30min)的吸光度，研究不同質量濃度的野馬追類黃酮對DPPH自由基的清除率。

式中：K為野馬追類黃酮對DPPH自由基的清除率/%；A0為DPPH溶液的吸光度；A為加試樣后DPPH溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對類黃酮得率的影響

圖1 乙醇體積分數對得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction rate

由圖1可知，隨著乙醇體積分數的增加，類黃酮得率先增加后降低，在乙醇體積分數為60%時得率達到了最大值。這是因為類黃酮為偏極性化合物，根據相似相溶原理，通過調節(jié)乙醇和水的配比改變乙醇溶液的極性，使其與此類黃酮的極性更加接近，從而使得率最大。因此選擇乙醇體積分數為60%進行后續(xù)試驗。

2.1.2 液料比對類黃酮得率的影響

圖2 液料比對得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio on flavonoids extraction rate

由圖2可知，隨著液料比的增加，類黃酮得率先增加后降低，在液料比為10:1(mL/g)時得率達到最大值。這是因為前期溶劑量越大，有效成分浸出越完全，得率也就越大；但當溶劑過大時，探頭式超聲能量對沉滯低層的野馬追顆粒的空化效應和機械效應等效應的強度減弱，影響了超聲提取的效果，同時會造成溶劑和能源的浪費，并給后序的濃縮工作帶來困難。因此選擇液料比為10:1(mL/g)進行后續(xù)試驗。

2.1.3 超聲功率對類黃酮得率的影響

圖3 超聲功率對得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on flavonoids extraction rate

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，類黃酮得率先增加后降低，在超聲功率為75W時得率達到最大值。這是因為前期超聲功率增加，提取的推動力增加，但當超聲功率達到75W以上時，可能由于超聲功率過大，類黃酮受到了破壞，導致得率下降。同時考慮到KBS-250型數控超聲波細胞粉碎機設備的特點，固定超聲功率為75W進行后續(xù)試驗。

2.1.4 超聲溫度對類黃酮得率的影響

由圖4可知，隨著超聲溫度的增加，類黃酮得率先增加后降低，在超聲溫度為60℃時得率達到最大值。這是因為前期溫度增加增加了傳質速度；但超過60℃之后，類黃酮受到破壞，同時造成溶劑揮發(fā)損失。因此選擇超聲溫度為60℃進行后續(xù)試驗。

圖4 超聲溫度對得率的影響Fig.4 Effect of temperature on flavonoids extraction rate

2.1.5 超聲時間對類黃酮得率的影響

圖5 超聲時間對得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on flavonoids extraction rate

由圖5可知，隨著超聲時間增加，類黃酮的得率也隨著增大；但當超聲時間達到35min以后，可能由于超聲時間過長，類黃酮受到了破壞，導致得率下降，因此選擇超聲時間為35min。

2.2 Box-Behnken試驗設計

2.2.1 模型的建立及其顯著性檢驗

表2 Box-Behnken試驗結果Table 2 Box-Behnken design layout and experimental results

利用Design expert V7.0.0統(tǒng)計軟件通過逐步回歸對表2試驗數據進行回歸擬合，得到野馬追類黃酮得率(EY)對以上3個因素的二次多項回歸模型為：

對該模型進行方差分析，結果見表3。

表3 響應曲面二次回歸方程模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the developed quadratic regression model

由該模型的方差分析表3可見：模型具有極顯著性(P＜0.01)，失擬項(P＞0.05)不顯著以及和RSN(信噪比)為17.67，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，實驗誤差較小，故可用此模型對超聲輔助提取野馬追類黃酮的工藝結果進行分析和預測。

2.2.2 響應曲面分析與優(yōu)化

根據回歸方程，作響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析液料比，超聲溫度和超聲時間對得率的影響。其響應曲面及其等高線如圖6～8所示，3組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。

圖6 液料比、超聲溫度及其交互作用對得率影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots illustrating the interactive effects of liquid-to-material ratio and ultrasonic temperature on flavonoids extraction rate

圖7 液料比、超聲時間及其交互作用對得率影響的響應面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots illustrating the interactive effects of liquid-to-material ratio and ultrasonic treatment time on flavonoids extraction rate

圖8 超聲溫度、超聲時間及其交互作用對得率影響的響應面和等高線Fig.8 Response surface and contour plots illustrating the interactive effects of temperature and ultrasonic treatment time on flavonoids extraction rate

等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。比較3組圖并結合表3中P值可知：模型的一次項x1(P＜0.01)極顯著，x2(P＜0.05)顯著，x3(P＞0.05)不顯著；交互項x1x2(P＜0.05)顯著，x1x3(P＜0.01)極顯著，x2x3(P＞0.05)不顯著；二次項x12(P＜0.01)、x22(P＜0.01)和x32(P＜0.01) 都極顯著，表明各影響因素對得率的影響不是簡單的線性關系。

為進一步確定最佳提取工藝參數，對所得方程進行逐步回歸，刪除不顯著項，然后求一階偏導，并令其為0，可得最佳工藝參數為液料比11.3:1(mL/g)，超聲溫度58.1℃和超聲時間28.7min，此時野馬追類黃酮的最佳得率為1.164%。

2.2.3 驗證實驗

為檢驗Box-Behnken試驗設計所得結果的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行野馬追類黃酮的提取實驗，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：液料比11.3:1(mL/g)、超聲溫度58℃和超聲時間29min，在此條件下進行3次平行實驗，實際測得的平均得率為1.142%，與預測值基本相符, 因此，基于Box-Behnken試驗設計所得的最佳工藝參數準確可靠, 具有實用價值。

2.3 野馬追類黃酮對DPPH自由基的清除率

圖9 野馬追類黃酮對DPPH自由基活性的清除率曲線Fig.9 DPPH free radical scavenging rates of flavonoids fromEupatorium lindleyanumDC at different concentrations

由圖9可以看出，野馬追類黃酮對DPPH自由基有明顯的清除作用，在質量濃度6.556～32.78μg/mL的范圍內，野馬追類黃酮清除DPPH自由基的能力為46.90%～61.06%，且其對DPPH自由基的清除效果與質量濃度之間存在明顯的量效關系。

2.4 不同提取方法的比較

表4 不同提取方法得率的比較Table 4 Comparison of extraction rates of flavonoids using different extraction methods

由表4可以看出，超聲提取野馬追類黃酮得率分別比水煎煮法和乙醇回流提取的得率高56.2%和9.6%；但是超聲提取的提取時間僅29min，而其他提取方法則需要若干小時，提取時間大大縮短。由此可知，超聲提取是一種非常有效的提取野馬追類黃酮的方法。

3 結 論

3.1 由單因素和Box-Behnken試驗設計及其分析結果獲得超聲提取野馬追類黃酮的最佳工藝參數為液料比11.3:1(mL/g)，超聲溫度58℃和超聲時間29min，此時得率為1.142%。

3.2 在質量濃度6.556～32.78μg/mL的范圍內，野馬追類黃酮清除DPPH自由基的能力為46.90%～61.06%，且其對DPPH自由基的清除效果與質量濃度之間存在明顯的量效關系。

3.3 本實驗還討論比較超聲提取與其他提取方法的效果差異，結果表明，超聲提取時間短，得率高。

[1] 王新風, 蔣繼宏, 蔣海龍. 野馬追總黃酮提取得率的比較研究[J]. 江蘇中醫(yī)藥, 2005, 26(10):43-44.

[2] 陳健, 姚成. 野馬追中總黃酮的測定[J]. 南京師范大學學報, 2004, 4(2):16-18.

[3] HUANG Wen, XUE An, NIU Hai, et al. Optimised ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity in multi-test systemsin vitro[J]. Food Chemistry,2009, 114(3):1147-1154.

[4] FU Caili, TIAN Haijun, LI Quanhong, et al. Ultrasound-assisted extraction of xyloglucan from apple pomace[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2006, 13(6):511-516.

[5] CHEN Fang, SUN Yangzhao, ZHAO Guanghua, et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins in red raspberries and identification of anthocyanins in extract using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2007,14(6):767-778.

[6] 姜寧, 劉曉鵬, 姜順日, 等. 相思菇多糖超聲波輔助提取工藝研究[J].食品科學, 2009, 30(2):98-101.

[7] 周蓉, 鄒懷波, 陳三寶. 超聲波提取虎刺中總黃酮的工藝研究[J]. 食品科學, 2008, 29(11):176-178.

[8] 董發(fā)明, 白喜婷. 響應面法優(yōu)化超聲提取杜仲雄花中黃酮類化合物的工藝參數[J]. 2008, 29(8):227-231.

[9] DU Qizhen, ZHENG Juyue, XU Yuanjin. Composition of anthocyanins in mulberry and their antioxidant activity[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21(5):390-395.

Ultrasonic Extraction and Antioxidant Activity Evaluation of Flavonoids from the Whole Plant ofEupatorium lindleyanumDC

WANG Wei-dong，WANG Nai-xin，LI Jiao-jiao，ZHANG Tong-tian，LI Chao*
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

2009-12-18

王衛(wèi)東(1971—)，男，講師，博士，研究方向為功能性食品添加劑及配料。E-mail：wwd.123@163.com

*通信作者：李超(1978—)，男，講師，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：chaoge002@163.com