中性蛋白酶酶解制備魔芋飛粉淀粉及其性質(zhì)的研究

譚博文，徐懷德,*，米林峰

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.榆林市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西 榆林 719000)

中性蛋白酶酶解制備魔芋飛粉淀粉及其性質(zhì)的研究

譚博文1，徐懷德1,*，米林峰2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.榆林市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西 榆林 719000)

對(duì)中性蛋白酶酶解魔芋飛粉制備淀粉的方法及其性質(zhì)進(jìn)行研究。應(yīng)用單因素和中心組合試驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，用掃描電鏡觀察淀粉顆粒形貌，然后對(duì)淀粉糊的主要性質(zhì)及指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：中性蛋白酶酶解魔芋飛粉的最佳工藝參數(shù)為底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%、酶用量818.3U/g底物、溫度44.1℃、pH7.1、水解120min。制得淀粉純度90.09%，其中直連淀粉含量18.20%，支鏈淀粉含量81.80%，淀粉糊具有較好的溶解度和透明度。魔芋淀粉顆粒為蠶豆形，顆粒粒徑為1～9μm，平均為5μm，魔芋淀粉顆粒小不易發(fā)生凝沉現(xiàn)象。

中性蛋白酶；魔芋飛粉淀粉；制備；性質(zhì)

Abstract：Konjac fly powder was prepared by neutral protease hydrolysis from konjac starch and its properties were investigated. Results indicated that the optimal hydrolysis conditions were substrate concentration of 2.5%, alkaline protease concentration of 818.3 U/g, hydrolysis temperature of 44.1 ℃ and hydrolysis time of 120 min. The purity of prepared starch reached up to 90%, which contained 18.20% amylose and 81.80% amylopectin. Konjac starch paste exhibited excellent solubility and transparency. Konjac starch granules were broad bean shape with particle sizes ranging from 1 to 9μm, averaged at 5μm.

Key words：neutral protease；konjac fly powder starch；preparation；property

魔芋(Amorphophallus rivieriDurieu)是天南星科魔芋屬多年生草本植物，具有降低血脂、降低血糖、減肥、防治腸胃消化系統(tǒng)疾病功能[1]。我國(guó)是世界上最大的魔芋生產(chǎn)國(guó)，對(duì)魔芋研究集中在魔芋葡甘聚糖，魔芋的加工主要生產(chǎn)魔芋精粉(葡甘聚糖)，年產(chǎn)量達(dá)5000噸左右，在精粉加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量質(zhì)量輕、顆粒小的粉末，稱為魔芋飛粉[1]，占精粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的30%～40%，全國(guó)年產(chǎn)飛粉1500～2000噸。而魔芋飛粉含蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%左右，淀粉40%左右，具有很高的利用價(jià)值，龐杰等[2]就利用魔芋飛粉提取生物堿，用于防治植物蟲(chóng)害。趙姍姍[3]、Englysl等[4]研究了用酶解法制備魔芋飛粉高F值寡肽。翟琨等[5]對(duì)魔芋淀粉理化特性進(jìn)行了研究，魔芋飛粉僅以低價(jià)飼料或作為干燥劑出售[6-7]，利用率不高。魔芋飛粉中淀粉的制備和性質(zhì)研究較少。為此，本實(shí)驗(yàn)研究中性蛋白酶酶解制備魔芋飛粉淀粉，并以常用的玉米、紅薯淀粉對(duì)比研究其特性，以期為魔芋淀粉進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

魔芋飛粉 陜西安康秦東食品有限公司；玉米淀粉和紅薯淀粉 市售。

中性蛋白酶(酶活50000U/g) 沃爾森公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠；支鏈、直連淀粉標(biāo)品 北京索萊寶科技有限公司；α淀粉酶(酶活4000U/g) 上海藍(lán)季生物科技有限公司；牛血清白蛋白 Sigma公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KDC-40低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；PHS-3C數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；RE-5220D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海長(zhǎng)城儀表廠；SIM-FD5505P真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)西門子公司；JSM-6360LV型掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；DMBA400型數(shù)碼顯微鏡 Motic China Group Co. Ltd。

1.2 方法

1.2.1 魔芋淀粉的制備工藝流程

魔芋飛粉→按1:45(g/mL)的料液比加水在50℃溶解1.5h→離心去上清液(4000r/min，30min)→加水、調(diào)pH值、加蛋白酶液恒溫酶解→離心去上清液(4000r/min，15min)→沉淀水洗2次，45℃烘箱中烘干即得魔芋淀粉

1.2.2 中性蛋白酶酶解魔芋飛粉條件的確定

以殘留物淀粉含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，酶解時(shí)間120min，以pH值、溫度、加酶量為試驗(yàn)因素，采用中心組合設(shè)計(jì)(CCD)優(yōu)化中性蛋白酶對(duì)魔芋飛粉的酶解條件。中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的三因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in the central composite design

1.2.3 淀粉顆粒形貌觀察

1.2.3.1 光學(xué)形貌觀察

以水和甘油體積比為1:1的溶液作溶劑，制備淀粉乳。取淀粉乳滴于載玻片上，蓋上蓋玻片。用數(shù)碼顯微鏡觀察淀粉顆粒的形貌。

1.2.3.2 淀粉顆粒的掃描電子顯微鏡觀察

把雙面膠固定在樣品臺(tái)上。取少量淀粉均勻地灑在雙面膠上，然后真空噴金處理。樣品保存于干燥器中，經(jīng)過(guò)短暫干燥后，用掃描電子顯微鏡觀察并拍攝具有代表性的淀粉顆粒形貌。

1.2.4 淀粉糊性質(zhì)分析

1.2.4.1 淀粉糊的透明度

取1.0g絕干試樣，加蒸餾水100mL，配制質(zhì)量濃度為0.01kg/L淀粉乳，在沸水浴中加熱，攪拌20min，并不時(shí)加入蒸餾水以保持淀粉糊的原有體積，然后冷卻到25℃。以蒸餾水為空白，在620nm波長(zhǎng)處，用分光光度計(jì)測(cè)淀粉糊的透光率。

1.2.4.2 淀粉糊的凍融穩(wěn)定性

配制質(zhì)量濃度為0.06kg/L的淀粉乳，于沸水浴中加熱攪拌20min，用水調(diào)制淀粉糊質(zhì)量濃度至原質(zhì)量濃度，冷卻至室溫，置于－15～－20℃的冰箱內(nèi)，冷凍24h后取出自然解凍，在3000r/min條件下離心20min，去掉上清液，稱取沉淀物質(zhì)量，計(jì)算析水率。

式中：I為析水率/%，m1為淀粉糊質(zhì)量/g；m2為沉淀物質(zhì)量/g。

1.2.4.3 淀粉糊的凝沉性

配制質(zhì)量濃度為0.01kg/L的淀粉糊，置于25mL的具塞刻度試管中，在25℃條件下靜置，每隔一段時(shí)間記錄上層清液的體積，用清液的體積分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的變化來(lái)繪制曲線，從而表示淀粉糊的凝沉性。

1.2.4.4 淀粉糊的溶解度和膨脹度

稱取5g樣品，加入100mL水，置于離心管中，在沸水浴加熱30min，每5min振1次。將水浴后的樣品冷卻至室溫，用3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，將離心后樣品的上清液和沉淀物分開(kāi)，烘干后稱量，并按下式計(jì)算溶解度和膨脹度。

式中：m1為溶解淀粉質(zhì)量/g；m2為淀粉質(zhì)量/g，以干基計(jì)；m3為膨脹淀粉質(zhì)量/g；S為溶解度/%。

1.2.5 主要指標(biāo)測(cè)定方法

淀粉含量的測(cè)定用GB 5009.9—85《食品中淀粉含量的測(cè)定》[8]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[9]；水分的測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]；粗脂肪的測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]；灰分的測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]。

1.2.6 雙波長(zhǎng)法分光光度法測(cè)定魔芋直鏈淀粉和支鏈淀粉含量

1.2.6.1 吸收光譜圖及測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

圖1 直鏈淀粉和支鏈淀粉全波段掃描圖譜Fig.1 Full-wavelength range spectra of amylase and amylopectin

1mg/mL直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)品分別與碘反應(yīng)，在波長(zhǎng)450～800nm掃描[13]，見(jiàn)圖1。確定直鏈淀粉的測(cè)定雙波長(zhǎng)為λ1=564nm和λ2=506nm，支鏈淀粉的測(cè)定雙波長(zhǎng)為λ3=729nm和λ4=539nm。

1.2.6.2 直鏈淀粉的回歸方程

分別移取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL質(zhì)量濃度1mg/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液于50mL容量瓶中，加入蒸餾水30mL，以0.1mol/L HCl溶液調(diào)至pH3.5左右，加入碘試劑0.5mL，并用蒸餾水定容。靜置20min，以蒸餾水為空白，用1cm比色杯在波長(zhǎng)為564、506nm處測(cè)定Aλ1、Aλ2，即得ΔA直=Aλ2－Aλ1。直鏈淀粉的回歸方程：C直/(mg/mL)=0.0856ΔA直－0.0158，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

1.2.6.3 支鏈淀粉的回歸方程

分別移取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0mL質(zhì)量濃度為1mg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液于50mL容量瓶中，其他處理方法與直鏈淀粉回歸方程相同。測(cè)定波長(zhǎng)為729nm和543nm。支鏈淀粉的回歸方程為C支/(mg/mL)=0.0819 ΔA支－0.0147，相關(guān)系數(shù)R2=0.9988。

1.2.6.4 直鏈淀粉、支鏈淀粉含量的測(cè)定

樣品過(guò)60目篩，稱取樣品0.1g左右(精確至1mg)，置于50mL容量瓶中。加0.5mol/L KOH溶液10mL，在沸水浴中加熱10min，取出，以蒸餾水定容至50mL靜置。取樣品液2.5mL兩份，均加蒸餾水30mL，以0.1mol/L HCl溶液調(diào)至pH3.5左右，樣品中加入碘試劑0.5mL，空白不加碘試劑，然后定容至50mL。靜置20min，以樣品空白液為對(duì)照，分別測(cè)定506、564、729、539nm處吸光度。得到ΔA直=Aλ2－Aλ1，ΔA支=Aλ4－Aλ3。淀粉含量按照下列公式計(jì)算。

總淀粉/%=直鏈淀粉＋支鏈淀粉

式中：X1為查雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液中直鏈淀粉含量/mg；X2為查雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液中支鏈淀粉含量/mg；m為樣品質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性蛋白酶中心組合設(shè)計(jì)酶解魔芋飛粉條件的確定

中性蛋白酶中心組合設(shè)計(jì)酶解魔芋飛粉試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸方程的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得到的數(shù)學(xué)模型為：Y=79.66+4.46X1+2.90X2－2.87X3+1.23X1X2－0.36X1X3－1.23X2X3－1.71X12－5.71X22－5.31X32。

表2 中心組合試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Central composite design layout and experimental results

表3 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis (ANOVA) for the developed regression equation

由表3可以看出，模型P＜0.01，表明該模型極顯著。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.9525，說(shuō)明該模型能夠解釋95.25%響應(yīng)值的變化，擬合程度良好[14]。

根據(jù)各因素與對(duì)應(yīng)自變量的編碼轉(zhuǎn)化公式，可以得到各因素的最佳水平值，即中性蛋白酶酶解魔芋飛粉的最適反應(yīng)條件為酶解120min、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%、pH7.1、溫度44.1℃、加酶量818.3U/g，在此條件下淀粉含量能達(dá)到84.22%。為了證實(shí)模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的擬和程度，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果淀粉含量達(dá)到84.15%，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間具有良好的擬和性，表明了模型的有效性。

酶解后魔芋淀粉再經(jīng)過(guò)水洗2次烘干得到淀粉含量高的魔芋淀粉，其中含淀粉90.09%、蛋白質(zhì)2.06%、脂肪0.42%、水分6.5%、灰分0.45%、其他0.48%，雙波長(zhǎng)法分光光度法測(cè)得魔芋淀粉直連淀粉含量18.20%、支鏈淀粉含量81.80%。

2.2 魔芋淀粉顆粒形貌觀察

2.2.1 淀粉顆粒的光學(xué)形貌觀察

魔芋淀粉顆粒觀測(cè)如圖2所示，通過(guò)對(duì)比觀測(cè)魔芋淀粉發(fā)現(xiàn)其顆粒明顯比玉米淀粉和紅薯淀粉的小，部分魔芋淀粉中間有裂紋，可能是在魔芋飛粉生產(chǎn)過(guò)程中，部分淀粉受到機(jī)械作用而損傷所致；玉米淀粉和紅薯淀粉顆粒多呈圓形和多邊形且臍點(diǎn)明顯，而魔芋淀粉由于顆粒小看不清臍點(diǎn)、輪紋且顆粒之間大小相差較大。

圖2 淀粉顆粒形貌Fig.2 Morphology of starch granules from different sources

2.2.2 淀粉顆粒掃描電子顯微鏡(SEM)觀察

圖3 淀粉顆粒SEM照片F(xiàn)ig.3 Scanning electron micrographs of starch granules from different sources

淀粉顆粒掃描電子顯微鏡觀察見(jiàn)圖3，對(duì)比可以看出，魔芋淀粉顆粒較小，用電鏡標(biāo)尺對(duì)淀粉顆粒的粒徑進(jìn)行估測(cè)，平均為5μm，而玉米淀粉顆粒的平均粒徑最大，平均可達(dá)12μm，其次為紅薯淀粉。從電鏡可以看出魔芋淀粉顆粒形狀復(fù)雜多樣，有紡錘形、多邊形、菱形等多種形狀。部分淀粉顆粒表面有凹陷，有的顆粒表面有絮狀連黏物，可能是淀粉結(jié)合少量蛋白質(zhì)有關(guān)。淀粉顆粒的大小和形狀取決于其來(lái)源。研究淀粉粒結(jié)構(gòu)，對(duì)于鑒別淀粉來(lái)源，了解和改進(jìn)淀粉性質(zhì)，有著重要的意義。淀粉顆粒度的大小會(huì)影響淀粉的離心沉降速度、流變學(xué)特性，從而影響淀粉提取和加工。

2.3 淀粉糊的理化性質(zhì)

表4 各種淀粉糊的部分理化性質(zhì)Table 4 Physical and chemical properties of starch pastes from different sources %

由表4可知，魔芋淀粉支鏈淀粉含量高，透光率高。透光率愈大，淀粉糊的透明度愈大。支鏈淀粉的含量對(duì)糊的透明度有一定的影響，支鏈淀粉含量越高，透明度越大。魔芋淀粉析水率介于紅薯淀粉和玉米淀粉之間，可知魔芋淀粉的凍融穩(wěn)定性較好，紅薯淀粉的凍融穩(wěn)定性最好。因此魔芋淀粉適宜應(yīng)用在果凍、飲料等食品加工中。淀粉的溶解度和膨脹度是淀粉性質(zhì)的一項(xiàng)基本指標(biāo)，能反映淀粉樣品與水的結(jié)合能力。從表中可以看出，魔芋淀粉的溶解度和膨脹度都高于紅薯淀粉和玉米淀粉。

2.4 淀粉糊的凝沉性

圖4 淀粉糊的凝沉曲線Fig.4 Retrogradation curves of starch pastes from different sources

由圖4可以看出，在整個(gè)凝沉過(guò)程中，紅薯淀粉和玉米淀粉在9h內(nèi)發(fā)生凝沉；魔芋淀粉在18h內(nèi)持續(xù)凝沉。凝沉主要是由于直鏈淀粉分子間的結(jié)合形成較大的顆?；蚴鵂罱Y(jié)構(gòu)，當(dāng)體積增大到一定程度時(shí)，就形成了沉降。而魔芋淀粉顆粒小，支鏈淀粉含量高，空間阻隔作用大凝沉較慢[15]，所以淀粉糊不易發(fā)生凝沉現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

3.2 魔芋淀粉顆粒多為蠶豆形，無(wú)臍點(diǎn)、輪紋；魔芋淀粉顆粒粒徑為1～9μm不等，平均為5μm。魔芋淀粉支鏈淀粉含量高，所以魔芋淀粉糊具有較好的透明度，較好的凍融穩(wěn)定性，同時(shí)魔芋淀粉具有較好的溶解度和膨脹度。從顆粒觀察可以看出魔芋淀粉的顆粒小，所以魔芋淀粉不易發(fā)生凝沉現(xiàn)象。

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Preparation of Konjac Fly Powder by Neutral Protease Hydrolysis and Its Properties

TAN Bo-wen1，XU Huai-de1,*，MI Lin-feng2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；2. Yulin Products Quality Supervision and Inspection Institute, Yulin 719000, China)

TS231

A

1002-6630(2010)18-0041-05

2009-12-23

陜西省陜南突破發(fā)展基金項(xiàng)目(2006ZKC(二)04-34)

譚博文(1985—)，男，碩士研究生，主要從事園藝產(chǎn)品貯藏與加工研究。E-mail：tany4210@163.com

*通信作者：徐懷德(1964—)，男，副教授，學(xué)士，主要從事軟飲料、果品蔬菜貯藏與加工、天然產(chǎn)物提取研究。E-mail：xuhuaide@yahoo.com.cn