響應(yīng)曲面法優(yōu)化醇提荷葉復(fù)方物超臨界萃取殘?jiān)悬S酮的工藝

甘露菁，鄧澤元*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，高等研究院，江西 南昌 330047)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化醇提荷葉復(fù)方物超臨界萃取殘?jiān)悬S酮的工藝

甘露菁，鄧澤元*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，高等研究院，江西 南昌 330047)

對(duì)荷葉復(fù)方物超臨界萃取后的殘?jiān)悬S酮進(jìn)行醇提，用Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度及時(shí)間為自變量，以總黃酮得率為響應(yīng)指標(biāo)，用回歸方程的方差分析檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性。修正后最優(yōu)化的條件為殘?jiān)?0g時(shí)，料液比1:20(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、溫度80℃、時(shí)間80min。在此條件下總黃酮得率為15.97mg/g，提取3次結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值相近。因此，基于Box-Behnken響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值，可用于荷葉復(fù)方降脂產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

響應(yīng)曲面法；黃酮；殘?jiān)?/p>

Abstract：Ethanol extraction was employed to extract total flavonoids from the leftover residue of a Chinese herbal medicine combination consisting of lotus leaves, cassia seeds, hawthorn fruit and oriental water plantain rhizome after supercritical carbon dioxide extraction. The optimal conditions for the extraction of total flavonoids were explored by response surface methodology.Box-Behnken design was applied to provide experimental data for establishing a mathematical regression model describing the relationship between the extraction rate of total flavonoids and four independent variables including material-to-liquid ratio,ethanol concentration, extraction temperature and extraction time. Correlation analysis of the established model was performed,and the results indicated that it could be employed to optimize the ethanol extraction of total flavonoids from the start material.Material-to-liquid ratio of 1:20, ethanol concentration of 50%, extraction temperature of 80 ℃ and extraction time of 80 min were found optimum. The experimental values of the extraction rate of total flavonoids under these optimum conditions were in good agreement with the predicted ones.

Key words：response surface methodology；flavonoids；residue

荷葉(主要降脂活性物質(zhì)生物堿和黃酮)[1-2]多與山楂(Crataegus PinnatifidaBge.)(主要降脂活性物質(zhì)黃酮)[3]、決明子(Cassia ObtusifoliaL.)(主要降脂活性物質(zhì)蒽醌)[4]、澤瀉(Alisma Orientalis(Sam.) Juzep.)(主要降脂活性物質(zhì)三萜類)[5]等組成復(fù)方，多用于治療高血脂、高血壓及其并發(fā)癥。前期研究中，將荷葉、山楂、決明子和澤瀉以2:2:1:1的比例配成復(fù)方，用CO2超臨界萃取裝置對(duì)其進(jìn)行萃取，經(jīng)過(guò)對(duì)壓強(qiáng)、溫度、夾帶劑用量這3個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化后，一次性萃取生物堿、蒽醌、三萜類物質(zhì)得率都較為理想，但黃酮的萃取效果欠佳。本實(shí)驗(yàn)旨在探索對(duì)荷葉復(fù)方超臨界萃取后的殘?jiān)M(jìn)行后續(xù)提取，即醇提條件的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

荷葉復(fù)方(荷葉、決明子、山楂、澤瀉)超臨界萃取后的殘?jiān)?/p>

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所。所用試劑均為分析純。

sp-1910uvpc紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

取上述荷葉復(fù)方粉末(60目)超臨界萃取后的殘?jiān)?0g，加一定量的相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液浸泡，在相應(yīng)溫度中水浴加熱提取相應(yīng)的時(shí)間，然后離心分離，留取上清液，下層殘留物在同樣條件下再提取1次，合并提取液。濃縮后用80%乙醇溶液定容為100mL，備用。在其他條件不變的前提下，分別改變料液比[(固定提取溫度為60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間45min，改變料液比(g/mL)為 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25)]、乙醇體積分?jǐn)?shù)(固定提取溫度為60℃，料液比為1:20，提取時(shí)間45min，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、65%、80%、95%)、溫度(固定乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比為1:20，提取時(shí)間75min，改變溫度為50、60、70、80℃)及時(shí)間(固定提取溫度為60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1:20，改變提取時(shí)間為30、45、60、75、90、120min)等4個(gè)因素的水平，通過(guò)測(cè)定總黃酮含量來(lái)評(píng)價(jià)各因素對(duì)醇提荷葉復(fù)方超臨界萃取殘?jiān)挠绊慬6]。

1.2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化黃酮醇提條件

運(yùn)用SAS 8.00(SAS Institute Inc.)，采用Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法[7]，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間為自變量，以黃酮得率(mg/g原料)為響應(yīng)指標(biāo)[8]，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)方案，試驗(yàn)因素編碼及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素編碼及水平Table 1 Factors and levels in the response surface design

1.3.3 總黃酮含量檢測(cè)方法

采用分光光度法[9]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)水乙醇定容后直接在最大吸收波長(zhǎng)360nm處測(cè)定吸光度。得回歸方程：y=35.135x+0.0004(其中y為總黃酮含量，x為吸光度)，R2=0.9999。精密移取1mL備用提取液，同法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量及得率，得率以每克殘?jiān)现泻锌傸S酮量(mg)表示，計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)醇提殘?jiān)S酮的影響

圖1 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖1可知，料液比1:5到1:20的范圍內(nèi)，隨著其比例減小，總黃酮得率逐漸增加，從11.79mg/g上升到13.13mg/g，但是當(dāng)料液比到1:25時(shí)卻下降到12.41mg/g?？赡苁且?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)溶劑用量增加有助于黃酮類化合物的浸出，溶劑用量少，提取不太完全，但溶劑用量過(guò)大，水浴加熱的負(fù)荷增大，達(dá)到提取完全所需要的時(shí)間也增長(zhǎng)，使得在有限的時(shí)間內(nèi)對(duì)物料的提取不完全[10]。綜合考慮后采用料液比1:20。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醇提殘?jiān)S酮的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，總黃酮得率在乙醇體積分?jǐn)?shù)65%時(shí)最高(13.47mg/g)，80%與95%時(shí)分別下降到13.13mg/g和8.58mg/g。這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，沸點(diǎn)下降，導(dǎo)致?lián)]發(fā)過(guò)大，同時(shí)一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)，從而導(dǎo)致黃酮類化合物得率下降[10]。因此，最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%。

2.1.3 時(shí)間對(duì)醇提殘?jiān)S酮的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，提取時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮的得率也隨之增加，當(dāng)時(shí)間超過(guò)75min時(shí)(13.90mg/g)，時(shí)間延長(zhǎng)總黃酮得率增加并不明顯(90min時(shí)13.90mg/g及120min時(shí)13.91mg/g)，為了避免設(shè)備多余的消耗和成本的增加，將提取時(shí)間控制在75min為宜。

2.1.4 溫度對(duì)醇提殘?jiān)S酮的影響

圖4 溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，隨溫度的升高黃酮得率增加明顯，在70℃時(shí)達(dá)到頂峰(13.99mg/g)，但當(dāng)溫度到80℃時(shí)，殘?jiān)悬S酮類物質(zhì)得率反而降低至13.73mg/g。這可能是由于黃酮類物質(zhì)的溶出率隨著溫度的升高而增加，但是溫度過(guò)高接近乙醇沸點(diǎn)時(shí)，反而影響醇對(duì)黃酮類物質(zhì)的溶出量[11]。所以提取溫度控制為70℃為宜。

2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)曲面二次多元回歸模型方程：Y

式中：Y代表總黃酮得率，而X1、X2、X3、X4分表代表料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度和時(shí)間。

表2 Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken response surface design matrix and experimental results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the established regression model

由表3可知模型P=0.002642<0.01，表明模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.2143＞0.05不顯著，說(shuō)明該模型擬合程度良好[12]，可以用此模型對(duì)荷葉復(fù)方物的超臨界萃取殘?jiān)悬S酮醇提效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的一次項(xiàng)X1(料液比)、X2(乙醇體積分?jǐn)?shù))、X3(溫度)均對(duì)殘?jiān)悬S酮醇提的線性效應(yīng)極顯著，而X4(時(shí)間)不顯著；二次項(xiàng)均對(duì)殘?jiān)悬S酮醇提的曲面效應(yīng)顯著；交互項(xiàng)X1X2、X2X3對(duì)殘?jiān)悬S酮醇提的曲面效應(yīng)顯著。

模型響應(yīng)曲面見(jiàn)圖5～10。從響應(yīng)面分析圖上形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。

圖5 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的交互作用的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of materialto-liquid ratio and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

圖6 料液比和溫度對(duì)總黃酮得率的交互作用的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of materialto-liquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

圖7 料液比和時(shí)間對(duì)總黃酮得率的交互作用的響應(yīng)曲面Fig.7 Response surface plot showing the interactive effects of materialto-liquid ratio and extraction time on the extraction rate of total flavonoids

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度對(duì)總黃酮得率的交互作用響應(yīng)曲面Fig.8 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)和時(shí)間對(duì)總黃酮得率的交互作用響應(yīng)曲面Fig.9 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction time on the extraction rate of total flavonoids

圖10 溫度和時(shí)間對(duì)總黃酮得率的交互作用的響應(yīng)曲面Fig.10 Response surface plot showing the interactive effects of extraction temperature and time on the extraction rate of total flavonoids

對(duì)模型方程解逆矩陣得殘?jiān)悬S酮醇提最佳工藝為：料液比1:19.74，乙醇體積分?jǐn)?shù)50.88%，溫度80.75℃，時(shí)間80.12min。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件修正參數(shù)：料液比1:20，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，溫度80℃，時(shí)間80min。用此最佳實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)3次，得到平均總黃酮得率為15.97mg/g。與理論最佳總黃酮得率15.94mg/g一致。因此，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

用響應(yīng)曲面法建立了荷葉復(fù)方物超臨界萃取殘?jiān)锌傸S酮醇提得率與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度及時(shí)間關(guān)系的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型準(zhǔn)確有效，殘?jiān)悬S酮醇提的最佳工藝修正參數(shù)為料液比1:20、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、溫度80℃、時(shí)間80min，在此條件下總黃酮得率為15.97mg/g，與理論最佳得率一致。

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Optimization of Ethanol Extraction of Total Flavonoids from the Leftover Residue of a Chinese Herbal Medicine Combination after Supercritical Carbon Dioxide Extraction Using Response Surface Methodology

GAN Lu-jing，DENG Ze-yuan*
(Institute for Advanced Study, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University,Nanchang 330047, China)

O623.54

A

1002-6630(2010)18-0026-05

2009-12-16

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2006GY0066)；江西省教育廳科研課題(20030058)

甘露菁(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：closer00@foxmail.com

*通信作者：鄧澤元(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹舅峒疤烊划a(chǎn)物。E-mail：dengzy28@yahoo.com.cn