• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同沉淀方法分離甘薯β-淀粉酶的研究

    2010-10-19 05:27:00賈彥杰梁新紅朱文學孫俊良郭祖鋒
    食品科學 2010年18期
    關鍵詞:鹽析硫酸銨丙酮

    賈彥杰,梁新紅,朱文學,孫俊良,*,郭祖鋒

    (1.河南科技大學食品與生物工程學院,河南 洛陽 471003;2.河南科技學院食品學院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    不同沉淀方法分離甘薯β-淀粉酶的研究

    賈彥杰1,梁新紅2,朱文學1,孫俊良2,*,郭祖鋒2

    (1.河南科技大學食品與生物工程學院,河南 洛陽 471003;2.河南科技學院食品學院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    研究鹽析法、有機溶劑沉淀法分離甘薯β-淀粉酶的工藝條件,分析鹽析飽和度、有機溶劑體積比和溶液pH值對回收率及提純倍數(shù)的影響。結果表明:硫酸銨飽和度在70%時,酶活性回收率達到78.1%,提純1.56倍;乙醇體積比4:1時,酶活性回收率達到76.8%,提純2.61倍;當溶液pH4.5~5.0、丙酮體積比3:1時,酶活性回收率可達到90.66%,提純了3.29倍,此條件下β-淀粉酶分離效果最佳。

    甘薯;β-淀粉酶;沉淀;分離;鹽析

    Abstract:Salting out and organic solvent precipitation methods were solely used to precipitateβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate. The effects of saturation degree for salting out, volume ratio for organic solvents and pH on the recovery rate and purity ofβ-amylase were investigated. Results indicated that the specific activity ofβ-amylase reached up to 78.1% and its purity exhibited a 1.56-fold enhancement when the saturation degree of ammonium sulfate was 70%; the specific activity ofβ-amylase reached up to 76.8% and its purity exhibited a 2.61-fold enhancement when 4-fold volume of ethanol was added to the supernatant of sweet potato homogenate; and the highest separation efficiency was achieved and the specific activity ofβ-amylase reached up to 90.66% with a 3.29-fold enhancement in purity when pH varied from 4.5 to 5.0 and 3-fold volume of acetone was used instead of 4-fold volume of ethanol.

    Key words:sweet potato;β-amylase;precipitation;separation;salting out

    β-淀粉酶是一種水解酶,作用于淀粉時,分解淀粉分子中的α-1,4葡萄糖苷鍵,從還原性末端開始,按照麥芽糖單位依次水解,同時發(fā)生沃爾登轉化,使產物由α型變?yōu)棣滦望溠刻?,因此稱為β-淀粉酶[1-2]。β-淀粉酶在食品加工、釀造、糧食加工以及醫(yī)藥等行業(yè)具有重要應用價值[3]。β-淀粉酶存在于植物與微生物中,而我國目前利用微生物發(fā)酵生產的β-淀粉酶主要有耐熱性差,成本較高等缺點。而從植物中提取的β-淀粉酶具有酶活力高、耐熱性較好、作用pH值范圍廣等特點。植物β-淀粉酶主要存在于甘薯、麥麩、大豆、大麥芽以及蘿卜中。我國甘薯、麥麩產量很高,價格低廉,可以從中提取β-淀粉酶[4]。甘薯β-淀粉酶酶活力高、淀粉易回收,因此甘薯是制備β-淀粉酶最為理想的原料[5]。

    鹽析沉淀法是許多酶初純階段經常采用的方法,而有機溶劑沉淀無需專門方法去除沉淀劑,此法簡便、安全[6]。目前,關于乙醇沉淀分離β-淀粉酶的研究已有報道[7],而有關鹽析及其他有機溶劑沉淀分離β-淀粉酶相比較的工藝研究尚未見報道。本實驗通過硫酸銨鹽析、乙醇及丙酮沉淀方法分離甘薯β-淀粉酶,以期找到較為合適的分離方法,為工業(yè)化生產提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    甘薯 市售;考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、3,5-二硝基水楊酸等(均為分析純)。

    1.2 儀器與設備

    RC5C型冷凍離心機 美國Sovall公司;pHSJ-3F型實驗室pH計、FA1204B型分析天平 上海精密科學儀器有限公司;7200型分光光度計 尤尼克(上海)儀器有限公司;SQ2002多功能食品加工機 上海帥佳電子科技有限公司;MD34透析袋(8000~14000kD) 美國聯(lián)合碳化物公司。

    1.3 方法

    1.3.1 粗酶液提取

    取新鮮甘薯50g,洗凈后切成1cm3左右小塊,加入100mL的去離子水,于勻漿機中勻漿(26000r/min,1min),4層紗布過濾,濾液冷凍離心(4℃,4000r/min,15min),取上清液4℃冰箱中保藏備用。

    1.3.2 硫酸銨鹽析甘薯β-淀粉酶方法

    取7支試管,每支加入粗酶液5mL,分別加入硫酸銨至飽和度為20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%,邊加邊攪拌,混勻后,用磷酸-檸檬酸緩沖液調節(jié)溶液pH值至5.0,4℃冰箱中放置4h,8000r/min冷凍離心15min后,收集沉淀。將沉淀用磷酸緩沖液溶解,選用截留分子量為1萬D的透析袋透析除鹽24h。測透析后甘薯β-淀粉酶酶活力及蛋白含量,計算出回收率及提純倍數(shù)。

    1.3.3 乙醇、丙酮分級沉淀甘薯β-淀粉酶方法

    取一定量粗酶提取液,緩慢加入預冷乙醇或丙酮分別至不同體積比(乙醇:粗酶液,V/V,下同),用磷酸-檸檬酸緩沖液調節(jié)溶液pH值至5.0,4℃冰箱中放置4h,8000r/min冷凍離心15min后,收集沉淀,將沉淀用磷酸緩沖液溶解。測沉淀分離后甘薯β-淀粉酶酶活力及蛋白含量,計算出回收率及提純倍數(shù)。

    1.3.4 甘薯β-淀粉酶酶活回收率計算

    1.3.5 甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)計算

    蛋白質測定采用考馬斯亮藍G-250法[9]。

    2 結果與分析

    2.1 不同飽和度硫酸銨對甘薯β-淀粉酶分離效果影響

    植物β-淀粉酶提取過程中有許多成分的物質溶出,除雜與提純是確定酶活性穩(wěn)定的要素[10]。選用不同飽和度硫酸銨鹽析甘薯粗提取液,根據1.3.2節(jié)所述方法,考察不同飽和度硫酸銨對甘薯β-淀粉酶回收率及提純倍數(shù)影響,結果見圖1、2。

    圖1 不同飽和度硫酸銨對β-淀粉酶回收率的影響Fig. 1 Effect of (NH4)2SO4with various saturation degrees on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

    圖2 不同飽和度硫酸銨對β-淀粉酶提純倍數(shù)影響Fig.2 Effect of (NH4)2SO4with various saturation degrees on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

    圖1表明,不同飽和度硫酸銨對β-淀粉酶回收率影響較大。硫酸銨飽和度在20%~40%范圍內,回收率變化不大。隨著硫酸銨飽和度增加,酶活回收率呈增大趨勢,在70%時β-淀粉酶活性回收率最高達到(78.05±0.8)%,飽和度在大于80%時,酶活回收率迅速降低。分析圖2可知,硫酸銨飽和度在70%時,提純倍數(shù)達到最大,提純(1.56±0.031)倍。經顯著性方差分析,硫酸銨飽和度在60%~80%范圍內,P<0.05水平上回收率及提純倍數(shù)都有顯著性差異,因此,硫酸銨鹽析β-淀粉酶最佳飽和度為70%。

    2.2 有機溶劑沉淀β-淀粉酶實驗

    2.2.1 乙醇不同添加量對甘薯β-淀粉酶回收率及提純倍數(shù)的影響

    圖3 不同體積比乙醇對甘薯β-淀粉酶回收率的影響Fig.3 Effect of ethanol amount on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

    由圖3可知,在乙醇體積比為0.2:1~4:1條件下,酶活性回收率隨著乙醇體積比的增加而增大,在4:1處達到最大為(76.80±0.03)%。這與文獻報道的乙醇體積比不同,可能是因為甘薯不同品種所致[11]。經顯著性方差分析,乙醇體積比在3:1~4:1范圍內,在P<0.05水平上沒有顯著性差異。圖4結果表明,在體積比0.2:1~5:1范圍內,提純了(0.21±0.014)~(2.62±0.16)倍,在體積比4:1時,提純倍數(shù)達到最大,達到2.62倍。經顯著性方差分析,在體積比3:1~5:1范圍內,在P<0.05水平上有顯著性差異。因此,乙醇沉淀β-淀粉酶最佳體積比為4:1。

    圖4 不同體積比乙醇對甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)的影響Fig.4 Effect of ethanol amount on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

    2.2.2 不同丙酮添加量對甘薯β-淀粉酶回收率及提純倍數(shù)的影響

    圖5 不同體積比丙酮對甘薯β-淀粉酶回收率的影響Fig.5 Effect of acetone amount on the recovery rate ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

    圖6 不同體積比丙酮對甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)的影響Fig.6 Effect of acetone amount on the purification fold ofβ-amylase from the supernatant of sweet potato homogenate

    由圖5可知,不同的丙酮與粗酶液體積比對β-淀粉酶回收率影響較大。體積比為0.2:1~3:1范圍時,酶活回收率逐漸升高,在3:1處達到最大,回收率為(88.05±0.05)%,然后隨著丙酮用量的增加,回收率逐漸降低。圖6分析可知,丙酮與粗酶液體積比為3:1時,提純倍數(shù)最高,提純(2.64±0.09)倍。經顯著性方差分析,在丙酮體積比2:1~4:1范圍內,P<0.05水平上回收率及提純倍數(shù)都有顯著性差異。因此,丙酮沉淀β-淀粉酶最佳體積比為3:1。

    由以上硫酸銨、乙醇、丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶對比實驗可知,丙酮沉淀效果最佳,在丙酮與粗酶液體積比3:1時,回收率及提純倍數(shù)達到最高,分別為(88.05±0.05)%、2.64±0.09。

    2.2.3 丙酮沉淀β-淀粉酶最佳pH值的確定

    由于酶蛋白在其等電點處靜電荷為零,溶解度最低,容易沉淀析出,故在確定丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶體積比3:1為最佳分離條件后,按上述工藝加入丙酮,用磷酸緩沖液分別調節(jié)溶液pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,測定甘薯β-淀粉酶酶活及蛋白含量。計算酶活回收率及提純倍數(shù),結果如圖7、8所示。

    圖7 不同pH值對甘薯β-淀粉酶回收率的影響Fig.7 Effect of pH of acetone solution on the recovery rate ofβamylase from the supernatant of sweet potato homogenate

    圖8 不同pH值對甘薯β-淀粉酶提純倍數(shù)的影響Fig.8 Effect of pH of acetone solution on the purification fold ofβamylase from the supernatant of sweet potato homogenate

    由圖7分析可知,沉淀β-淀粉酶時pH值對酶回收率影響較明顯。在pH4.0~4.5范圍內,酶活性回收率迅速增大,在pH4.5時達到最大值(90.66±0.02)%,隨著pH值繼續(xù)增大,回收率又逐漸降低。圖8表明,pH值對β-淀粉酶提純倍數(shù)影響較大,變化范圍為(2.27±0.12)~(3.29±0.17),在pH5.0處達到最大,提純(3.29±0.17)倍。經顯著性方差分析,在pH4.5~5.5范圍內,P<0.05水平上酶活回收率沒有顯著性差異,在pH4.0~6.0范圍內提純倍數(shù)有顯著性差異。綜合分析,pH5.0為丙酮沉淀β-淀粉酶最佳pH值。

    3 結論與討論

    3.1 通過對硫酸銨鹽析和有機溶劑沉淀甘薯β-淀粉酶進行比較實驗,得出利用丙酮沉淀分離β-淀粉酶為最佳的分離條件,當丙酮體積比3:1、pH4.5~5.0時回收率最高可達90.66%,提純3.29倍,這與李瑩等[7]的乙醇沉淀甘薯β-淀粉酶結果相比較,提純倍數(shù)有較大的提高,由此可知,用丙酮沉淀甘薯β-淀粉酶更為合理。

    3.2 隨著pH值的變化,酶活性回收率及提純倍數(shù)變化幅度較大,說明在強酸強堿條件下,酶液易失活[12-13]。在pH4.5處,酶液表現(xiàn)出較高活性。

    3.3 通過最佳pH的實驗結果可知,在pH5.0處提純倍數(shù)達到最高,由于在等電點處蛋白質易沉淀,可知甘薯β-淀粉酶的等電點應為5.0左右。這與朱婉華等[14]測得的大豆β-淀粉酶等電點基本一致。

    3.4 本實驗通過對β-淀粉酶分離方法的比較實驗,得出了較為合適的分離方法,為β-淀粉酶的進一步純化提供了重要依據。

    [1] ANN Y G, LIZUKA M, YAMAMOTO T, et al. Preparation and some properties of active monomer of sweet potatoβ-amylase[J]. Agric Biol Chem, 1990, 54(3):769-774.

    [2] Van DAMME E J M, HU Jialiang, BARRE A, et al. Purification,characterization, immunolocalization and structural analysis of the abundant cytoplasmicβ-amylase fromCalystegia sepium(hedge bindweed)rhizomes[J]. Eur J Biochem, 2001, 268(23):6263-6273.

    [3] 靳紀培, 黃軍, 劉春風, 等. 響應曲面法優(yōu)化麥芽中β-淀粉酶提取工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(11):159-162.

    [4] 孫俊良. 酶制劑生產技術[M]. 北京:科學出版社, 2004:159-160.

    [5] 李新華, 鄂巍, 林琳. 紫甘薯β-淀粉酶水溶性提取技術的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(2):266-268.

    [6] 周艷利. 酶的分離純化過程中的沉淀分離技術[J]. 飲料工業(yè), 2007,10(4):1-3.

    [7] 李瑩, 周劍忠, 黃開紅. 甘薯β-淀粉酶的純化和特性研究[J]. 江蘇農業(yè)學報, 2009, 25(1):182-184.

    [8] 姜錫瑞, 段鋼. 酶制劑實用技術手冊[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,2002:434-436.

    [9] 趙英永, 戴云, 崔秀明, 等. 考馬斯亮藍G-250染色法測定草烏中可溶性蛋白質含量[J]. 云南民族大學學報, 2006, 15(3):235-237.

    [10] 邱宏端, 李志達, 沈衛(wèi)星, 等. 植物β-淀粉酶的提取與酶制劑的制備[J]. 福州大學學報, 1996, 24(6):104-108.

    [11] 田亞平, 郭鴻飛, 肖光焰, 等. 一種麥芽β-淀粉酶的純化和特性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2003, 24(9):22-24.

    [12] SWANSTON J S, MOLINA-CANO J L. Beta-amylase activity and thermostability in two mutants derived from the malting barley cv.Triumph[J]. Journal of Cereal Science, 2001, 33(2):155-161.

    [13] SARIKAYA E, HIGASA T, ADACHI M, et al. Comparison of degradation abilities ofα-andβ-amylases on raw starch granules[J]. Process Biochemistry, 2000, 35(7):711-715.

    [14] 朱婉華, 鄭偉娟, 武力, 等. 大豆β-淀粉酶的純化和性質研究[J]. 南京大學學報, 1994, 30(1):174-178.

    Separation ofβ-amylase from Sweet Potato by Different Precipitation Methods

    JIA Yan-jie1,LIANG Xin-hong2,ZHU Wen-xue1,SUN Jun-liang2,*,GUO Zu-feng2
    (1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China;2. College of Food, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

    Q814.1

    A

    1002-6630(2010)18-0022-04

    2010-05-20

    河南省科技計劃項目(102102210192);河南科技學院博士基金項目(09001)

    賈彥杰(1985—),男,碩士研究生,主要從事食品生物技術研究。E-mail:henankeyuan@126.com

    *通信作者:孫俊良(1964—),男,教授,博士,主要從事食品發(fā)酵微生物與酶制劑研究。E-mail:sjl@hist.edu.cn

    猜你喜歡
    鹽析硫酸銨丙酮
    墨西哥取消對中國硫酸銨進口關稅
    硫酸銨出口連創(chuàng)新高
    2018年我國硫酸銨出口形勢分析
    冷凍丙酮法提取山核桃油中的亞油酸和亞麻酸
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:37:06
    乙酰丙酮釹摻雜聚甲基丙烯酸甲酯的光學光譜性質
    鹽析法純化新鮮藍藻中藻藍蛋白工藝條件的研究
    PVA膜滲透汽化分離低濃度丙酮/水溶液的實驗研究
    應用化工(2014年4期)2014-08-16 13:23:09
    上海建苯酚丙酮廠
    2014年9月17日硫酸銨出廠參考價格
    聯(lián)堿氯化銨過程鹽析結晶器溫升
    人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 99热只有精品国产| 91成人精品电影| 午夜福利,免费看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 女警被强在线播放| 看免费av毛片| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 精品人妻在线不人妻| 香蕉丝袜av| 99在线视频只有这里精品首页| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 窝窝影院91人妻| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久天堂一区二区三区四区| а√天堂www在线а√下载| 久9热在线精品视频| 欧美中文综合在线视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日韩中文字幕欧美一区二区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 在线天堂中文资源库| 亚洲精品美女久久av网站| 国产成人影院久久av| 老司机午夜福利在线观看视频| 色综合婷婷激情| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99在线人妻在线中文字幕| 99riav亚洲国产免费| √禁漫天堂资源中文www| 欧美人与性动交α欧美软件| 免费少妇av软件| 黑丝袜美女国产一区| 久久香蕉激情| 丝袜美足系列| 黄色 视频免费看| 亚洲片人在线观看| 大型av网站在线播放| 欧美一级毛片孕妇| 欧美不卡视频在线免费观看 | 天堂影院成人在线观看| 妹子高潮喷水视频| 久久精品影院6| 国产精华一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 1024香蕉在线观看| 国产精华一区二区三区| 看免费av毛片| 男女午夜视频在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 91大片在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产成年人精品一区二区 | 最好的美女福利视频网| 欧美在线一区亚洲| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 又黄又爽又免费观看的视频| 免费少妇av软件| 大型av网站在线播放| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 日韩欧美三级三区| 亚洲av熟女| 国产单亲对白刺激| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品人妻在线不人妻| 午夜亚洲福利在线播放| 女人被狂操c到高潮| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 波多野结衣高清无吗| 妹子高潮喷水视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 黄色视频不卡| 亚洲中文av在线| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲一码二码三码区别大吗| 满18在线观看网站| 日本a在线网址| 欧美日韩一级在线毛片| 日日夜夜操网爽| 18禁观看日本| 国产欧美日韩精品亚洲av| 免费人成视频x8x8入口观看| 婷婷丁香在线五月| 在线观看免费视频日本深夜| 午夜福利一区二区在线看| 91av网站免费观看| 国产亚洲欧美98| 无限看片的www在线观看| ponron亚洲| 午夜免费观看网址| 久久精品成人免费网站| 国产av一区在线观看免费| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲伊人色综图| 一二三四社区在线视频社区8| 麻豆av在线久日| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 色播在线永久视频| 免费在线观看影片大全网站| 黄色视频不卡| 一级片'在线观看视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲av美国av| 99久久人妻综合| 亚洲男人天堂网一区| 日本免费a在线| 三级毛片av免费| 丁香六月欧美| 少妇粗大呻吟视频| 在线永久观看黄色视频| 电影成人av| 亚洲avbb在线观看| 午夜两性在线视频| 欧美日本中文国产一区发布| 男人操女人黄网站| 久久 成人 亚洲| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 午夜a级毛片| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 99久久人妻综合| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美精品一区二区免费开放| 久久 成人 亚洲| 久久精品国产综合久久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美中文日本在线观看视频| 9191精品国产免费久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产激情欧美一区二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲精华国产精华精| 少妇的丰满在线观看| 窝窝影院91人妻| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产亚洲欧美在线一区二区| 两人在一起打扑克的视频| 脱女人内裤的视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品日韩av在线免费观看 | 夫妻午夜视频| 欧美性长视频在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 一级片'在线观看视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久香蕉国产精品| 久99久视频精品免费| 精品一区二区三区av网在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美丝袜亚洲另类 | 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 自线自在国产av| 狠狠狠狠99中文字幕| 成年女人毛片免费观看观看9| 咕卡用的链子| 波多野结衣av一区二区av| 国产有黄有色有爽视频| av网站在线播放免费| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美日本中文国产一区发布| 国产麻豆69| 黑人操中国人逼视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| av在线天堂中文字幕 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产av一区二区精品久久| 69精品国产乱码久久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产片内射在线| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产国语露脸激情在线看| 一级毛片高清免费大全| 黄色 视频免费看| 久久久国产精品麻豆| 精品国产一区二区久久| 久久久久久久久中文| 国产亚洲av高清不卡| 嫩草影院精品99| 首页视频小说图片口味搜索| 色老头精品视频在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 99riav亚洲国产免费| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲性夜色夜夜综合| 久久这里只有精品19| 9191精品国产免费久久| 亚洲国产精品999在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 91麻豆av在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品乱码久久久久久99久播| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品国产高清国产av| 亚洲片人在线观看| 后天国语完整版免费观看| 亚洲情色 制服丝袜| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 中文字幕人妻丝袜制服| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美中文日本在线观看视频| 国产深夜福利视频在线观看| 国产免费现黄频在线看| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩免费av在线播放| 国产免费现黄频在线看| 国产97色在线日韩免费| 热99国产精品久久久久久7| 国产又爽黄色视频| 欧美乱妇无乱码| 久久青草综合色| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 女人精品久久久久毛片| 亚洲三区欧美一区| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久国产亚洲av麻豆专区| av天堂在线播放| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久伊人香网站| 日韩中文字幕欧美一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 自线自在国产av| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲avbb在线观看| 精品久久久精品久久久| 日本欧美视频一区| 精品国产乱码久久久久久男人| 两性夫妻黄色片| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲美女黄片视频| 成人手机av| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲国产看品久久| 国产成人精品无人区| 制服人妻中文乱码| 久久久国产欧美日韩av| 超色免费av| 我的亚洲天堂| 两个人免费观看高清视频| 国产av又大| 色播在线永久视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 久99久视频精品免费| 亚洲av成人一区二区三| 丰满的人妻完整版| 99精品久久久久人妻精品| 久热爱精品视频在线9| 免费高清视频大片| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲精品在线美女| 丝袜美腿诱惑在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 97碰自拍视频| 亚洲七黄色美女视频| 成人精品一区二区免费| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产成人欧美在线观看| 久久香蕉精品热| 午夜福利在线免费观看网站| 一级,二级,三级黄色视频| 高清av免费在线| 在线观看免费视频日本深夜| 国产午夜精品久久久久久| 免费看十八禁软件| 久久亚洲精品不卡| 18禁美女被吸乳视频| 午夜亚洲福利在线播放| bbb黄色大片| 精品一区二区三区av网在线观看| 水蜜桃什么品种好| 免费少妇av软件| 国产av精品麻豆| 99香蕉大伊视频| 十八禁网站免费在线| 亚洲美女黄片视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美成人性av电影在线观看| 99热国产这里只有精品6| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 日韩欧美免费精品| 久久久久国内视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成年女人毛片免费观看观看9| 淫妇啪啪啪对白视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 午夜影院日韩av| 国产精品一区二区三区四区久久 | 电影成人av| 成人国语在线视频| 热re99久久国产66热| 久热爱精品视频在线9| 日本欧美视频一区| 久久中文字幕人妻熟女| 午夜老司机福利片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 91精品三级在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 日韩免费av在线播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品高清国产在线一区| 精品国产一区二区三区四区第35| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美日韩av久久| 啦啦啦 在线观看视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 精品人妻在线不人妻| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美日韩精品网址| 亚洲中文av在线| 精品久久久久久成人av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 在线观看午夜福利视频| 动漫黄色视频在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 午夜a级毛片| 日韩有码中文字幕| 女性被躁到高潮视频| 午夜免费观看网址| 99久久综合精品五月天人人| 午夜视频精品福利| 国产成人精品久久二区二区91| 国产99久久九九免费精品| 精品一区二区三卡| 老鸭窝网址在线观看| av国产精品久久久久影院| 午夜影院日韩av| 欧美丝袜亚洲另类 | 五月开心婷婷网| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久精品亚洲av国产电影网| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产激情欧美一区二区| 午夜免费观看网址| 欧美成人免费av一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产精品久久视频播放| 亚洲国产精品合色在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 欧美国产精品va在线观看不卡| 女性生殖器流出的白浆| 在线播放国产精品三级| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲精品一二三| 视频区欧美日本亚洲| 老司机福利观看| 九色亚洲精品在线播放| 国产一区二区激情短视频| 亚洲精华国产精华精| 国产成人啪精品午夜网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 天堂俺去俺来也www色官网| 久久精品国产清高在天天线| a级毛片在线看网站| x7x7x7水蜜桃| 看免费av毛片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| www.自偷自拍.com| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 黄片大片在线免费观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线国产一区二区在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久久久人人人人人| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 一级毛片女人18水好多| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲伊人色综图| 一二三四社区在线视频社区8| 最近最新中文字幕大全免费视频| tocl精华| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 麻豆久久精品国产亚洲av | 亚洲精华国产精华精| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品电影一区二区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久热这里只有精品99| 黄色视频,在线免费观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 免费观看精品视频网站| 水蜜桃什么品种好| 免费看a级黄色片| 大陆偷拍与自拍| 99久久综合精品五月天人人| 在线观看免费高清a一片| 欧美日韩黄片免| 欧美日本亚洲视频在线播放| 岛国视频午夜一区免费看| 黄片大片在线免费观看| 国产激情久久老熟女| 一级a爱视频在线免费观看| 在线永久观看黄色视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产成人欧美在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 老司机靠b影院| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲七黄色美女视频| 精品欧美一区二区三区在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲熟妇熟女久久| 精品久久久久久电影网| 欧美大码av| 身体一侧抽搐| 欧美日韩乱码在线| 桃色一区二区三区在线观看| 色播在线永久视频| 18禁观看日本| 亚洲男人天堂网一区| 1024视频免费在线观看| 欧美大码av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| www.自偷自拍.com| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产高清视频在线播放一区| 天天添夜夜摸| 99国产精品99久久久久| 久久久久久大精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 日本黄色日本黄色录像| 人人澡人人妻人| 国产野战对白在线观看| 国产黄色免费在线视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一级片免费观看大全| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久中文字幕人妻熟女| 香蕉久久夜色| 91av网站免费观看| 欧美性长视频在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精品野战在线观看 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 9191精品国产免费久久| 亚洲九九香蕉| 国产伦一二天堂av在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品九九99| 黄色a级毛片大全视频| 久久亚洲精品不卡| √禁漫天堂资源中文www| 男女下面进入的视频免费午夜 | 99久久人妻综合| 日韩有码中文字幕| 18禁观看日本| 久久精品91无色码中文字幕| 国产av一区在线观看免费| 免费少妇av软件| 黄片大片在线免费观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 长腿黑丝高跟| 亚洲精品久久午夜乱码| 老汉色av国产亚洲站长工具| 黄色a级毛片大全视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 99精品欧美一区二区三区四区| 制服人妻中文乱码| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲五月婷婷丁香| 无遮挡黄片免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日韩有码中文字幕| 国产高清激情床上av| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99精品久久久久人妻精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线| x7x7x7水蜜桃| 国产精品久久久av美女十八| 女警被强在线播放| av视频免费观看在线观看| 级片在线观看| www.999成人在线观看| 怎么达到女性高潮| 啦啦啦 在线观看视频| 色综合婷婷激情| 免费观看人在逋| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 天堂中文最新版在线下载| 国产亚洲av高清不卡| 久久久国产成人免费| 一本大道久久a久久精品| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩免费高清中文字幕av| 51午夜福利影视在线观看| 成人精品一区二区免费| 免费高清在线观看日韩| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 成人黄色视频免费在线看| 久久久久久人人人人人| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲免费av在线视频| 亚洲国产精品sss在线观看 | 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲一码二码三码区别大吗| av免费在线观看网站| 90打野战视频偷拍视频| av天堂久久9| 久久香蕉国产精品| 色综合婷婷激情| 亚洲人成77777在线视频| 国产免费男女视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜精品在线福利| 一a级毛片在线观看| 高清在线国产一区| 亚洲精品美女久久av网站| 日韩欧美在线二视频| 日本五十路高清| 老司机午夜福利在线观看视频| 美女午夜性视频免费| 夫妻午夜视频| 国产又爽黄色视频| svipshipincom国产片| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久中文字幕一级| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 最近最新免费中文字幕在线| 久久精品91蜜桃| 无人区码免费观看不卡| 搡老岳熟女国产| 午夜久久久在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 校园春色视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| xxxhd国产人妻xxx| a级毛片在线看网站| 黄色 视频免费看| 久久这里只有精品19| 美女大奶头视频| av天堂久久9| 日韩三级视频一区二区三区| 日日夜夜操网爽| 又大又爽又粗| 欧美一区二区精品小视频在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩欧美三级三区| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲av第一区精品v没综合| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久久久人人人人人| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲在线自拍视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| tocl精华| 亚洲成人免费av在线播放| 日韩欧美在线二视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日韩人妻精品一区2区三区|