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    燕麥乙醇提取物分級萃取組分對血管平滑肌細胞增殖的抑制作用

    2010-10-19 05:25:46籍保平楊佩穎蔡圣寶
    食品科學 2010年21期
    關(guān)鍵詞:正丁醇正己烷燕麥

    黃 晨,籍保平*,楊佩穎,周 峰,吳 薇,蔡圣寶

    (中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083)

    燕麥乙醇提取物分級萃取組分對血管平滑肌細胞增殖的抑制作用

    黃 晨,籍保平*,楊佩穎,周 峰,吳 薇,蔡圣寶

    (中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083)

    選用不同極性的溶劑對燕麥乙醇提取物進行分級萃取,并對得到的4種不同萃取組分進行體外DPPH自由基清除能力、抑制血管平滑肌細胞(VSMC)增殖能力及促進VSMC釋放NO能力進行評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn):4種組分中,乙酸乙酯萃取組分具有最強的DPPH自由基清除能力,其EC50值為(2.5±0.4)mg/mL;通過抑制VSMC增殖的實驗研究發(fā)現(xiàn),乙酸乙酯萃取組分能顯著抑制VSMC增殖,提高VSMC產(chǎn)NO能力。選用HPLC對乙酸乙酯萃取組分進行初步分析發(fā)現(xiàn)其主要含有3種蒽酰胺組分,分別為Bc、Bp和Bf。

    燕麥乙醇提取物;血管平滑??;增殖抑制作用;一氧化氮

    Abstract:The ethanol extract from oat was fractionated with different polarity solvents (n-hexane, ethyl acetate, 1-butanol and water), and the four fractions obtained were assessed for their abilities to scavenge DPPH free radicals, inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) and promote the release of NO from VSMCin vitro. Among these four fractions,the ethyl acetate soluble fraction had the most prominent DPPH free radical scavenging ability, with an EC50 of (2.5±0.4)mg/mL. Meanwhile, this fraction could remarkably inhibit the proliferation of VSMC and elevate the NO producing ability. The preliminary HPLC analysis indicated that this fraction mainly contained three kinds of avenanthramide, Bc, Bp and Bf.

    Key words:ethanol extract from oat;vascular smooth muscle cell;inhibition of proliferation;NO

    動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性炎癥疾病,由多種危險因素誘發(fā),伴隨有動脈內(nèi)膜和內(nèi)膜下脂質(zhì)(膽固醇、膽固醇酯、磷脂等)的沉積,同時伴有平滑肌細胞(VSMC)和纖維成分的增殖,逐漸發(fā)展形成局部性斑塊,動脈管壁因而增厚變硬,斑塊內(nèi)部組織壞死崩解與沉積的脂質(zhì)結(jié)合,形成“粥樣”物質(zhì)。AS能造成通往心臟和大腦的動脈血管變狹窄,甚至堵塞,其發(fā)展的最后結(jié)果是冠心病和腦血管意外[1]。體外實驗顯示,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)通過刺激VSMC內(nèi)神經(jīng)鞘磷脂酶活性以及促進VSMC釋放成纖維細胞生成因子等發(fā)生作用能促進VSMC和巨噬細胞增殖,VSMC增殖是AS病變的最主要特征之一[2]。目前國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種抗氧化劑可以在動物模型中抑制泡沫細胞的形成,從而起到抗AS的作用,如N-乙酰半胱氨酸等,其作用機理主要是通過清除活性氧(ROS),抑制LDL氧化,從而抑制炎癥基因表達和VSMC增殖,起到血管細胞保護作用[3]。

    燕麥具有較全面的營養(yǎng)價值,抗氧化性是燕麥較為突出的一項生理功能。早在20世紀30年代就有學者發(fā)現(xiàn)燕麥具有抗氧化性,并提出將燕麥作為一種抗氧化劑的來源。近年來,燕麥的抗氧化活性已成為西方發(fā)達國家研究的熱點之一,并對燕麥抗氧化成分組成進行了一系列的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),燕麥中含有多種抗氧化物質(zhì),包括VE,酚類等物質(zhì),而酚類物質(zhì)是其中含量最豐富的抗氧化成分,此外燕麥中還含有少量類黃酮和甾體[4]。本研究選用不同極性的溶劑對燕麥醇提物進行分級萃取,得到4種不同的萃取組分,并對這4種組分的體外清除DPPH自由基能力和抑制VSMC增殖作用進行研究,為燕麥功能產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    G4品種燕麥 中國農(nóng)業(yè)科學院作物品種資源研究所;兔胸主動脈平滑肌細胞 中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心。

    DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS) 美國Gibco公司;DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基,2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Sigma公司;NO測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;ox-LDL 中國協(xié)和醫(yī)科大學生化教研室;蒽酰胺標準品(Bc、Bp、Bf) 美國農(nóng)業(yè)部谷物研究中心專家Mitchell Wise博士惠贈;乙腈(色譜純) 美國Mallinckrodt Baker 公司;甲醇(色譜純)北京化學試劑公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    XDOS-1B倒置顯微鏡 重慶光電有限公司;MCO-15AC培養(yǎng)箱、S2ML420/2420U全自動殺菌釜 日本Sanyo公司;Mltiskan MK3自動酶標儀 美國Thermo公司;LC-10ATvp HPLC泵、SPD-M10Avp二極管陣列檢測器、DGU-12A HPLC脫氣機、Shim-Pack VP-ODSC18分析柱(250mm×4.6mm,5μm)、Shim-Pack GVP-ODS C18分析柱保護柱(10mm×4.6mm,5μm) 日本島津公司。

    1.3 方法

    1.3.1 燕麥乙醇提取物不同組分萃取

    干燥燕麥打粉后稱取100g燕麥粉,先用1L 80%無水乙醇30℃超聲提取30min,然后置于60℃、150r/min恒溫水浴器中水浴振蕩2h,冷卻到室溫,1200×g離心15min,取上清,殘渣重復(fù)提取一次,合并上清,45℃真空濃縮至膏狀,冷凍干燥得到燕麥乙醇提取物。稱取適量燕麥乙醇提取物,先用少量甲醇分散,然后加蒸餾水溶解,將溶液置于分液漏斗中,加入正己烷,充分振搖萃取,靜置,待溶液完全分層后,取出上層的正己烷萃取液,下層再用同法萃取兩次,將3次的正己烷萃取液合并,用無水硫酸鈉干燥后,減壓回收正己烷,得到燕麥乙醇提取物的正己烷部分。正己烷萃取后的水溶液按照上述同樣的方法用乙酸乙酯、正丁醇依次萃取,依次得到了乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏。將正己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取物真空干燥,水萃取物冷凍干燥分別得到4種固體粉末。

    1.3.2 燕麥乙醇提取物分級萃取組分清除DPPH自由基能力測定

    燕麥乙醇提取物各分級萃取物DPPH自由基能力清除測定根據(jù)Kondo等[5]使用的方法完成。用無水乙醇配制濃度為0.06mmol/L的DPPH溶液,吸取該溶液4mL于試管中,加入0.2mL無水乙醇,作為空白,于波長517nm處測其初始吸光度(A0);另取4mL DPPH溶液,加入0.2mL樣品溶液,避光放置1h后于波長517nm處測定其吸光度(A1)。用吸光度的大小表示DPPH溶液濃度的高低。根據(jù)測得的吸光度A0、A1及DPPH溶液的初始濃度即可計算樣品的EC50值(即將DPPH溶液濃度減至50%時所需的樣品濃度)。EC50值大小與DPPH自由基清除能力成反比。每個樣品測定時作3次平行。

    1.3.3 VSMC增殖模型建立

    取12代的VSMC,用0.25%胰蛋白酶消化制成細胞懸液,計數(shù)并接種于96孔板中,加入含20%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基,使每孔最終體積為200μL,培養(yǎng)24h使細胞貼壁后加入不同濃度的ox-LDL培養(yǎng)24h,然后利用MTT法測定VSMC的增殖吸光度,并用NO試劑盒測定上清液中NO含量。

    1.3.4 燕麥乙醇提取物分級萃取物對VSMC增殖抑制作用

    1.3.4.1 細胞增殖能力測定

    棄去培養(yǎng)液,每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng),吸棄培養(yǎng)上清液,每孔加150μL DMSO,振蕩10min;在490nm波長處進行比色,在酶標儀上測定各孔吸光度。吸光度與細胞活性成正比,吸光度越大表示細胞活性越強。

    1.3.4.2 NO的測定

    細胞培養(yǎng)24h后,收集培養(yǎng)液離心,測上清液NO含量,按試劑盒方法進行操作。

    1.3.5 乙酸乙酯萃取組分的HPLC分析

    HPLC條件:VP-ODS C18柱 (250mm ×4.6mm,5μm);柱溫30℃;檢測器為二極管陣列檢測器(SPDM10 Avp)。液相條件:流動相為兩相,A相為100%乙腈,B相為含有0.1%甲酸的蒸餾水,流速控制在1mL/min。梯度洗脫為:0~5min乙腈的體積分數(shù)保持為18%,5~50min乙腈的體積分數(shù)變化為18%~35%;50~51min乙腈體積分數(shù)變化為35%~60%;51~65min乙腈體積分數(shù)保持為60%;65~66min乙腈體積分數(shù)變化為60%~18%。進樣量每次20μL。檢測波長為330nm。

    1.4 統(tǒng)計分析

    采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理,實驗結(jié)果以平均值±標準差(±s)表示,采用組間t檢驗,P<0.05具有顯著性差異,P<0.01具有極顯著性差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 燕麥乙醇提取物分級萃取物的質(zhì)量和質(zhì)量分數(shù)

    按照極性由小到大的順序,選取正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水對燕麥乙醇提取物進行分級萃取,得到燕麥乙醇提取物的4種不同萃取物,其占乙醇提取物的質(zhì)量分數(shù)見表1,其中極性最低的正己烷萃取物質(zhì)量分數(shù)最高,達到了乙醇提取物質(zhì)量的44.57%,其次是水部分,為6.56%,乙酸乙酯和正丁醇部分萃取質(zhì)量分數(shù)最低,分別為乙醇提取物質(zhì)量的3.86%和2.66%。

    表1 燕麥乙醇提取物分級萃取物的質(zhì)量和質(zhì)量分數(shù)Table 1 Masses and percentages of different polarity fractions in ethanol extract from oat

    2.2 燕麥分級萃取物的DPPH自由基能力清除測定

    表2 燕麥乙醇提取物分級萃取物清除DPPH自由基EC50值Table 2 EC50values of different polarity fractions of ethanol extract from oat for scavenging DPPH free radicals

    由表2可知,乙酸乙酯萃取物的EC50值最小(P<0.01),也就是說其清除DPPH自由基的能力最強,其次是正丁醇萃取物,正己烷萃取物和水萃取物EC50值最大,說明它們的DPPH自由基清除能力遠遠低于乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。

    2.3 ox-LDL誘導VSMC增殖模型的建立

    ox-LDL是AS發(fā)展和形成的關(guān)鍵因素,它由LDL氧化修飾形成,能夠損傷內(nèi)皮細胞,導致泡沫細胞形成,還能促進血管VSMC和巨噬細胞的增殖[6],因此用ox-LDL誘導可以較好的模擬體內(nèi)AS形成病理過程,在很多研究中廣泛用于VSMC增殖模型的建立[7]。從圖1可以看出,VSMC經(jīng)過ox-LDL誘導培養(yǎng)24h后,各質(zhì)量濃度ox-LDL下細胞均發(fā)生了顯著的增殖,MTT所得的吸光度較正常對照組有顯著的差異,尤其在ox-LDL質(zhì)量濃度達到30μg/mL的時候,細胞增殖最為明顯(P<0.01),之后細胞增殖呈現(xiàn)下降趨勢。有研究表明,NO能通過阻止VSMC細胞周期的運行、抑制VSMC 的有絲分裂來抑制VSMC的增殖[8-9]。隨著VSMC的增殖,NO生成量相應(yīng)減少,其對VSMC增殖的抑制作用下降,形成惡性循環(huán)。當ox-LDL質(zhì)量濃度超過20μg/mL時,NO的釋放量發(fā)生顯著的降低,當ox-LDL質(zhì)量濃度為30μg/mL時,NO釋放量是所有組中最低的(P<0.01)。

    從以上實驗結(jié)果可以得出,30μg/mLox-LDL與VSMC共同孵育培養(yǎng)24h后,VSMC增殖最明顯,NO的生產(chǎn)量最低,因此,可以選用30μg/mL作為造模質(zhì)量濃度。

    圖1 ox-LDL處理VSMC后MTT和NO值變化Fig.1 Effect of treatment with different concentrations of ox-LDL on MTT value and NO release

    2.4 燕麥乙醇提取物分級萃取物對VSMC細胞增殖的抑制作用

    2.4.1 細胞增殖能力測定

    圖2 燕麥乙醇提取物分級萃取物對VSMC增殖的抑制作用Fig.2 Comparative inhibitory effects of different polarity fractions of ethanol extract from oat on VSMC proliferation

    各樣品對兔胸VSMC增殖抑制作用的影響如圖2所示。與模型對照組相比,燕麥乙醇提取物正己烷萃取部分和水萃取部分各組對VSMC的增殖均沒有顯著的抑制作用(P>0.05);高質(zhì)量濃度和低質(zhì)量濃度的正丁醇萃取部分(CH、CL)對VSMC的增殖有較顯著的抑制作用(P<0.05);而不同質(zhì)量濃度乙酸乙酯萃取物 (YH、YM、YL)對VSMC的增殖具有極其顯著的抑制作用(P<0.01),由此可知乙酸乙酯萃取物抑制ox-LDL誘導的VSMC增殖作用最好。

    2.4.2 燕麥乙醇提取物分級萃取物對VSMC產(chǎn)NO能力影響

    圖3 燕麥乙醇提取物分級萃取物對VSMC產(chǎn)NO能力影響Fig.3 Comparative inhibitory effects of different polarity fractions of ethanol extract from oat on NO release

    圖3顯示了各萃取物部分對兔胸VSMC產(chǎn)NO能力的影響。造模濃度ox-LDL孵育24h后,與正常對照組(K)比較,模型對照組(M)VSMC釋放NO的含量顯著減少(P<0.01),燕麥乙醇提取物正己烷萃取部分(WH、WM、WL)和水萃取組分(SH、SM、SL)各組對ox-LDL誘導的VSMC產(chǎn)NO能力均沒有顯著的影響 (P>0.05)。正丁醇萃取部分的中質(zhì)量濃度組(CM)和乙酸乙酯萃取部分低質(zhì)量濃度組(YL)對VSMC產(chǎn)NO能力有較顯著的增強作用(P<0.05);乙酸乙酯萃取物高質(zhì)量濃度和中質(zhì)量濃度組(YH、YM)對VSMC的產(chǎn)NO能力有極顯著的增強作用(P<0.01),綜上可知,乙酸乙酯萃取物能最大程度的促進NO的產(chǎn)生,對VSMC增殖具有顯著的抑制作用。

    2.5 乙酸乙酯萃取組分的HPLC分析

    圖4 燕麥乙酸乙酯萃取物的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC profile of ethyl acetate soluble fraction of ethanol extract from oat

    研究發(fā)現(xiàn)燕麥乙醇提取物的乙酸乙酯萃取組分具有最好的抑制VSMC增殖功效,因此用HPLC對乙酸乙酯萃取組分進行了初步的成分分析,結(jié)果如圖4所示,在色譜圖中出現(xiàn)了3個較大的檢測峰A、B、C,是乙酸乙酯萃取組分的主要成分,它們的保留時間與燕麥蒽酰胺標準品Bc、Bp和Bf一致(圖5),分別為24.1、32.6、35.0min,因此可以初步推斷峰A是蒽酰胺Bc、峰B是Bp、峰C是Bf。

    圖5 燕麥蒽酰胺標準品Bc、Bp和Bf 的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC profile of mixed Bc, Bp and Bf standards

    3 討 論

    AS發(fā)展過程中的一個重要病理特征就是VSMC的增殖。正常情況下,動脈壁中層的VSMC處于分化狀態(tài),沒有增殖和遷移的能力,但當在多種刺激因素作用下,VSMC可由分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿シ只癄顟B(tài),可以從中膜遷移至內(nèi)膜進行大量增殖[9]。而抑制VSMC增殖是治療AS等血管增殖性疾病的重要途徑。

    本研究采用ox-LDL誘導VSMC增殖。ox-LDL的生成是AS發(fā)展和形成的關(guān)鍵因素,它由LDL氧化修飾形成,能夠損傷內(nèi)皮細胞,導致泡沫細胞形成,還能促進血管VSMC和巨噬細胞增殖[5],因此用ox-LDL誘導較好地模擬了體內(nèi)AS形成病理過程,在很多研究中廣泛用于VSMC增殖模型的建立[10]。本研究選用不同質(zhì)量濃度的ox-LDL培養(yǎng)VSMC 24h后發(fā)現(xiàn),當ox-LDL質(zhì)量濃度為30μg/mL時,與正常對照組相比,VSMC出現(xiàn)極顯著增殖,而VSMC產(chǎn)NO的能力卻極顯著下降,從而說明,當ox-LDL質(zhì)量濃度為30μg/mL時能成功誘導造成VSMC增殖模型。

    4種燕麥乙醇提取物的分級萃取物干預(yù)對兔胸VSMC增殖的影響不同,其中正己烷萃取部分高中低3個質(zhì)量濃度組(WH、WM、WL)和水溶性組分(SH、SM、SL)對VSMC的增殖均沒有顯著抑制作用(P>0.05)。高質(zhì)量濃度和低質(zhì)量濃度的正丁醇萃取部分(CH、CL)對VSMC的增殖有較顯著抑制作用(P<0.05);而不同質(zhì)量濃度乙酸乙酯萃取物組分(YH、YM、YL)對VSMC的增殖均具有極其顯著抑制作用(P<0.01)。這可能與不同組分清除DPPH自由基能力不同有關(guān),通過體外清除DPPH自由基實驗發(fā)現(xiàn),正己烷和水組分清除DPPH自由基能力較弱,而乙酸乙酯萃取組分具有很強的清除DPPH自由基能力,正丁醇萃取組分也具有一定的清除DPPH自由基能力。大量研究證明,VSMC的增殖對氧化還原作用非常敏感,許多抗氧化成分都能夠抑制VSMC的過度增殖,特別是酚類抗氧化成分,如綠茶多酚[6]、槲皮素[11]等。因此乙酸乙酯萃取組分和正丁醇萃取組分是否是通過抗氧化作用調(diào)節(jié)細胞生長周期和增殖能力而起作用,還有待于進一步研究。

    在AS形成發(fā)展的同時伴隨NO合成功能受損。NO是一種具有多種確定生物學作用的活性分子,它除具備可調(diào)節(jié)血管張力,抑制血小板向血管損傷部位的黏附和聚集,抑制白細胞與內(nèi)皮下基質(zhì)的黏附等有益作用外,還能抑制VSMC的增殖,其機制與NO能阻止VSMC細胞周期的運行、抑制VSMC 的有絲分裂及脫氧核糖核酸(DNA)的合成有關(guān)[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯和正丁醇萃取組分均能提高VSMC的NO生成量,乙酸乙酯組分的NO含量高于正丁醇組分。以往的許多研究表明酚類成分具有較強的VSMC增殖抑制力[11]。燕麥中含有豐富的酚類物質(zhì)[12]。美國塔夫斯大學營養(yǎng)研究中心用細胞培養(yǎng)評價手段,對燕麥酚類物質(zhì)抗AS能力進行了研究,發(fā)現(xiàn)燕麥酚類及蒽酰胺能夠抑制VSMC增生,修復(fù)內(nèi)皮細胞和VSMC合成NO能力,增強NO合酶(eNOS)活性,降低單層內(nèi)皮細胞黏附能力,具有潛在的抗AS功能[13-14]。它們的研究結(jié)果與燕麥醇提物乙酸乙酯萃取組分的研究結(jié)果具有一致性。

    本研究發(fā)現(xiàn)燕麥醇提物乙酸乙酯萃取組分在清除DPPH自由基,抑制VSMC增殖及促進VSMC合成NO能力方面均具有顯著的效果。通過HPLC分析乙酸乙酯萃取物組分和蒽酰胺標準品的保留時間,推斷乙酸乙酯萃取組分的3個主要檢測峰分別是蒽酰胺Bc、Bp和Bf。近年來,Peterson等[15]研究發(fā)現(xiàn)燕麥中的蒽酰胺Bc、Bp和Bf具有顯著的抗氧化效果,尤其是蒽酰胺Bc,其抗氧化效果最為顯著,因此乙酸乙酯萃取組分顯著的抑制VSMC增殖作用可能與蒽酰胺Bc、Bp和Bf有關(guān),這有待于進一步研究驗證。

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    Inhibitory Effect of Different Polarity Fractions of Ethanol Extract from Oat on Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation

    HUANG Chen,JI Bao-ping*,YANG Pei-ying,ZHOU Feng,WU Wei,CAI Sheng-bao
    (College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

    TS210.1

    A

    1002-6630(2010)21-0335-05

    2010-04-15

    “十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD05A06-Z01)

    黃晨(1984—),男,碩士研究生,主要從事功能食品研究。E-mail:huangchen19840925@yahoo.com.cn

    *通信作者:籍保平(1958 —),男,教授,碩士,主要從事功能食品研究。E-mail:jbp@cau.edu.cn

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