篤斯越橘花色苷提取物對光損傷人視網膜色素上皮細胞的保護作用

宋 雪，韓 勇，籍保平*，劉翼翔，呂業(yè)春

(中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

篤斯越橘花色苷提取物對光損傷人視網膜色素上皮細胞的保護作用

宋 雪，韓 勇，籍保平*，劉翼翔，呂業(yè)春

(中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

目的：通過建立人視網膜色素上皮細胞(hRPE)光損傷模型評價篤斯越橘花色苷對眼睛的保護作用及機理。方法：光損傷設置光強、光照時間、后續(xù)培養(yǎng)時間3個影響因素，以細胞存活率和乳酸脫氫酶活性評價模型建立情況；根據(jù)越橘花色苷提取物的干預方式分為預防組、應激組和修復組，每組設高、中、低3個濃度，檢測細胞存活率和血管內皮生長因子(VEGF)水平評價保護效果。結果：選擇光照度2500lx，光照24h后培養(yǎng)24h作為最佳造模條件，細胞損傷率達20%；預防組和應激組能有效保護細胞活力(P＜0.01)，修復組沒有效果，各組都能抑制由光損傷誘導hRPE細胞VEGF的過表達，但是不同濃度之間抑制能力有差異。結論：hRPE細胞光損傷程度呈光照強度和光照時間依賴性；越橘花色苷能通過保護hRPE的細胞活力和VEGF的過表達，實現(xiàn)保護眼科健康、預防眼科疾病的作用。

人視網膜色素上皮細胞；篤斯越橘花色苷提取物；光損傷；血管內皮生長因子

Abstract：Objective:To establish a photo-oxidative damage model of human retinal pigment epithelium (hRPE) cells for evaluating the protective effect of bilberry anthocyanin extract (BAE). Methods:Illumination intensity, exposure time and incubation time were selected as the factors to establish the model through evaluating cell variability and LDH activity.Meanwhile, the precaution group, stress group and repairing group were designed to administrate three different concentrations in each group. Cell viability and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression level were used to evaluate the preventive effect of BAE. Results:Illumination for 24 h at an intensity of 2500 lx and subsequent incubation time for 24 h were the optimal conditions for the model establishment. The damage rate of hPRE cells was up to 20%. No significant cell damage was observed for the precaution and the stress groups (P< 0.01), while the repairing group did not exhibit preventive effect. All the groups inhibited VEGF expression level in a dose-dependent manner. Conclusion:RPE cells can be damaged by visible light and the damage degree is correlated with illumination intensity and illumination duration. BAE can protect cells from light damage and inhibit VEGF level secreted from damaged cells. Therefore, people can intake bilberry to keep eye healthy and prevent the diseases of eyes.

Key words：human retinal pigment epithelium；bilberry anthocyanin extract；light damage；vascular endothelial growth factor

自從1966年Noell等[1]發(fā)現(xiàn)光可造成視網膜損傷后，人們逐漸意識到：光雖然是視覺系統(tǒng)進化和發(fā)育的動力，但是當光線的光強度、光照時間等超過了視網膜的承受力，將會造成視網膜的光損傷。視網膜光損傷日益成為眼科研究熱點。雖然人的角膜、眼房水、晶狀體可以吸收大部分對視網膜有害的近紫外光，讓其不進入視網膜，但長期的可見光照射(尤其可見光中的短波段)能誘發(fā)產生自由基，形成脂質過氧化物，從而參與多種眼疾的形成[2]，如視網膜色素變性(RP)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、黑色素瘤等[3]。因此，對視網膜光損傷的保護已成為預防眾多眼科疾病的基本措施。

研究發(fā)現(xiàn)，外源性抗氧化劑對光損傷后視網膜具有保護作用[4]。美國農業(yè)部(USDA)人類營養(yǎng)中心研究表明，與其他40多種新鮮水果和蔬菜相比，越橘的抗氧化能力最好，這與越橘果富含花色苷等多酚類物質有關?；ㄉ丈鼐哂卸喾N生物活性，其抗氧化活性比VE還高[5-6]。篤斯越橘(Vaccinium uliginosumL.，或bilberry)是我國大興安嶺的主要漿果資源之一，其對眼睛的保護功能早有報道[7]，但作用機理并不明確，相關基礎研究較少。本研究通過建立人視網膜色素上皮細胞光損傷模型評價篤斯越橘對視網膜光損傷的保護作用，揭示篤斯越橘對眼睛保護功能的作用機理，為以篤斯越橘為主開發(fā)保護眼睛及預防眼科疾病相關保健產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘，由東北大興安嶺區(qū)科技局提供(－20℃避光保存)；人視網膜色素上皮細胞(hRPE)，由中山大學眼科中心提供。

Delbecco 改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS) 美國Gibco公司；噻唑蘭(MTT) 美國Amresco公司；胰蛋白酶 美國Sigma化學公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒 南京建成生物工程研究所；VEGF酶聯(lián)免疫試劑盒 武漢博士倫生物工程有限公司；BCA試劑盒、青鏈霉素混合液和RIPA細胞裂解液 碧云天生物技術研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE-52 旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18型冷凍干燥機 軍事醫(yī)學科學院實驗儀器廠；XDOS-1B倒置顯微鏡 重慶光電有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；MCO-15AC培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；Multiskan MK3自動酶標儀 美國Thermo公司；ST-Ⅲ型光照度計 上海光電研究所；TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 篤斯越橘花色苷提取物的制備

越橘果于室溫下解凍，稱取10g于三角瓶中，加入300mL 70%乙醇，搖勻，50℃超聲波輔助提取20min，離心(3600r/min，15min)，取上清液，45℃濃縮，凍干得固體粉末。用DMEM培養(yǎng)基將越橘提取物(bilberry anthocyanin extract，BAE)分別配制成10、1、0.1μg/mL的溶液，于－20℃避光保存，待用。

1.3.2 hRPE細胞的復蘇和培養(yǎng)

復蘇：將凍存的hRPE細胞于37～40℃水浴迅速解凍(1～2min)，加入10倍體積的完全DMEM培養(yǎng)液(含體積分數(shù)10% FBS 和1%的青霉素鏈霉素混合液)，混勻后離心，棄去上清液。血球平板計數(shù)，以2×104個/mL的細胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，次日換液去除未貼壁的細胞。

培養(yǎng)：將復蘇的人hRPE細胞置于37℃、5% CO2、濕度為90%的孵箱內培養(yǎng)，每2d換液1次，細胞長至近融合狀態(tài)時0.25g/100mL胰蛋白酶消化傳代。第3～5代用于實驗。

1.3.3 建模方法

將hRPE細胞培養(yǎng)24孔板中，當細胞近鋪滿時，以自制LED燈作為光源，從底部直接照射。設立3個因素交互影響實驗：1)光照度分別為500、(2500±500)、(4000±500)lx；2)光照時間分別為12、24、36h；3)光照后培養(yǎng)時間分別為12、24、36h。正常對照組用黑色不透光布遮蓋。終止培養(yǎng)后，收集上清液于－20℃避光保存，最后同時檢測上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性；每批細胞終止培養(yǎng)后，立即用BCA試劑盒檢測細胞蛋白量和MTT法檢測細胞活力。以上實驗重復3次，每次3個平行。

1.3.4 MTT法測定細胞存活率

棄上清液，加入MTT終質量濃度為0.5mg/mL的無血清培養(yǎng)液200μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內的培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩5min使紫色結晶物充分溶解。用酶標儀于490nm波長處測定各孔的吸光度。根據(jù)公式(1)計算出細胞存活率：

式中：A樣品490nm為樣品在490nm波長處的吸光度；A對照490nm為正常對照組在490nm波長處的吸光度。

1.3.5 LDH檢測細胞的受損程度

將收集到的上清液按照試劑盒說明書操作，得出乳酸脫氫酶的活性(U/g pro)。

1.3.6 血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達的檢測

收集培養(yǎng)上清液于0.5mL的離心管中測定VEGF的含量，并裂解細胞測量細胞蛋白(BCA)。培養(yǎng)上清液于1500r/min離心10min，取上清液，按照人VEGF及BCA的測定試劑盒說明進行操作。分別在酶標儀450nm和560nm波長處讀取吸光度值，繪制標準曲線，分別得出相應VEGF的質量濃度CVEGF和蛋白含量Cpro。根據(jù)公式(2)計算出MVEGF：

式中：CVEGF為由標準曲線得出的VEGF質量濃度/(pg/mL)；Cpro為BCA試劑盒測得的細胞蛋白質量濃度/(mg/mL)。

1.3.7 篤斯越橘提取物(BAE)干預實驗分組

通過上述實驗得出最佳模型條件，以自制燈為光源器，調節(jié)光照度在(2500±500)lx，對照孔用黑布遮蓋。待96孔板中的細胞長至80%融合狀態(tài)時，將其分成以下幾組，每組7個平行。

正常對照組(NC)：不光照，不加提取物；模型對照組(MC)：光照24h，不加提取物；藥物預防組(PH、PM、PL)：實驗分PH、PM、PL三組，其劑量依次為10、1、0.1μg/mL，光照前分別加入提取物預處理24h后，光照培養(yǎng)24h；藥物應激組(SH、SM、SL)：實驗分SH、SM、SL三組，劑量設定同上，在光照的同時加入提取物，光照培養(yǎng)24h。藥物修復組(RH、RM、RL)：實驗分RH、RM、RL三組，劑量設定同上，光照24h后再加入提取物。

光照后，按照各組的處理方式繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后立即進行指標的檢測。

1.3.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，實驗結果以平均值±標準差(±s)表示，采用組間t檢驗，P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 可見光對hRPE 細胞的損傷

可見光能導致hRPE損傷[8]，損傷程度與光照強度呈劑量依賴性，并隨光照時間的延長而加重。乳酸脫氫酶(LDH)是細胞能量代謝中的重要酶，可以催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色[9]。受損的細胞將LDH釋放至培養(yǎng)液中，因此LDH可以客觀的衡量細胞的受損程度并評價細胞膜完整性。

本實驗考察光照度為500、2500、4000lx三個劑量時發(fā)現(xiàn)：1)光損傷與光照度的關系：500lx的光照度對細胞損傷較小，光照處理36h后正常培養(yǎng)24h，其存活率仍可達80%以上；中劑量光照度2500lx先表現(xiàn)較小的損傷性，隨著光照時間和正常培養(yǎng)時間的延長，細胞存活率有較大幅度的降低，從90%左右下降到70%左右；4000lx的光照度對hRPE損傷最大，光照處理12h后正常培養(yǎng)12h，其細胞存活率就小于80%；2)光損傷與光照時間的關系：當光照度一定時，隨著光照時間的延長，細胞存活率明顯下降，光照度越大表現(xiàn)越顯著；3)光損傷與正常培養(yǎng)時間的關系：在細胞光照后培養(yǎng)中，隨著培養(yǎng)時間的延長，500lx的細胞存活率變化不明顯，而4000lx變化顯著。由表2可見，與對照組LDH活力(164.8±1.9)U/g pro相比，幾乎所有光照處理的LDH釋放量都顯示差異極顯著(P＜0.01)，說明光照會嚴重損壞細胞的細胞膜，使細胞通透性增強，細胞受損。

表1 不同光照條件處理下細胞的存活率Table 1 Cell viability during treatments with various light intensities %

表2 不同光照條件處理下細胞LDH的釋放量Table 2 LDH activity of RPE treated by various light intensities(U/g pro)

細胞實驗中，一般把細胞損傷率為20%左右作為最佳模型標準，本實驗有3組數(shù)據(jù)與此接近，但是從實驗時間和操作性考慮，選擇光照度2500lx、光照24h、后培養(yǎng)24h作為光損傷模型的最佳條件。

2.2 篤斯越橘花色苷提取物對hRPE細胞光損傷的保護作用

2.2.1 細胞存活率變化

Matsumoto等[10]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，花色苷可以穿過血-腦水屏障和血-視網膜屏障被眼組織吸收，并以完整的形式存在。此外，花色苷可以進入內皮細胞發(fā)揮抗氧化作用，保護細胞和組織不被自由基氧化破壞[6]。本實驗表明(圖1)：BAE預防組(PH、PM、PL)和應激組(SH、SM、SL)對光損傷細胞有較強的保護作用，細胞的存活率與模型對照組(MC)有極顯著的差異(P＜0.01)；而BAE修復組(RH、RM、RL)與模型對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。尤其是預防組的低劑量(PL，0.1μg/mL)和應激組高劑量(SH，10μg/mL)的細胞存活率最顯著，與不受光損傷的正常對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，不僅保護細胞活力免受光損傷的影響，還促進細胞增殖。

圖1 篤斯越橘花色苷提取物對光損傷細胞存活率的影響Fig.1 Effect of BAE on light-damaged cells viability

2.2.2 VEGF含量的變化

圖2 篤斯越橘花色苷提取物對光損傷細胞分泌VEGF量的影響Fig.2 Effect of BAE on VEGF level secreted from light-damaged cells

VEGF是一種促進新生血管形成的生長因子，在RPE 細胞過量表達可導致毛細血管芽生長，眼組織中表現(xiàn)為脈絡膜新生血管(CNV)形成，損害視功能[11]。本實驗數(shù)據(jù)表明(圖2)：光照會引起hRPE細胞的VEGF的分泌量增加，模型組(MC)與正常組(NC)相比，差異極顯著(P＜0.01)；BAE預防組的中劑量組PM、應激組的中、低劑量組(SM、SL)和修復組的高、中劑量組(RH、RM)都能有效抑制hRPE過量表達VEGF，與模型組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；預防組的高、低劑量組與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)；而應激高劑量組SH和修復低劑量組RL與模型組相比差異不明顯(P＞0.05)。從整體上看，BAE所有干預組能有效抑制hRPE光損傷細胞VEFG的過量表達，而且應激組和修復組的作用比預防組顯著，這與上面保護細胞增殖能力的結果相反，說明細胞活力和調節(jié)細胞代謝因子之間沒有一定的相關性。

3 討論與結論

光損傷具有積累效應，損傷程度呈光照度和光照時間依賴性[9]，光照時間越長、細胞損傷越嚴重。本實驗結果表明，在較低光照度下，培養(yǎng)的hRPE細胞出現(xiàn)較輕的損傷，隨著光照度的增加，hRPE細胞凋亡顯著增加；而在同等光照度下，hRPE細胞的損傷表現(xiàn)為光照時間依賴性，并且在后期培養(yǎng)中損傷逐漸顯現(xiàn)，可能與自由基的產生有關[12]；500～4000lx的光照度作用于hRPE細胞一定時間后，都會使hRPE細胞乳酸脫氫酶釋放量增加，說明光照可使hRPE細胞的細胞膜受到損壞，細胞通透性增強，這也間接解釋了細胞在后期培養(yǎng)中逐漸出現(xiàn)損傷的緣由。

篤斯越橘花色苷對視網膜細胞光損傷有保護作用主要有以下3個原因：一是花色苷具有很強的除去自由基的能力，能夠清除光照所引起的脂質過氧化物、活性氧等[13]；二是花色苷能激活視網膜酶，活化和促進視紅素的再合成作用，從而改善人眼視覺的敏稅程度，加快黑暗環(huán)境適應能力[14]；三是對視網膜的血液微循環(huán)有很好的調節(jié)作用，加速物質代謝交換和增強對毛細血管的保護作用[15]。Milbury等[16]用越橘的提取物預處理RPE細胞4h后，再進行氧化損傷發(fā)現(xiàn)，其損傷程度明顯比對照組小。McAnulty等[17]的研究也表明，越橘提取物能清除自由基，避免發(fā)生氧化應激反應而破壞細胞因子的平衡，防止細胞受到損壞。本實驗的研究結果與上述兩位學者相一致，實驗設置BAE預防組、應激組和修復組，分別對光損傷的RPE細胞干預，發(fā)現(xiàn)預防組和應激組能有效防止細胞活力免受光損傷，并且促進細胞生長繁殖，而光照后的修復組不能達到保護作用；并且BAE能夠抑制光損傷導致的VEGF的過分泌，而VEGF的分泌量增加是脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)和滲透性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)的形成主要原因[18]，所以越橘花色苷對于這些眼科疾病有很好的預防作用。

本實驗選擇光照度2500lx，光照24h后培養(yǎng)24h作為模型的最佳條件，細胞損傷率達到20%。越橘花色苷可通過促進hRPE細胞增殖和VEGF的過表達，對光損傷的細胞實現(xiàn)保護作用，進而保護視力、預防眼疾。因此，在日常生活環(huán)境中，適當?shù)臏p少光照時間和光照強度，如控制用電腦的時間、外出遮陽、調節(jié)室內光線等，可以有效降低視網膜光損傷的發(fā)生率；食用越橘鮮果能夠降低光對視網膜的損傷，從而能對由光損傷引起的眼科疾病具有一定的預防作用。

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Protective Effect of Bilberry Anthocyanin Extract (BAE) against Photo-oxidative Damage of Human Retinal Pigment Epithelial Cells

SONG Xue，HAN Yong，JI Bao-ping*，LIU Yi-xiang，LYe-chun
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

TS255.1

A

1002-6630(2010)21-0324-05

2010-04-19

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD05A06-Z01)

宋雪(1985—)，女，碩士研究生，主要從事功能食品研究。E-mail：songxuesnow10-27@163.com

*通信作者：籍保平(1958—)，男，教授，碩士，主要從事功能食品研究。E-mail：jbp@cau.edu.cn