生姜蛋白酶的大分子結(jié)合修飾

劉恩岐，張建萍，賀菊萍，劉全德，高明俠

(徐州工程學院 江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 徐州 221008)

生姜蛋白酶的大分子結(jié)合修飾

劉恩岐，張建萍，賀菊萍，劉全德，高明俠

(徐州工程學院 江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 徐州 221008)

采用單甲氧基聚乙二醇(mPEG)和右旋糖苷對生姜蛋白酶進行大分子結(jié)合修飾。在酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL的硼酸緩沖液中，加入三聚氯氰活化的mPEG或高碘酸鈉活化的右旋糖苷，于40℃修飾反應1h，對修飾劑與酶蛋白的質(zhì)量比和pH值條件進行優(yōu)化：mPEG與酶的質(zhì)量比為17.5:1.0、pH9.0，mPEG修飾酶的修飾率為52.6%，相對酶活力(修飾酶活力/天然酶活力)為54.0%；右旋糖苷與酶的質(zhì)量比為42:1、pH6.0，右旋糖苷修飾酶的修飾率為51.6%，其相對酶活力為原天然酶的3.3倍。兩種修飾酶的熱穩(wěn)定性均比天然酶顯著增強，且右旋糖苷修飾酶的熱穩(wěn)定性明顯高于mPEG修飾酶。結(jié)果表明：右旋糖苷對生姜蛋白酶的修飾效果優(yōu)于聚乙二醇，適用于酶蛋白的化學修飾與新型酶制劑的開發(fā)利用。

生姜蛋白酶；單甲氧基聚乙二醇；右旋糖苷；化學修飾

Abstract：Zinger protease was modified separately with monomethoxypolyethylene glycol (mPEG) and dextran to promote its activity and stability. Dextran and mPEG were activated by sodium periodate and by cyanuric chloride, respectively. The activated mPEG and dextran were solely added into sodium tetraborate buffer solution with 2.0 mg/mL zinger protease and then the mixed solutions were incubated at 40 ℃ for 1 h. The optimal mass ratio between modifying agent and zinger protease, and reaction pH were measured. When the ratio between mPEG and zinger protease was 17.5:1.0 and pH was 9.0, the modification rate of zinger protease modified with mPEG was 52.6% and the relative enzyme activity (activity of modified enzyme/activity of natural enzyme) was 54.0%. The modification rate of zinger protease modified with dextran was 51.6% and the relative enzyme activity was 3.3 at the conditions of dextran/zinger protease ratio of 42:1 and pH 6. The thermal stability of both modified enzymes was higher than that of natural enzymes; meanwhile, the thermal stability of zinger protease modified with dextran was higher than that of zinger protease modified with mPEG. Therefore, dextran has a better modification effect on zinger protease than mPEG. Dextran is more suitable for the chemical modification of proteases and the development and utilization of novel enzymes.

Key words：zinger protease；monomethoxypolyethylene glycol；dextran；chemical modification

生姜中蛋白酶的含量與木瓜、菠蘿等熱帶水果資源相近，是一種有待開發(fā)利用的新的植物蛋白酶，但是由于其穩(wěn)定性差、失活快，限制了生姜蛋白酶在生產(chǎn)中的推廣應用[1]。大分子結(jié)合修飾是目前應用最廣的酶蛋白修飾方法之一，對提高酶活力、增強穩(wěn)定性具有顯著效果[2]。通常采用的大分子結(jié)合修飾劑有聚乙二醇和右旋糖苷等，聚乙二醇(PEG)是一種線性、無毒且不帶電的水溶性大分子[3]，分子末端有兩個能被活化的羥基，活化的PEG修飾劑主要和酶蛋白分子表面的殘留氨基相偶聯(lián)；右旋糖苷屬于菌多糖，是由D-葡萄糖通過α-1,6糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性，其糖鏈上的醛基經(jīng)活化后可以與酶分子上的殘留氨基相結(jié)合[4]。本研究在生姜蛋白酶分離純化的基礎上，采用單甲氧基聚乙二醇(mPEG)和右旋糖苷作為修飾劑，用活化的mPEG和右旋糖苷對生姜蛋白酶進行大分子結(jié)合修飾，研究修飾后的生姜蛋白酶的活性變化和熱穩(wěn)定性，為生姜蛋白酶的進一步研究利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜 市售；單甲氧基聚乙二醇(mPEG5000) Fluka公司；右旋糖苷(dextran40000) 和光純業(yè)工業(yè)株式會社；三聚氯氰(C3Cl3N3) Aldrich公司；高碘酸鈉 天津基準化學試劑有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸 (TNBS)Sigma公司；硼氫化鈉 國藥集團化學試劑有限公司；聚乙二醇(PEG20000) 遼寧奧克化學集團有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C精密pH計 上海世義精密儀器有限公司；THZ-82型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫(yī)療器械廠；HJ-3型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；LGJ-18A型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜蛋白酶的制備

將新鮮生姜洗凈、切丁，每1kg生姜加入4℃預冷的磷酸緩沖液2L，用高速組織搗碎機攪碎制成勻漿，離心棄渣取上清液。將離心姜液進行超濾處理，得到相對分子質(zhì)量大于10000、小于50000的生姜蛋白酶濃縮液。將生姜蛋白酶濃縮液與4℃預冷的丙酮按一定的比例混合，離心棄上清液，取沉淀自然風干，制得生姜蛋白酶粗粉[5]。將生姜蛋白酶粗粉用磷酸緩沖液溶解后，經(jīng)葡聚糖凝膠G-200和二乙氨基乙基纖維素DE52進行兩次柱層析純化，透析脫鹽后經(jīng)冷凍干燥得到生姜蛋白酶純品[6]。

1.3.2 生姜蛋白酶酶活力測定

生姜蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸，在堿性環(huán)境下，酪氨酸與福林試劑作用產(chǎn)生有色物質(zhì)，于波長660nm處進行光密度(OD)測定，光密度與酪氨酸的濃度成正比，用產(chǎn)生酪氨酸的量來表示生姜蛋白酶分解蛋白質(zhì)的能力。在40℃、pH6.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。具體測定方法參見SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》。

1.3.3 單甲氧基聚乙二醇對生姜蛋白酶的修飾

單甲氧基聚乙二醇(mPEG)的活化：采用三聚氯氰活化法[7-8]，三聚氯氰使用前用無水苯重結(jié)晶兩次。將1.0g三聚氯氰、10.0g mPEG5000、2.0g無水碳酸鈉溶于100mL的無水苯，加入5A的分子篩5g，常溫下攪拌反應，離心去除Na2CO3、5A分子篩等懸浮物，用200mL的乙醚沉淀，再用400mL的無水苯溶解沉淀。如此沉淀、溶解反復多次，去除沒有反應的三聚氯氰，直至在258nm波長處檢測無光吸收。冷凍干燥，得白色粉末，即為活化的mPEG。

活化mPEG化學修飾生姜蛋白酶的制備：在酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL的生姜蛋白酶硼酸緩沖液中，加入一定比例的活化mPEG修飾劑，于40℃水浴中保溫反應lh[9]，然后在磷酸緩沖液(0.lmol/L，pH7.0)中透析24h，用截留相對分子質(zhì)量為10000的超濾膜超濾，截留濃縮液，冷凍干燥即得mPEG修飾的生姜蛋白酶。通過酶修飾率和修飾酶的活力測定，探討活化mPEG的用量和pH值對修飾效果的影響。

1.3.4 右旋糖苷對生姜蛋白酶的修飾

右旋糖苷的活化：采用高碘酸鈉活化法[10-11]，取10.0g右旋糖苷溶于100.0mL蒸餾水，加入10.0mL質(zhì)量分數(shù)為12%的NaIO4溶液，在4℃冰箱反應18h、滴加質(zhì)量分數(shù)為5%的NaHSO3的溶液還原過量的NaIO4，室溫下以蒸餾水透析4h后，再以5L的Na3PO4(pH7.4、0.lmol/L)緩沖液透析16h，再用PEG20000包埋透析袋，反透析濃縮后，冷凍干燥即得活化的右旋糖苷。

活化右旋糖苷化學修飾生姜蛋白酶的制備：在酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL的生姜蛋白酶硼酸緩沖液中，加入一定比例的活化右旋糖苷修飾劑，于40℃水浴中保溫反應lh，添加NaBH4(50mg/mL)終止反應，再調(diào)pH值至7.0，對水透析4h，再用PEG20000反透析濃縮后，冷凍干燥即得修飾的生姜蛋白酶[12]。通過酶修飾率和修飾酶的活力測定，探討活化右旋糖苷的用量和pH值對修飾效果的影響。

1.3.5 酶修飾率的測定

采用TNBS法測定。酶蛋白表面的游離氨基與過量的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)反應，生成三硝基苯酚的衍生物，在335nm波長處有最大吸收峰，根據(jù)這一原理可以檢測出蛋白質(zhì)表面殘留的氨基。取1mL含1mg生姜蛋白酶的溶液，加入1mL質(zhì)量分數(shù)為4%、pH8.5的碳酸氫鈉溶液和1mL質(zhì)量分數(shù)為10%的十二烷基磺酸鈉溶液，20min后加入1mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)溶液，40℃保溫2h，加入1mol/L的鹽酸0.5mL終止反應。335nm波長處測定吸光度。同樣濃度的酶液在修飾反應后與反應前吸光度之比即為殘留氨基量[13-14]。

式中：A1為酶液修飾反應前吸光度；A2為酶液修飾反應后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 活化mPEG對生姜蛋白酶修飾條件的篩選

2.1.1 活化mPEG用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響

表1 mPEG用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響Table 1 Effect of mPEG amount on modification efficiency of zinger protease

在酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL、pH9.0硼酸緩沖液中，于40℃條件下修飾反應lh，活化mPEG用量對生姜蛋白酶的修飾率和相對酶活力(修飾酶活力/天然酶活力)的影響見表1。mPEG和酶的比例決定了氨基修飾率的大小，隨著活化mPEG加入量的增加，生姜蛋白酶的修飾率呈上升趨勢，酶活力呈下降趨勢。當mPEG與酶的質(zhì)量比為17.5:1.0時，酶修飾率為51.3%，酶活回收率(相對酶活力)為52.2%，再增加mPEG的量，修飾率不再增加，酶的活力也幾乎沒有變化，因此選擇mPEG與酶質(zhì)量比為17.5:1.0作為生姜蛋白酶化學修飾較佳的mPEG用量。

2.1.2 pH值對mPEG修飾生姜蛋白酶效果的影響

表2 pH值對mPEG修飾生姜蛋白酶效果的影響Table 2 Effect of pH on modification efficiency of zinger protease modified with mPEG

在1.0mL酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL的硼酸緩沖液中加入35mg活力化的mPEG，不同pH值條件對生姜蛋白酶的修飾率和相對酶活力的影響見表2。隨著pH值的增大，生姜蛋白酶的修飾率增大，相對酶活力也在增大，但是當pH值達到10.0時，酶修飾率與相對酶活力反而有所下降。說明酶分子對環(huán)境的pH值敏感，pH值能引起酶分子中可離解極性基團的離解狀態(tài)和電荷改變，不僅影響修飾效果，也改變了未修飾酶的構(gòu)型和構(gòu)象，從而影響了酶活性。在pH9.0時，酶修飾率和相對酶活力均較高，因此選擇pH9.0為最佳修飾pH值。

2.2 活化右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾條件的篩選

2.2.1 活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響

表3 右旋糖苷用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響Table 3 Effect of dextran amount on modification efficiency of zinger protease

在酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL、pH6.0硼酸緩沖液中，于40℃條件下修飾反應lh，活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶的修飾率和相對酶活力的影響見表3。隨右旋糖苷修飾劑用量的增加，修飾率和相對酶活力均呈上升趨勢，當右旋糖苷與酶質(zhì)量比為42:1時，生姜蛋白酶氨基修飾率為50.8%，相對酶活力為328%，再增加右旋糖苷的量，修飾率和酶的活力均有所降低，因此選擇右旋糖苷與酶質(zhì)量比為42:1作為生姜蛋白酶化學修飾較佳的右旋糖苷用量。

2.2.2 pH值對右旋糖苷修飾生姜蛋白酶效果的影響

表4 pH值對右旋糖苷修飾生姜蛋白酶效果的影響Table 4 Effect of pH on modification efficiency of zinger protease modified with dextran

在1.0mL酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL的硼酸緩沖液中加入84mg活化的右旋糖苷，不同pH值條件對生姜蛋白酶的修飾率和相對酶活力的影響見表4。在pH值中性至堿性的情況下，右旋糖苷對生姜蛋白酶的修飾率呈明顯降低的趨勢；在pH值偏酸性的條件下，修飾率和相對酶活力均較高；在pH6.0時，酶修飾率為52.3%，修飾酶活性是天然酶的3.3倍，因此選擇pH6.0為最佳修飾pH值。這一結(jié)果與伍志權(quán)等[13]用右旋糖苷修飾酵母蔗糖酶的研究結(jié)果相近。

2.3 mPEG和右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果的比較

表5 mPEG和右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果的比較Table 5 Comparison of modification efficiency of zinger protease using mPEG and dextran

在實驗確定的較佳修飾條件下，活化的mPEG和右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果的比較見表5。兩種修飾劑對生姜蛋白酶的修飾率接近，均在52%左右；mPEG修飾酶的殘留相對酶活力為54.0%，右旋糖苷修飾酶的活性是天然酶的3.3倍，所以右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果較好。

2.4 修飾酶與天然酶熱穩(wěn)定性的比較

將mPEG修飾酶、右旋糖苷修飾酶與天然酶分別在40、60℃和80℃條件下保溫10、30min和60min，然后測定不同熱處理時間的相對酶活力。生姜蛋白酶天然酶與兩種修飾酶熱穩(wěn)定性的比較結(jié)果見表6。

表6 修飾酶與天然酶熱穩(wěn)定性的比較Table 6 Comparison of thermal stability between natural enzyme and modified enzyme

隨著溫度的升高和加熱時間的延長，天然酶和修飾酶的酶活力都在不同幅度地下降。相同熱處理條件下，修飾酶的活力相對于天然酶活力下降比較緩慢，熱穩(wěn)定性均比天然酶高，右旋糖苷修飾酶又比mPEG修飾酶的相對酶活力下降慢、熱穩(wěn)定性高。在80℃條件下熱處理60min，天然酶、mPEG修飾酶和右旋糖苷修飾酶的相對酶活力分別為26.6%、43.2%和51.7%，右旋糖苷修飾酶的殘留相對酶活力是天然酶的1.9倍，是mPEG修飾酶的1.2倍，右旋糖苷修飾酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于mPEG修飾酶。

3 結(jié)論與討論

采用三聚氯氰活化的單甲氧基聚乙二醇和高碘酸鈉活化的右旋糖苷分別對生姜蛋白酶進行大分子結(jié)合修飾。結(jié)果表明，在修飾劑用量和修飾反應pH值較佳的條件下，mPEG和右旋糖苷對生姜蛋白酶的修飾率基本接近，右旋糖苷修飾酶的活性是原天然酶的3.3倍，而mPEG修飾酶的相對酶活力僅為原天然酶的54%；兩種修飾酶的熱穩(wěn)定性均比天然酶顯著增強，且右旋糖苷修飾酶的熱穩(wěn)定性明顯高于mPEG修飾酶。在本實驗優(yōu)化得出的修飾反應條件下，右旋糖苷對生姜蛋白酶的修飾效果優(yōu)于聚乙二醇，適合應用于提高酶活性和穩(wěn)定性的化學修飾與新型酶制劑的開發(fā)利用等領域。

在影響酶蛋白分子的化學修飾反應的條件中，pH值是最重要的一個條件，因為它決定了具有潛在反應能力的功能基團所處的可反應和不可反應的離解狀態(tài)。以三聚氯氰法活化的mPEG與酶蛋白反應的產(chǎn)物中，由于生成了HCl，根據(jù)化學平衡原理，要使氨基修飾反應繼續(xù)進行，就需要pH值在堿性條件下，以便中和反應過程中生成的HCl[15]，本實驗確定的mPEG與酶蛋白修飾反應的最佳pH值為9.0可能與此有關。由高碘酸鈉氧化右旋糖苷形成二醛基葡聚糖，右旋糖苷分子上的醛基與酶蛋白上的氨基共價結(jié)合得到修飾酶[13,15]，而醛基在堿性條件下會發(fā)生羥醛縮合反應，因此推斷本實驗中酶蛋白的修飾率在pH值堿性條件下明顯降低，右旋糖苷與酶蛋白修飾反應的最佳pH值為6.0，可能與右旋糖苷分子上的醛基在堿性條件下不穩(wěn)定有關。

根據(jù)張平平等[16]研究報道和本結(jié)果顯示，以酪蛋白為底物測定生姜蛋白酶活力，其最適作用pH值為6.0。本實驗確定右旋糖苷與酶蛋白修飾反應的最佳pH值為6.0，與天然酶的最適pH值完全一致。確定的mPEG與酶蛋白修飾反應的最佳pH9.0，修飾酶相對酶活為55.8%；而pH6.0時，修飾酶相對酶活力僅為30.7%。據(jù)此推斷，右旋糖苷修飾酶通過右旋糖苷分子上的醛基與酶蛋白上的氨基相結(jié)合，不影響生姜蛋白酶的最適作用pH值；mPEG修飾酶通過分子末端的兩個能被活化的羥基與酶蛋白上的氨基相結(jié)合，改變了生姜蛋白酶的最適作用pH值；右旋糖苷修飾酶相對酶活顯著提高，而mPEG修飾酶相對酶活明顯降低，可能與酶蛋白的最適作用pH值變化有關。為揭示pH值對化學結(jié)合修飾改變酶的構(gòu)型和構(gòu)象變化的影響機制，應進一步研究酶蛋白和修飾劑分子表面具有修飾反應能力的可離解極性基團在不同pH值條件下的離解和電荷狀態(tài)，以及修飾前后酶構(gòu)象和基本酶學性質(zhì)的變化，從而提高化學修飾的效果。

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Chemical Modification of Zinger Protease

LIU En-qi，ZHANG Jian-ping，HE Ju-ping，LIU Quan-de，GAO Ming-xia
(Jiangsu Engineering Research Center for Food Biology Processing, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

TS253.9

A

1002-6630(2010)21-0320-04

2010-06-29

江蘇省高校自然科學研究計劃項目(08KJD550001)

劉恩岐(1964—)，男，教授，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：ty-leq@163.com