幾種天然食用成分對(duì)副溶血性弧菌抑菌作用研究

吳偉華，劉承初,*，沈曉盛，趙 勇，李應(yīng)森，李家樂,4

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；4. 上海市高校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)E-研究院，上海 201306 )

幾種天然食用成分對(duì)副溶血性弧菌抑菌作用研究

吳偉華1，劉承初1,*，沈曉盛2，趙 勇1，李應(yīng)森3，李家樂3,4

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；4. 上海市高校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)E-研究院，上海 201306 )

副溶血性弧菌是引起我國特別是沿海地區(qū)細(xì)菌性食物中毒危害的首要食源性致病菌。本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究醋酸、酒精與茶多酚3種天然食用成分對(duì)菌懸液中副溶血性弧菌存活率的影響。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)體積分?jǐn)?shù)高于50%酒精或質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的茶多酚處理5min能完全殺滅菌懸液中的副溶血性弧菌；經(jīng)pH2的醋酸溶液處理也能使菌懸液中副溶血性弧菌降低4.79lg(CFU/mL)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：酒精體積分?jǐn)?shù)、茶多酚質(zhì)量濃度和酸度對(duì)副溶血性弧菌的抑制效果具有明顯的協(xié)同作用；pH2.8、酒精體積分?jǐn)?shù)20%及茶多酚質(zhì)量濃度0.125mg/mL或pH2.4、酒精體積分?jǐn)?shù)12%及茶多酚質(zhì)量濃度0.125mg/mL的混合體系均能有效抑制副溶血性弧菌的生長。這些研究結(jié)果說明食用酒精、醋酸和茶葉提取物的適當(dāng)配合將有可能作為復(fù)合殺菌劑用于水產(chǎn)食品中，從而降低副溶血性弧菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。

副溶血性弧菌；酒精；醋酸；茶多酚；正交試驗(yàn)

Abstract：Vibrio parahaemolyticusis the most prevalent foodborne pathogen in China, especially in the coastal cities. In this work, the effects of three natural edible components including acetic acid, alcohol and tea polyphenol on the survival rate ofVibrio parahaemolyticusin cultural broth were explored through single factor and orthogonal array experiments.Vibrio parahaemolyticuswas completely inactivated after treatment with 50% alcohol or 0.5 mg/mL tea polyphenol solution for 5 min on the basis of single factor experiments. In addition, bacterial population was reduced by 4.79 lg(CFU/mL) whenVibrio parahaemolyticuscells were treated with acetic acid solution (pH 2) for 0.5 min. The orthogonal array optimization showed that the combined treatment of alcohol, organic acid and tea polyphenol could result in a synergistic inhibitory effect onVibrio parahaemolyticus.Vibrio parahaemolyticuscould be effectively inhibited after treatment with acetic acid solution (pH 2.8)containing 20% alcohol and 0.125 mg/mL tea polyphenol, or acetic acid solution (pH 2.4) containing 12% alcohol and 0.125 mg/mL teapolyphenol. These results suggest that the combined use of alcohol, organic acid and tea polyphenol can offer a compound antibacterial agent for reducing the risk ofVibrio parahaemolyticusinfection during seafood consumption.

Key words：Vibrio parahaemolyticus；alcohol；acetic acid；tea polyphenol；orthogonal design

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，是我國特別是沿海城市引起食源性疾病的首要致病菌之一[1]。該菌對(duì)熱敏感，加熱到80℃后1min就可將其徹底殺死[2]，一般的烹調(diào)方法可起到殺滅作用。然而一些水產(chǎn)品常用于生食，高溫處理往往會(huì)失去其特有的風(fēng)味。不經(jīng)熱處理直接生食將大大增加引發(fā)食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)性，資料顯示2000－2007年上海市由副溶血性弧菌致集體性食物中毒事件起數(shù)和涉及患者人數(shù)分別占同期食物中毒事件起數(shù)和患者人數(shù)的57.4%和56.0%，其食物來源多為水產(chǎn)品[3]。因此研究非加熱方式對(duì)副溶血性弧菌的抑制條件是控制生食海鮮引起食物中毒的關(guān)鍵。

文獻(xiàn)顯示，酒精飲料、食醋及茶飲料對(duì)食源性致病菌如大腸桿菌O157:H7型(Escherichia coliO157:H7)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及腸道致病菌等均具有明顯抑菌效果[4-9]。但對(duì)副溶血性弧菌這一海產(chǎn)食品頭號(hào)食源性致病菌的抑菌效果研究甚少見報(bào)道，且對(duì)致病菌抑菌活性均采用單因素試驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)在上述文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，分別通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究酒精、茶多酚和醋酸3種天然食用成分對(duì)副溶血性弧菌的響應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)所選用的幾種天然成分均可作為食用調(diào)料用于生食海鮮，如醉蝦、醉蟹等，主要研究它們對(duì)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的協(xié)同抑制效果，目的是為開發(fā)安全可靠的生食海鮮抑菌調(diào)味伴侶提供參考，將由海產(chǎn)食品引發(fā)的食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)降到最低。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩株標(biāo)準(zhǔn)菌Vibrio parahaemolyticusATCC33846和Vibrio parahaemolyticusATCC33847由中國科學(xué)院微生物研究所菌種中心提供，這兩株菌均能產(chǎn)生溶血毒素，是致病性菌株。

茶多酚(茶多酚含量80%，紅褐色粉末) 上海諾德生物實(shí)業(yè)有限公司；無水乙醇(分析純)、冰醋酸(分析純)、緩沖蛋白胨水、硫檸膽蔗瓊脂、營養(yǎng)瓊脂 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 菌懸液制備

將實(shí)驗(yàn)菌株分別接種于緩沖蛋白胨水中，在37℃靜置培養(yǎng)24h進(jìn)行菌種的活化。之后轉(zhuǎn)接在硫檸膽蔗瓊脂培養(yǎng)基上于37℃靜置培養(yǎng)24h。能在該培養(yǎng)基上形成綠色圓形菌落的為副溶血性弧菌，挑取生長旺盛的菌落再次接種于緩沖蛋白胨水中培養(yǎng)16～18h，重復(fù)傳代3次，收集菌懸液合并，8000r/min離心，棄去上清液，加入10mL滅菌磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2)，振蕩搖勻，待用。菌懸液中副溶血性弧菌的數(shù)量采用GB/T 4789.2—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》法計(jì)數(shù)[10]。

1.3 酒精處理

用無菌生理鹽水配制酒精體積分?jǐn)?shù)為0、5%、10%、20%、30%、40%、50%的溶液。各取9mL上述溶液加入無菌試管中，向其中加入1mL副溶血性弧菌菌懸液，充分混勻，處理5min后，使用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.4 醋酸處理

用無菌生理鹽水配制pH值分別為6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0的醋酸溶液。各取9mL上述溶液加入無菌試管中，向其中加入1mL副溶血性弧菌菌懸液，充分混勻，處理5min后，使用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.5 茶多酚處理

用無菌生理鹽水配制茶多酚質(zhì)量濃度為0、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1mg/mL的溶液。各取9mL上述溶液加入無菌試管中，向其中加入1mL副溶血性弧菌菌懸液，充分混勻，處理5min后，使用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.6 抑菌正交試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)得到的3組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)三因素四水平正交試驗(yàn)。選用L16(44)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，因素水平如表1，用無菌生理鹽水配制4種體積分?jǐn)?shù)酒精，再滴加冰醋酸調(diào)節(jié)體系pH值，最后加入茶多酚粉末并溶解，保證體系中各物質(zhì)濃度、pH值與設(shè)定的因素水平一致。各體系抑菌方法與單因素試驗(yàn)操作類同。

表1 抑菌正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體積分?jǐn)?shù)酒精對(duì)副溶血性弧菌的影響

圖1 不同酒精體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌懸液中副溶血性弧菌作用效果Fig.1 Inhibitory effect of alcohol concentration onV. parahaemolyticus

從圖1可以看出，酒精體積分?jǐn)?shù)低于20%時(shí)，幾乎無抑菌效果；當(dāng)體積分?jǐn)?shù)在30%～40%時(shí)能降低3lg(CFU/mL)～4lg(CFU/mL)副溶血性弧菌；酒精體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，能使7.42 lg(CFU/mL)的副溶血性弧菌在營養(yǎng)瓊脂平板上無菌落生長。說明此體積分?jǐn)?shù)對(duì)該菌具有明顯的殺菌效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明較低體積分?jǐn)?shù)的酒精(10%～30%)對(duì)副溶血性弧菌的抑制效果并不顯著。若僅使用酒精進(jìn)行抑菌，其體積分?jǐn)?shù)需高達(dá)50%時(shí)才能對(duì)菌懸液中的副溶血性弧菌有良好的殺菌效果。

2.2 不同酸度對(duì)副溶血性弧菌的影響

圖2 不同酸度對(duì)菌懸液中副溶血性弧菌作用效果Fig.2 Inhibitory effect of acid concentration onV. parahaemolyticus

從圖2可以看出，當(dāng)pH值高于3時(shí)，幾乎無抑菌效果；當(dāng)溶液pH值低于3時(shí)，可使副溶血性弧菌含量降低4lg(CFU/mL)以上，說明達(dá)到一定濃度的醋酸對(duì)副溶血性弧菌有明顯的抑制效果。而日常生活中使用的食醋(pH2.4)和果汁等酸性飲料大都能達(dá)到這一酸度，因此使用它們能在一定程度上降低副溶血性弧菌引起的食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 不同質(zhì)量濃度茶多酚對(duì)副溶血性弧菌的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度茶多酚對(duì)菌懸液中副溶血性弧菌作用效果Fig.3 Inhibitory effect of tea polyphenol onV. parahaemolyticus

從圖3可以看出，當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度在0～0.10mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，茶多酚的抑菌效果不明顯；在茶多酚質(zhì)量濃度＞0.25mg/mL時(shí)，抑菌效果增強(qiáng)；當(dāng)質(zhì)量濃度＞0.50mg/mL時(shí)，副溶血性弧菌基本全部被殺滅。說明茶多酚對(duì)副溶血性弧菌具有顯著的抑制作用，因此飲茶同樣有利于降低副溶血性弧菌引起的食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 三因素正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表2 抑菌正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

由表2極值R可知，主要影響因素為酒精體積分?jǐn)?shù)和酸度，其次為茶多酚質(zhì)量濃度。當(dāng)3個(gè)因素的組合為A3B3C4、A3B4C3和A4B4C4時(shí)，能將菌懸液中高達(dá)8lg(CFU/mL)的副溶血性弧菌完全殺滅。但實(shí)際上食品原料與產(chǎn)品中的副溶血性弧菌含量可能達(dá)不到8lg(CFU/mL)，一般為105CFU/mL左右。故在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，減菌量達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí)就足夠了。從表2還可知，組合A3B2C1、A4B2C2、A4B1C1均能使菌懸液中的副溶血性弧菌量降低5個(gè)數(shù)量級(jí)以上，其中以A3B2C1和A4B1C1為佳，即pH2.8、20%酒精、0.125mg/mL茶多酚；pH2.4、12%酒精、0.125mg/mL茶多酚，便能有效抑制副溶血性弧菌的生長，且各抑菌成分濃度較低，有良好的協(xié)同效應(yīng)。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，并對(duì)各因素進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。通過方差分析及方差齊性檢驗(yàn)可知，酸度、酒精體積分?jǐn)?shù)與茶多酚質(zhì)量濃度對(duì)副溶血性弧菌的抑菌效果均為極顯著(F0.05＜F＜F0.01)。

表3 抑菌正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis for residual viable count ofV. parahaemolyticus

3 討 論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，醋酸、酒精和茶多酚對(duì)副溶血性弧菌均具有明顯的殺滅作用。而這些天然抑菌成分均是食醋、酒類和茶飲料的主要成分，因此食醋、喝酒及飲茶均有降低副溶血性弧菌引起的食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)的效果。有研究表明，多種葡萄酒能將菌懸液中的副溶血性弧菌從107CFU/mL降低至少6個(gè)數(shù)量級(jí)至未檢出水平[11]；食醋和檸檬酸對(duì)副溶血性弧菌有較強(qiáng)的殺滅效果，且效果具有持續(xù)性[12-13]；普通綠茶、烏龍茶、普洱茶和紅茶的初次水浸液對(duì)副溶血性弧菌有較好的抑制作用[14]。這些結(jié)果同時(shí)也表明醋酸、酒精與茶多酚是對(duì)副溶血性弧菌有效的天然抑菌成分。

然而，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，這3種抑菌物質(zhì)的抑制效果與其濃度密切相關(guān)。而日常食用時(shí)往往需要稀釋，這會(huì)直接影響到抑菌效果，單純地依靠其中任何一種均無法達(dá)到足夠的抑菌效果[15-16]。同時(shí)，有研究指出酒的抑菌效果要優(yōu)于與其度數(shù)相同濃度的酒精[11]。而將酒中揮發(fā)性物質(zhì)(主要為酒精)除去后剩下的難揮發(fā)性物質(zhì)(主要為有機(jī)酸類)仍有較好的抑菌效果[17]。Sheth等[5]研究也表明含有蘋果酸、酒石酸等有機(jī)酸的低度酒(pH 3.5，酒精體積分?jǐn)?shù)10%)可以使得副溶血性弧菌含量下降3～6個(gè)數(shù)量級(jí)。這說明將幾種有抑菌效果的食用成分復(fù)合使用，可以增強(qiáng)抑菌效果，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，它們之間的協(xié)同抑菌效果是很明顯的，能在降低各組分實(shí)際濃度的同時(shí)保持較好的抑菌效果。

以上研究結(jié)果說明食用酒、醋和茶葉提取物的適當(dāng)配合將有可能作為復(fù)合殺菌劑用于水產(chǎn)食品中，特別地將它們應(yīng)用于醉蝦、醉蟹類生食海鮮既可作為抑菌劑提高食用安全性，同時(shí)又可作為調(diào)味劑改善其風(fēng)味。

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Inhibitory Effects of Natural Edible Components onVibrio parahaemolyticus

WU Wei-hua1，LIU Cheng-chu1,*，SHEN Xiao-sheng2，ZHAO Yong1，LI Ying-sen3，LI Jia-le3,4
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China；3. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China；4. Aquaculture Division, E-Institute of Shanghai Universities, Shanghai 201306, China)

R187. 2

A

1002-6630(2010)21-0289-04

2010-06-30

上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目；上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(09ZZ166)；上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)

吳偉華(1985—)，男，碩士研究生，主要從事營養(yǎng)與食品安全研究。E-mail：wuweihua0@yahoo.cn

*通信作者：劉承初(1965—)，女，教授，博士，主要從事海洋生物資源利用、營養(yǎng)與食品安全研究。E-mail：ccliu@shou.edu.cn