庫(kù)爾勒梨多酚氧化酶的酶學(xué)特性

朱路英，吳偉偉,2，孫 杰，都婷婷

(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001)

庫(kù)爾勒梨多酚氧化酶的酶學(xué)特性

朱路英1，吳偉偉1,2，孫 杰1，都婷婷1

(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001)

以鄰苯二酚為底物，采用分光光度法對(duì)庫(kù)爾勒梨多酚氧化酶(PPO)的酶學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：庫(kù)爾勒梨PPO的最適pH值為5.7，最適溫度為42℃；短時(shí)間高溫能顯著抑制PPO酶活力；PPO催化的酶促褐變反應(yīng)符合米氏動(dòng)力學(xué)方程，該酶促反應(yīng)的最大速率為169.49U/min，Km值為0.152mol/L；與檸檬酸、NaCl和EDTA-2Na相比，抗壞血酸對(duì)庫(kù)爾勒梨PPO的抑制效果較好。

庫(kù)爾勒梨；多酚氧化酶；酶學(xué)特性；抑制效應(yīng)

Abstract：Enzymological characterization of the polyphenol oxidase (PPO) from Kuerle pear towards catechol as a substrate was conducted using spectrophotometry method. The results showed that the optimal pH and temperature for this enzyme was 5.7 and 42 ℃. High temperature treatment could inhibit PPO activity. The kinetics of PPO reaction was in accord with the Michaelis-Menten equation, withKm andVmax values of 0.152 mol/L and 169.49 U/min, respectively. Ascorbic acid exhibited stronger inhibition effect on PPO activity than citric acid, NaCl and EDTA-2Na.

Key words：Kuerle pear；polyphenol oxidase；enzymatic properties；inhibition effect

庫(kù)爾勒梨(Pyrus pyrifoliaL.)主產(chǎn)于新疆庫(kù)爾勒市，是我國(guó)北方優(yōu)良的梨品種之一。該品種果實(shí)大小適中，果肉白色，汁多細(xì)嫩，口感極佳。由于品質(zhì)較優(yōu)，是目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)最受歡迎的梨品種之一。然而，在庫(kù)爾勒香梨的加工過(guò)程中，容易遭受酶促褐變的困擾，褐變后不僅影響外觀品質(zhì)，而且使其失去食用價(jià)值。因此，褐變是目前梨果類(lèi)深加工過(guò)程中最待解決的一個(gè)問(wèn)題。

研究表明，果蔬酶促褐變是由果蔬內(nèi)多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)與多酚類(lèi)物質(zhì)接觸，催化酚類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成醌，而醌又進(jìn)一步聚合成黑色素所致[1]。因此，多酚氧化酶活力是決定果蔬組織褐變程度的重要因素之一，對(duì)多酚氧化酶特性的研究就成了解決褐變問(wèn)題的重點(diǎn)所在。多酚氧化酶是一類(lèi)含銅酶，廣泛存在于水果蔬菜中。目前，已有多篇關(guān)于果蔬多酚氧化酶的報(bào)道[2-9]，但對(duì)于庫(kù)爾勒梨中多酚氧化酶的特性尚未見(jiàn)有關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)庫(kù)爾勒梨中多酚氧化酶的特性進(jìn)行研究，以期為庫(kù)爾勒梨加工過(guò)程中的酶促褐變控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

庫(kù)爾勒香梨：產(chǎn)地為新疆庫(kù)爾勒地區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 酶液制備

取新鮮庫(kù)爾勒梨果肉20g，加入20mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)，冰浴研磨后，4℃、10000r/min離心10min，上清液即為多酚氧化酶的粗酶液，置冰浴中備用。

1.2.2 PPO活力的測(cè)定

向試管中加入5mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)，1mL 1mol/L的鄰苯二酚溶液，25℃預(yù)熱5min后加入0.5mL PPO酶液，混勻后立即轉(zhuǎn)入1cm比色皿中，于420nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。每隔30s記錄一次，連續(xù)記錄5min，依據(jù)曲線最初的直線部分計(jì)算酶活力。規(guī)定在1min內(nèi)使吸光度增加0.001為1個(gè)酶活力單位U。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取其平均值。

1.2.3 PPO最適pH值的測(cè)定

配制pH2.2～8.0的0.1mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，酶反應(yīng)液組成和酶活力測(cè)定條件同1.2.2節(jié)，測(cè)定PPO的最適pH值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取其平均值。

1.2.4 PPO最適反應(yīng)溫度和對(duì)溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

將1mL 1mol/L的鄰苯二酚溶液、5mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)和0.5mL酶液混合液在不同溫度(20～80℃)水浴中分別保溫10min，然后在冰浴中迅速冷卻至室溫(20℃)，在420nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

PPO對(duì)熱穩(wěn)定性測(cè)定：先將0.5mL酶液與5mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)混合，分別在不同溫度(70～90℃)水浴中保溫2、4、6、8、10min，當(dāng)混合液溫度達(dá)到室溫時(shí)，加入1mL 1mol/L的鄰苯二酚溶液，按照1.2.2節(jié)的方法測(cè)定殘余的酶活力。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取其平均值。

1.2.5 底物濃度對(duì)PPO活力的影響

用pH6.0的0.1mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制不同濃度(10～100mmol/L)的鄰苯二酚溶液。向6mL鄰苯二酚溶液中加入0.5mL酶液，混勻后立即在420nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度變化，計(jì)算酶活力。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取其平均值。

1.2.6 抑制劑對(duì)PPO活力的影響

將1mL 1mol/L的鄰苯二酚溶液、5mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)分別和0.5mL不同濃度的檸檬酸、氯化鈉、EDTA-2Na和抗壞血酸溶液混合均勻，立即加入0.5mL酶液，在420nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度變化，計(jì)算酶活力。酶活力大小以相對(duì)未用抑制劑處理時(shí)的酶活力來(lái)表示。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)PPO活力的影響

圖1 pH值對(duì)庫(kù)爾靳梨PPO活力的影響Fig.1 Effect of pH on the activity of PPO from Kuerle pear

從圖1A可以看出，pH值對(duì)PPO活力的影響較大。當(dāng)pH值從2.2增加到3.0時(shí)，PPO活力劇烈上升，酶活力幾乎為原來(lái)的4倍；隨著pH值從3.0增加到6.0，酶活力先有一個(gè)稍微下降而后又緩慢上升，在pH6.0時(shí)達(dá)到最大；隨后，隨著pH值從6.0增加到8.0時(shí)，酶活力呈直線下降，當(dāng)pH8.0時(shí)，酶活力僅為pH6.0時(shí)的41.25%。為了進(jìn)一步確定庫(kù)爾勒梨PPO的最適pH值，在圖1數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上配制pH4.5～7.2的緩沖液，測(cè)定該P(yáng)PO在不同的pH值條件下的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖1B?？梢钥闯觯揚(yáng)PO的最適pH值為5.7。

2.2 溫度對(duì)PPO活力的影響

圖2 溫度對(duì)庫(kù)爾勒梨PPO活力的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of PPO from Kuerle pear

由圖2可知，庫(kù)爾勒梨PPO反應(yīng)的最適溫度為42℃。在20～40℃范圍內(nèi)，酶活力隨著溫度的升高而逐漸增強(qiáng)；但當(dāng)溫度繼續(xù)上升到50℃以上時(shí)，酶活力開(kāi)始迅速下降；當(dāng)溫度升高到80℃時(shí)，PPO基本失活，活力只有40℃時(shí)的15.71%。

圖3 熱處理對(duì)庫(kù)爾勒梨PPO活力的影響Fig.3 Effect of heat treatment on the activity of PPO from Kuerle pear

由圖3可知，庫(kù)爾勒梨PPO具有一定的熱穩(wěn)定性。隨著溫度的提高，完全抑制PPO酶活力所需要的時(shí)間逐漸減少。在70～75℃熱處理10min，PPO殘留相對(duì)酶活力為24.81%～35.79%；當(dāng)溫度高于80℃時(shí)，PPO活力損失較大，80℃處理10min，PPO殘留相對(duì)酶活力為13.54%；85℃條件下保溫6min，PPO殘留相對(duì)酶活力為12.57%；在90℃保溫4min，PPO殘留相對(duì)酶活力僅為9.14%，PPO絕大部分失去活力。

2.3 底物濃度對(duì)PPO活力的影響

圖4 底物濃度對(duì)庫(kù)爾勒梨PPO活力的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the activity of PPO from Kuerle pear

酶催化反應(yīng)過(guò)程中，反應(yīng)速度與底物濃度之間關(guān)系可用米氏方程來(lái)描述：v=Vmax·[S]/(Km+[S])，將此方程轉(zhuǎn)換成倒數(shù)形式，即：1/v=Km/(Vmax·[S])+1/Vmax，然后以1/V對(duì)1/[S]作圖，得一直線，如圖4所示，該直線方程為y=0.0009x+0.0059，R2=0.9965，Km＝0.152mol/L，Vmax＝169.49U/min，說(shuō)明底物濃度與PPO活力的關(guān)系遵循米氏方程的酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

2.4 抑制劑對(duì)PPO活力的影響

由圖5、6可知，不同的抑制劑對(duì)庫(kù)爾勒梨多酚氧化酶活力都有不同程度的抑制作用，并且抑制作用隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。其中檸檬酸、NaCl和EDTA-2Na對(duì)PPO酶活力的抑制效果相對(duì)較差，當(dāng)質(zhì)量濃度均為0.8g/100mL時(shí)，3種抑制劑的抑制率分別為61%、70.5%和65%，這就限制了其在庫(kù)爾勒梨加工處理中的應(yīng)用。而抗壞血酸對(duì)PPO酶活力有較好的抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.06g/100mL時(shí)，基本上能完全抑制PPO活力，達(dá)到了防止褐變的效果。

圖5 不同抑制劑對(duì)庫(kù)爾勒梨PPO活力的影響Fig.5 Effect of different inhibitors on the activity of PPO from Kuerle pear

圖6 抗壞血酸對(duì)庫(kù)爾勒梨PPO活力的影響Fig.6 Effect of ascorbic acid on the activity of PPO from Kuerle pear

3 結(jié)論與討論

研究表明，不同材料中的PPO最適pH值不同，一般在4.5～7.4之間[9]。本研究測(cè)定的庫(kù)爾勒梨多酚氧化酶的最適pH值為5.7，與陳艷樂(lè)等[10]報(bào)道的薯蕷PPO最適pH5.8～6.0的結(jié)果較相近。徐芹等[11]報(bào)道的碭山酥梨PPO最適pH值為4.5，段玉權(quán)等[2]研究認(rèn)為中華壽桃PPO最適pH值為6.5，李桂琴等[12]研究雪梨PPO的最適pH值為6.4，這說(shuō)明不同物種PPO的最適pH值有所不同。另外，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在pH值為3.0時(shí)PPO酶活力也有一個(gè)較強(qiáng)峰，可能是庫(kù)爾勒梨中含有PPO同工酶所致，這在碭山酥梨[11]、紫甘薯[13]中有過(guò)類(lèi)似的報(bào)道。

庫(kù)爾勒梨多酚氧化酶的最適溫度為42℃，與已報(bào)道的蘋(píng)果梨、桑葉的最適溫度40℃比較接近[5,14]；而張盛林等[15]報(bào)道花魔芋的最適反應(yīng)溫度為30℃，徐芹等[11]研究的碭山酥梨PPO最適溫度為34℃，段玉權(quán)等[2]研究認(rèn)為中華壽桃PPO最適溫度為60℃。由此可見(jiàn)，不同品種果實(shí)的PPO的最適反應(yīng)溫度存在一定差異。

高溫處理對(duì)庫(kù)爾勒梨PPO酶活力有顯著影響。高溫下酶容易變性而活力降低，因此高溫短時(shí)間處理能顯著抑制PPO活力。本實(shí)驗(yàn)中，在70～80℃條件處理10min，PPO的殘留酶活力為未處理時(shí)的13.54%～35.79%；在90℃處理4min，PPO的殘留相對(duì)酶活力僅為9.14%，90℃處理6min后，PPO酶活力已基本喪失。因此，在庫(kù)爾勒梨的深加工過(guò)程中，可采用高溫瞬時(shí)滅酶法抑制酶促褐變。

米氏常數(shù)(Km)是酶的一個(gè)基本特征常數(shù)，反映了酶與底物結(jié)合及解離的性質(zhì)，Km越小說(shuō)明底物與酶結(jié)合的親和力越強(qiáng)。PPO酶促褐變反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程所描述的單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，以鄰苯二酚為底物的最大反應(yīng)速度Vmax＝169.49U/min，Km＝0.152mol/L。

檸檬酸、NaCl、EDTA-2Na和抗壞血酸均能抑制庫(kù)爾勒梨PPO酶活力，但相比較而言，抗壞血酸對(duì)PPO酶活力的抑制效果最好，在質(zhì)量濃度為0.06g/100mL時(shí)，基本上能達(dá)到防止褐變的效果。不同抑制劑抑制褐變的機(jī)理各不相同，且抑制效果隨抑制劑濃度的不同而不同。抗壞血酸是一種天然抗氧化劑，可將氧化的醌類(lèi)及其衍生物還原成酚類(lèi)物質(zhì)，從而阻止醌類(lèi)物質(zhì)進(jìn)一步聚合形成黑色素類(lèi)物質(zhì)而引起褐變。但抗壞血酸添加量不能過(guò)大，否則易引起非酶褐變，影響產(chǎn)品外觀品質(zhì)[16]。目前普遍認(rèn)為幾種不同抑制劑的協(xié)同作用的抑制效果要優(yōu)于單一抑制劑的抑制作用，因此，還需要在單一抑制劑的研究基礎(chǔ)上，對(duì)幾種不同抑制劑的協(xié)同抑制效果進(jìn)行研究，為防止庫(kù)爾勒梨酶促褐變提供更詳細(xì)的數(shù)據(jù)支持。

總之，本實(shí)驗(yàn)以庫(kù)爾勒梨為材料，研究了其多酚氧化酶的酶學(xué)特性及抑制劑。結(jié)果表明，庫(kù)爾勒梨PPO的最適pH值為5.7，最適溫度為42℃；短時(shí)間高溫能顯著抑制PPO酶活力，90℃處理6min，PPO活力已基本喪失；PPO催化的酶促褐變反應(yīng)符合米氏動(dòng)力學(xué)方程，該酶促反應(yīng)的最大速率為169.49U/min，Km值為0.152mol/L；檸檬酸、NaCl、EDTA-2Na和抗壞血酸均能抑制庫(kù)爾勒梨PPO酶活力，其中，抗壞血酸對(duì)庫(kù)爾勒梨PPO的抑制效果較好。

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Enzymatic Properties of Polyphenol Oxidase from Kuerle Pear

ZHU Lu-ying1，WU Wei-wei1,2，SUN Jie1，DU Ting-ting1
(1. College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China；2. College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

Q554.1

A

1002-6630(2010)21-0275-04

2010-03-13

魯東大學(xué)?；痦?xiàng)目(LY20063307)；魯東大學(xué)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目

朱路英(1974—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)。E-mail：lyzhu@126.com