前體對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響

鄒 祥，郭 霞,， 孫 敏

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

前體對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響

鄒 祥1，郭 霞1,2， 孫 敏2

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

考察不同類型前體對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響，在全合成培養(yǎng)基中添加乳糖前體有利于桑黃菌絲的生長(zhǎng)和胞外多糖的合成。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得乳糖補(bǔ)加條件：發(fā)酵初始補(bǔ)加30g/L乳糖，3L發(fā)酵罐發(fā)酵168h驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)獲得的桑黃菌絲量最高可達(dá)13.18g/L，胞外多糖產(chǎn)量最高可達(dá)1.21g/L，比對(duì)照組提高了25%。而植物油類前體篩選發(fā)現(xiàn)菜籽油能明顯促進(jìn)桑黃菌絲的生長(zhǎng)，7L發(fā)酵罐中發(fā)酵144h桑黃菌絲量最高可達(dá)23.77g/L，比對(duì)照組提高了207.1%，但抑制胞外多糖的合成。

前體；桑黃；菌絲生長(zhǎng)；胞外多糖

Abstract：To promote mycelium growth and polysaccharide biosynthesis inPhellinus igniarius, different groups (sugar and plant oil) of precursors were added to synthetic complete medium and the effects of the kind and amount of separately added sugars and plant oils onPhellinus igniariusmycelium growth and polysaccharide biosynthesis were dealt with. A two-factor, threelevel full combination design was used to optimize the conditions for lactose supplement, and the results showed that a maximum mycelium biomass of up to 13.18 g/L and a maximum polysaccharide production of up to 1.21 g/L were achieved after 168 h fermentation in a 3 L fermentor with an initial lactose concentration of 30 g/L, and the increment percent of polysaccharide production was 25% in comparison with the control. Among oils from three plants, including soybean, olive and rapeseed,rapeseed oil most obviously promoted the growth ofPhellinus igniariusmycelia, and the maximum mycelium biomass was up to 23.77 g/L after fermentation for 144 h in a 7 L fermentor, 207.1% higher than that obtained from the control, while polysaccharide biosynthesis was inhibited by adding rapeseed oil.

Key words：precursors；Phellinus igniarius；mycelia growth；polysaccharide

桑黃(Phellinus igniarius)學(xué)名為火木針層孔菌，是一種珍稀的藥用真菌。桑黃具有多種藥理活性，其中活性成分桑黃多糖具有較強(qiáng)的抗癌[1]、抗氧化[2]及降血脂[3]等功效，并且無(wú)毒副作用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于桑黃野生子實(shí)體稀少，人工栽培還處于起步階段，采用液體培養(yǎng)獲得具有藥理活性的菌絲體和胞外多糖，周期短，便于工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣泛的市場(chǎng)前景。

發(fā)酵法生產(chǎn)桑黃菌絲體及多糖已有相關(guān)的報(bào)道，主要集中在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、工藝條件、分離純化等[4-6]方面，而且優(yōu)化的培養(yǎng)基多以復(fù)合的碳、氮源為主、成分復(fù)雜，對(duì)多糖的測(cè)定和代謝調(diào)控的研究帶來(lái)困難。針對(duì)此問(wèn)題，本課題組開(kāi)展了桑黃發(fā)酵全合成培養(yǎng)基篩選與優(yōu)化的研究，篩選得到成分清晰，多糖測(cè)定簡(jiǎn)便的培養(yǎng)基[4]。同時(shí)由于真菌多糖為不同糖單元組成的多聚糖大分子，多糖分子結(jié)構(gòu)往往影響其生物活性[7]。在發(fā)酵過(guò)程中，改變多糖生物合成的代謝流量和糖單元分子的供應(yīng)，對(duì)多糖合成及分子結(jié)構(gòu)具有顯著的影響。因此，基于前期篩選得到的全合成培養(yǎng)基，開(kāi)展不同類型前體的篩選與發(fā)酵罐流加實(shí)驗(yàn)研究，為進(jìn)一步研究桑黃多糖的生物合成代謝調(diào)控規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

桑黃菌種(P. igniariusNO.5.51) 購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0、酵母粉15.0、MgSO4·7H2O 1.0、KH2PO41.0、CaCO30.2、pH6.1。全合成培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[4]配制。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 搖瓶培養(yǎng)

250mL搖瓶，全合成培養(yǎng)基裝液量50mL，接種量10%，溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。

1.3.2 3L發(fā)酵罐培養(yǎng)

3L發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備公司)，裝料2L，接種量10%，培養(yǎng)溫度25℃，起始轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵過(guò)程測(cè)定還原糖、生物量、胞外多糖代謝參數(shù)。

1.3.3 7L發(fā)酵罐培養(yǎng)

7L發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備公司)，裝料5L，接種量10%，培養(yǎng)溫度25℃，起始轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵過(guò)程測(cè)定還原糖、生物量、胞外多糖代謝參數(shù)。

1.4 不同前體種類篩選

1.4.1 糖類的篩選

以全合成培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖和乳糖。研究不同糖對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果取3批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值。

1.4.2 植物油的篩選

以全合成培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的黃豆油、橄欖油和菜籽油，研究不同種類的油對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果取3批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量測(cè)定

取20mL發(fā)酵液，3000r/min離心10min，得菌體，洗滌兩次，菌絲體于80℃ 烘干并稱質(zhì)量。

1.5.2 還原糖的測(cè)定

DNS 法測(cè)定[8]。

1.5.3 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定[4]

取20mL發(fā)酵液，3000r/min離心10min后，向上清液中加入2～3倍體積的乙醇，得到沉淀，于80℃烘干至質(zhì)量恒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖類前體對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響

藥用真菌多糖的合成主要通過(guò)糖苷鍵將不同的糖單體連接形成大分子多聚體結(jié)構(gòu)，因此不同糖單體結(jié)構(gòu)會(huì)影響多糖分子合成的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)選擇單糖(甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖)和雙糖(蔗糖和乳糖)，分別考察不同糖類化合物對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同糖種類對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響Table 1 Effects of the type and amount of sugar on mycelium growth and polysaccharide biosynthesis

由表1可見(jiàn)，和對(duì)照組相比，添加甘露糖、蔗糖、乳糖有利于桑黃菌絲生長(zhǎng)，其中乳糖獲得的桑黃菌絲生物量最高可達(dá)(13.18±0.83)g/L，比對(duì)照組提高了15.6%。而對(duì)桑黃胞外多糖合成的影響和對(duì)照組相比，添加阿拉伯糖和乳糖有助于胞外多糖的合成，其中添加乳糖時(shí)，桑黃胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)(1.29±0.01)g/L，比對(duì)照組提高了21.7%。

2.2 油類前體對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響

植物油在發(fā)酵過(guò)程中往往作為前體供應(yīng)和起消泡作用，同時(shí)由于油脂利用無(wú)阻遏效應(yīng)，不易發(fā)生降解物的阻遏效應(yīng)，有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物合成，往往作為前體應(yīng)用于眾多抗生素發(fā)酵生產(chǎn)。但油脂是否對(duì)桑黃胞外多糖的合成產(chǎn)生影響，迄今沒(méi)見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇幾種不同的植物油考察對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響，結(jié)果如表2。

表2 不同植物油對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響Table 2 Effects of the type and amount of sugar on mycelium growth and polysaccharide biosynthesis

由表2可知，和對(duì)照組相比，添加不同的植物油均能較大幅度提高桑黃菌絲的生長(zhǎng)，其中添加菜籽油生物量最高可達(dá)(34.63±1.6)g/L，比對(duì)照組提高了182.9%。然而胞外多糖明顯低于對(duì)照組，可能原因在于由于植物油起到消泡作用，同時(shí)發(fā)酵菌絲黏度增長(zhǎng)迅速，搖瓶中溶氧濃度受到限制，影響了胞外多糖的合成。Hsieh等[9]在5L發(fā)酵罐中發(fā)現(xiàn)添加橄欖油，提高溶氧濃度條件下，明顯有利于灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)和多糖的合成。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化乳糖添加濃度和時(shí)間

由于添加乳糖明顯有利于桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖的合成，根據(jù)桑黃多糖合成的特點(diǎn)，選擇不同乳糖質(zhì)量濃度(10、20、30g/L)和添加時(shí)間(0、72、120h)進(jìn)行代謝強(qiáng)化，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 乳糖質(zhì)量濃度和添加時(shí)間對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成影響的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of optimizing conditions for lactose supplement

由表3極差分析R值可知，最優(yōu)的組合為發(fā)酵初始(0h)添加30g/L的乳糖，可以獲得最多的桑黃菌絲量和胞外多糖。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵初始添加30g/L乳糖后，胞外多糖產(chǎn)量為(1.47±0.02)g/L，對(duì)照組為(1.06±0.01)g/L，表明正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果可信。從表4方差分析可知，乳糖添加時(shí)間對(duì)桑黃多糖的合成影響最顯著。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 Analysis of variances for polysaccharide production with various conditions for lactose supplement

2.4 3L發(fā)酵罐乳糖補(bǔ)加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

進(jìn)一步在3L發(fā)酵罐中考察初始培養(yǎng)基中添加30g/L乳糖對(duì)桑黃發(fā)酵過(guò)程的影響，結(jié)果如圖1。

圖1 3L發(fā)酵罐初始補(bǔ)加乳糖對(duì)桑黃發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.1 Effect of adding lactose on mycelium biomass, reducing sugar consumption and polysaccharide production during fermentation in a 3 L fermentor

從圖1可知，和對(duì)照組相比，補(bǔ)加乳糖48h后，桑黃菌絲體生長(zhǎng)明顯加快, 168h時(shí)桑黃菌絲生物量最高可達(dá)13.18g/L；從糖的利用來(lái)看, 對(duì)照組還原糖含量從發(fā)酵初到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，質(zhì)量濃度維持在37～15g/L之間，而補(bǔ)加乳糖組，還原糖含量維持在37～30g/L之間，說(shuō)明乳糖被桑黃菌絲分解為葡萄糖和半乳糖，參與了胞外多糖的合成；168h時(shí)桑黃胞外多糖最高可達(dá)1.21g/L，和對(duì)照組相比提高了25%。

2.5 7L發(fā)酵罐菜籽油流加實(shí)驗(yàn)

根據(jù)搖瓶結(jié)果，進(jìn)一步在7L發(fā)酵罐中開(kāi)展初始補(bǔ)加菜籽油的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 7L發(fā)酵罐初始補(bǔ)加菜籽油對(duì)桑黃發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.2 Effect of adding rapeseed oil on mycelium biomass, reducing sugar consumption and polysaccharide production during fermentation in a 7 L fermentor

由圖2可見(jiàn)，補(bǔ)加10g/L的菜籽油發(fā)酵24h后，桑黃菌絲生長(zhǎng)明顯高于對(duì)照組，144h桑黃菌絲生物量最高可達(dá)23.77g/L，相比對(duì)照組提高了207.1%。從還原糖的利用看，發(fā)酵96h 前，兩組菌體對(duì)還原糖的消耗基本相近，說(shuō)明可能分解利用菜籽油的脂肪酸用于細(xì)胞生長(zhǎng)；而胞外多糖的合成和搖瓶結(jié)果相似，補(bǔ)加菜籽油后胞外多糖的合成明顯低于對(duì)照組，發(fā)酵過(guò)程在線溶氧濃度監(jiān)測(cè)顯示溶解氧(DO)濃度長(zhǎng)時(shí)間低于10%，同時(shí)菌體濃度增加，發(fā)酵液黏度明顯增加，形成的氧限制狀態(tài)有可能是胞外多糖合成量減少的主要原因。

3 討論與結(jié)論

隨著桑黃液體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，提高桑黃有效活性成分多糖組分的產(chǎn)量和藥理活性是實(shí)現(xiàn)藥用真菌資源高值化利用的關(guān)鍵[10]，然而由于藥用多糖分子的復(fù)雜性和多樣性，采用微生物代謝調(diào)控手段提高藥用真菌代謝產(chǎn)物的生物合成受到重視。如Liang等[11]利用苯巴比妥誘導(dǎo)促進(jìn)藥用真菌靈芝菌合成靈芝酸，同時(shí)對(duì)生物合成途徑重點(diǎn)關(guān)鍵基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平分析；Zhu等[12]利用真菌來(lái)源的生物誘導(dǎo)子誘導(dǎo)靈芝多糖和靈芝酸的合成。本課題組曾利用不同植物激素誘導(dǎo)桑黃多糖的合成，發(fā)現(xiàn)萘乙酸能促進(jìn)桑黃菌絲生長(zhǎng)和多糖的合成，同時(shí)對(duì)多糖的分子結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響[6]；同時(shí)發(fā)現(xiàn)用NaCl溶液調(diào)節(jié)桑黃發(fā)酵過(guò)程的滲透壓，桑黃多糖的分子組成發(fā)生變化[13]，相類似的現(xiàn)象也被臺(tái)灣學(xué)者在桑黃研究中進(jìn)一步報(bào)道[14]。本研究從多糖合成前體供應(yīng)的角度，在全合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過(guò)篩選不同的糖類前體和植物油前體，考察對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響。結(jié)果表明乳糖作為前體，能明顯促進(jìn)桑黃菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖的合成，3L發(fā)酵罐初始添加乳糖發(fā)酵168h時(shí)胞外多糖最高可達(dá)1.21g/L，比對(duì)照組提高了25%，說(shuō)明增加多糖合成單元的供應(yīng)策略是可行的。植物油的添加能促進(jìn)藥用真菌的生理代謝，可作為一種有效的調(diào)控手段，在藥用真菌靈芝菌發(fā)酵過(guò)程，添加玉米油能促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)和多糖的合成[15]。而在本實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)加菜籽油，能明顯大幅度提高桑黃菌絲體的生長(zhǎng)；同時(shí)由于菌絲大量生長(zhǎng)，造成發(fā)酵過(guò)程氧供應(yīng)受到限制，影響胞外多糖合成，還需要進(jìn)一步增加攪拌供氧措施來(lái)解決。上述研究結(jié)果將為進(jìn)一步應(yīng)用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)桑黃菌絲體和胞外多糖，以及真菌多糖合成的代謝調(diào)控提供新的研究思路。

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Effect of Precursors on Mycelium Growth and Polysaccharide Biosynthesis in Medicinal MushroomPhellinus igniarius

ZOU Xiang1，GUO Xia1,2，SUN Min2
(1. College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Q815

A

1002-6630(2010)21-0262-04

2010-08-19

重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(CSTC，2005BB1101 )；重慶市科技創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目(CSTC，2009CB1010)

鄒祥(1976—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程與食品生物技術(shù)。E-mail：zhx1030@yahoo.cn