前體對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響

鄒 祥，郭 霞,， 孫 敏

(1.西南大學藥學院，重慶 400715；2.西南大學生命科學學院，重慶 400715)

前體對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響

鄒 祥1，郭 霞1,2， 孫 敏2

(1.西南大學藥學院，重慶 400715；2.西南大學生命科學學院，重慶 400715)

考察不同類型前體對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響，在全合成培養(yǎng)基中添加乳糖前體有利于桑黃菌絲的生長和胞外多糖的合成。采用正交試驗優(yōu)化獲得乳糖補加條件：發(fā)酵初始補加30g/L乳糖，3L發(fā)酵罐發(fā)酵168h驗證實驗獲得的桑黃菌絲量最高可達13.18g/L，胞外多糖產量最高可達1.21g/L，比對照組提高了25%。而植物油類前體篩選發(fā)現(xiàn)菜籽油能明顯促進桑黃菌絲的生長，7L發(fā)酵罐中發(fā)酵144h桑黃菌絲量最高可達23.77g/L，比對照組提高了207.1%，但抑制胞外多糖的合成。

前體；桑黃；菌絲生長；胞外多糖

Abstract：To promote mycelium growth and polysaccharide biosynthesis inPhellinus igniarius, different groups (sugar and plant oil) of precursors were added to synthetic complete medium and the effects of the kind and amount of separately added sugars and plant oils onPhellinus igniariusmycelium growth and polysaccharide biosynthesis were dealt with. A two-factor, threelevel full combination design was used to optimize the conditions for lactose supplement, and the results showed that a maximum mycelium biomass of up to 13.18 g/L and a maximum polysaccharide production of up to 1.21 g/L were achieved after 168 h fermentation in a 3 L fermentor with an initial lactose concentration of 30 g/L, and the increment percent of polysaccharide production was 25% in comparison with the control. Among oils from three plants, including soybean, olive and rapeseed,rapeseed oil most obviously promoted the growth ofPhellinus igniariusmycelia, and the maximum mycelium biomass was up to 23.77 g/L after fermentation for 144 h in a 7 L fermentor, 207.1% higher than that obtained from the control, while polysaccharide biosynthesis was inhibited by adding rapeseed oil.

Key words：precursors；Phellinus igniarius；mycelia growth；polysaccharide

桑黃(Phellinus igniarius)學名為火木針層孔菌，是一種珍稀的藥用真菌。桑黃具有多種藥理活性，其中活性成分桑黃多糖具有較強的抗癌[1]、抗氧化[2]及降血脂[3]等功效，并且無毒副作用，具有較高的經濟價值。由于桑黃野生子實體稀少，人工栽培還處于起步階段，采用液體培養(yǎng)獲得具有藥理活性的菌絲體和胞外多糖，周期短，便于工業(yè)化生產，具有廣泛的市場前景。

發(fā)酵法生產桑黃菌絲體及多糖已有相關的報道，主要集中在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、工藝條件、分離純化等[4-6]方面，而且優(yōu)化的培養(yǎng)基多以復合的碳、氮源為主、成分復雜，對多糖的測定和代謝調控的研究帶來困難。針對此問題，本課題組開展了桑黃發(fā)酵全合成培養(yǎng)基篩選與優(yōu)化的研究，篩選得到成分清晰，多糖測定簡便的培養(yǎng)基[4]。同時由于真菌多糖為不同糖單元組成的多聚糖大分子，多糖分子結構往往影響其生物活性[7]。在發(fā)酵過程中，改變多糖生物合成的代謝流量和糖單元分子的供應，對多糖合成及分子結構具有顯著的影響。因此，基于前期篩選得到的全合成培養(yǎng)基，開展不同類型前體的篩選與發(fā)酵罐流加實驗研究，為進一步研究桑黃多糖的生物合成代謝調控規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

桑黃菌種(P. igniariusNO.5.51) 購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0、酵母粉15.0、MgSO4·7H2O 1.0、KH2PO41.0、CaCO30.2、pH6.1。全合成培養(yǎng)基：參照文獻[4]配制。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 搖瓶培養(yǎng)

250mL搖瓶，全合成培養(yǎng)基裝液量50mL，接種量10%，溫度25℃，搖床轉速200r/min。

1.3.2 3L發(fā)酵罐培養(yǎng)

3L發(fā)酵罐(上海保興生物設備公司)，裝料2L，接種量10%，培養(yǎng)溫度25℃，起始轉速200r/min，發(fā)酵過程測定還原糖、生物量、胞外多糖代謝參數(shù)。

1.3.3 7L發(fā)酵罐培養(yǎng)

7L發(fā)酵罐(上海保興生物設備公司)，裝料5L，接種量10%，培養(yǎng)溫度25℃，起始轉速200r/min，發(fā)酵過程測定還原糖、生物量、胞外多糖代謝參數(shù)。

1.4 不同前體種類篩選

1.4.1 糖類的篩選

以全合成培養(yǎng)基為基礎，分別加入質量分數(shù)為1%的甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖和乳糖。研究不同糖對桑黃菌絲生長和胞外多糖產量的影響，結果取3批實驗數(shù)據(jù)平均值。

1.4.2 植物油的篩選

以全合成培養(yǎng)基為基礎，分別加入質量分數(shù)為1%的黃豆油、橄欖油和菜籽油，研究不同種類的油對桑黃菌絲生長和胞外多糖產量的影響，結果取3批實驗數(shù)據(jù)平均值。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量測定

取20mL發(fā)酵液，3000r/min離心10min，得菌體，洗滌兩次，菌絲體于80℃ 烘干并稱質量。

1.5.2 還原糖的測定

DNS 法測定[8]。

1.5.3 胞外多糖產量測定[4]

取20mL發(fā)酵液，3000r/min離心10min后，向上清液中加入2～3倍體積的乙醇，得到沉淀，于80℃烘干至質量恒定。

2 結果與分析

2.1 糖類前體對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響

藥用真菌多糖的合成主要通過糖苷鍵將不同的糖單體連接形成大分子多聚體結構，因此不同糖單體結構會影響多糖分子合成的結構和產量。本實驗選擇單糖(甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖)和雙糖(蔗糖和乳糖)，分別考察不同糖類化合物對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響，結果見表1。

表1 不同糖種類對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響Table 1 Effects of the type and amount of sugar on mycelium growth and polysaccharide biosynthesis

由表1可見，和對照組相比，添加甘露糖、蔗糖、乳糖有利于桑黃菌絲生長，其中乳糖獲得的桑黃菌絲生物量最高可達(13.18±0.83)g/L，比對照組提高了15.6%。而對桑黃胞外多糖合成的影響和對照組相比，添加阿拉伯糖和乳糖有助于胞外多糖的合成，其中添加乳糖時，桑黃胞外多糖產量可達(1.29±0.01)g/L，比對照組提高了21.7%。

2.2 油類前體對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響

植物油在發(fā)酵過程中往往作為前體供應和起消泡作用，同時由于油脂利用無阻遏效應，不易發(fā)生降解物的阻遏效應，有利于次級代謝產物合成，往往作為前體應用于眾多抗生素發(fā)酵生產。但油脂是否對桑黃胞外多糖的合成產生影響，迄今沒見相關報道，因此，本實驗選擇幾種不同的植物油考察對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響，結果如表2。

表2 不同植物油對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響Table 2 Effects of the type and amount of sugar on mycelium growth and polysaccharide biosynthesis

由表2可知，和對照組相比，添加不同的植物油均能較大幅度提高桑黃菌絲的生長，其中添加菜籽油生物量最高可達(34.63±1.6)g/L，比對照組提高了182.9%。然而胞外多糖明顯低于對照組，可能原因在于由于植物油起到消泡作用，同時發(fā)酵菌絲黏度增長迅速，搖瓶中溶氧濃度受到限制，影響了胞外多糖的合成。Hsieh等[9]在5L發(fā)酵罐中發(fā)現(xiàn)添加橄欖油，提高溶氧濃度條件下，明顯有利于灰樹花菌絲生長和多糖的合成。

2.3 正交試驗優(yōu)化乳糖添加濃度和時間

由于添加乳糖明顯有利于桑黃菌絲生長和胞外多糖的合成，根據(jù)桑黃多糖合成的特點，選擇不同乳糖質量濃度(10、20、30g/L)和添加時間(0、72、120h)進行代謝強化，采用正交試驗進行優(yōu)化，結果見表3。

表3 乳糖質量濃度和添加時間對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成影響的正交試驗結果Table 3 Experimental results of optimizing conditions for lactose supplement

由表3極差分析R值可知，最優(yōu)的組合為發(fā)酵初始(0h)添加30g/L的乳糖，可以獲得最多的桑黃菌絲量和胞外多糖。通過驗證實驗，發(fā)酵初始添加30g/L乳糖后，胞外多糖產量為(1.47±0.02)g/L，對照組為(1.06±0.01)g/L，表明正交試驗優(yōu)化結果可信。從表4方差分析可知，乳糖添加時間對桑黃多糖的合成影響最顯著。

表4 正交試驗結果方差分析表Table 4 Analysis of variances for polysaccharide production with various conditions for lactose supplement

2.4 3L發(fā)酵罐乳糖補加發(fā)酵實驗

進一步在3L發(fā)酵罐中考察初始培養(yǎng)基中添加30g/L乳糖對桑黃發(fā)酵過程的影響，結果如圖1。

圖1 3L發(fā)酵罐初始補加乳糖對桑黃發(fā)酵過程的影響Fig.1 Effect of adding lactose on mycelium biomass, reducing sugar consumption and polysaccharide production during fermentation in a 3 L fermentor

從圖1可知，和對照組相比，補加乳糖48h后，桑黃菌絲體生長明顯加快, 168h時桑黃菌絲生物量最高可達13.18g/L；從糖的利用來看, 對照組還原糖含量從發(fā)酵初到發(fā)酵結束時，質量濃度維持在37～15g/L之間，而補加乳糖組，還原糖含量維持在37～30g/L之間，說明乳糖被桑黃菌絲分解為葡萄糖和半乳糖，參與了胞外多糖的合成；168h時桑黃胞外多糖最高可達1.21g/L，和對照組相比提高了25%。

2.5 7L發(fā)酵罐菜籽油流加實驗

根據(jù)搖瓶結果，進一步在7L發(fā)酵罐中開展初始補加菜籽油的發(fā)酵實驗，結果如圖2所示。

圖2 7L發(fā)酵罐初始補加菜籽油對桑黃發(fā)酵過程的影響Fig.2 Effect of adding rapeseed oil on mycelium biomass, reducing sugar consumption and polysaccharide production during fermentation in a 7 L fermentor

由圖2可見，補加10g/L的菜籽油發(fā)酵24h后，桑黃菌絲生長明顯高于對照組，144h桑黃菌絲生物量最高可達23.77g/L，相比對照組提高了207.1%。從還原糖的利用看，發(fā)酵96h 前，兩組菌體對還原糖的消耗基本相近，說明可能分解利用菜籽油的脂肪酸用于細胞生長；而胞外多糖的合成和搖瓶結果相似，補加菜籽油后胞外多糖的合成明顯低于對照組，發(fā)酵過程在線溶氧濃度監(jiān)測顯示溶解氧(DO)濃度長時間低于10%，同時菌體濃度增加，發(fā)酵液黏度明顯增加，形成的氧限制狀態(tài)有可能是胞外多糖合成量減少的主要原因。

3 討論與結論

隨著桑黃液體培養(yǎng)技術的發(fā)展，提高桑黃有效活性成分多糖組分的產量和藥理活性是實現(xiàn)藥用真菌資源高值化利用的關鍵[10]，然而由于藥用多糖分子的復雜性和多樣性，采用微生物代謝調控手段提高藥用真菌代謝產物的生物合成受到重視。如Liang等[11]利用苯巴比妥誘導促進藥用真菌靈芝菌合成靈芝酸，同時對生物合成途徑重點關鍵基因進行了轉錄水平分析；Zhu等[12]利用真菌來源的生物誘導子誘導靈芝多糖和靈芝酸的合成。本課題組曾利用不同植物激素誘導桑黃多糖的合成，發(fā)現(xiàn)萘乙酸能促進桑黃菌絲生長和多糖的合成，同時對多糖的分子結構沒有影響[6]；同時發(fā)現(xiàn)用NaCl溶液調節(jié)桑黃發(fā)酵過程的滲透壓，桑黃多糖的分子組成發(fā)生變化[13]，相類似的現(xiàn)象也被臺灣學者在桑黃研究中進一步報道[14]。本研究從多糖合成前體供應的角度，在全合成培養(yǎng)基的基礎上，通過篩選不同的糖類前體和植物油前體，考察對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響。結果表明乳糖作為前體，能明顯促進桑黃菌絲生長和胞外多糖的合成，3L發(fā)酵罐初始添加乳糖發(fā)酵168h時胞外多糖最高可達1.21g/L，比對照組提高了25%，說明增加多糖合成單元的供應策略是可行的。植物油的添加能促進藥用真菌的生理代謝，可作為一種有效的調控手段，在藥用真菌靈芝菌發(fā)酵過程，添加玉米油能促進菌絲生長和多糖的合成[15]。而在本實驗中，補加菜籽油，能明顯大幅度提高桑黃菌絲體的生長；同時由于菌絲大量生長，造成發(fā)酵過程氧供應受到限制，影響胞外多糖合成，還需要進一步增加攪拌供氧措施來解決。上述研究結果將為進一步應用液體發(fā)酵技術培養(yǎng)桑黃菌絲體和胞外多糖，以及真菌多糖合成的代謝調控提供新的研究思路。

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Effect of Precursors on Mycelium Growth and Polysaccharide Biosynthesis in Medicinal MushroomPhellinus igniarius

ZOU Xiang1，GUO Xia1,2，SUN Min2
(1. College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Q815

A

1002-6630(2010)21-0262-04

2010-08-19

重慶市自然科學基金項目(CSTC，2005BB1101 )；重慶市科技創(chuàng)新能力建設項目(CSTC，2009CB1010)

鄒祥(1976—)，男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程與食品生物技術。E-mail：zhx1030@yahoo.cn