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    高山紅景天中糖基轉(zhuǎn)移酶家族cDNA全長(zhǎng)基因的克隆

    2010-10-19 05:25:56于寒松張繼星李彥舫馬蘭青胡耀輝
    食品科學(xué) 2010年21期
    關(guān)鍵詞:紅景天基轉(zhuǎn)移酶高山

    于寒松,張繼星,李彥舫,馬蘭青*,胡耀輝,*

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118;2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028043;3.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130062;4.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,北京農(nóng)學(xué)院,北京 102206)

    高山紅景天中糖基轉(zhuǎn)移酶家族cDNA全長(zhǎng)基因的克隆

    于寒松1,張繼星2,李彥舫3,馬蘭青4,*,胡耀輝1,*

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118;2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028043;3.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130062;4.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,北京農(nóng)學(xué)院,北京 102206)

    為了獲得高山紅景天中紅景天苷生物合成關(guān)鍵酶——UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因的全長(zhǎng)cDNA序列,采用在線簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)軟件結(jié)合3′-RACE技術(shù)獲得兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的3′端部分序列,進(jìn)一步采用不同的5′-RACE試劑盒擴(kuò)增兩個(gè)基因的5′端序列,結(jié)果顯示利用Takara公司的試劑盒擴(kuò)增可以得到cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)為EF508689和EU567325),而采用Invitrogen公司的試劑盒得到的序列不包括全部開(kāi)放讀碼框。實(shí)驗(yàn)證明,利用Takara公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit克隆獲得基因全長(zhǎng)序列的比率更高。

    糖基轉(zhuǎn)移酶;基因克隆;cDNA末端快速克隆法(RACE);高山紅景天

    Abstract:In order to obtain the critical enzyme for the synthesis ofRhodiola sachalinensisglycoside, two putative UDP-glycosyltransferase (UGT) cDNAs (GenBank accession number, EF508689和EU567325) were isolated fromR. sachalinensi.The primers were designed for 3'-rapid amplification of cDNA ends (RACE) based on the consensus hybrid oligonucleotide primers (CODEHOP) strategy by the Block Maker program. A full-length cDNA sequence (Genbank accession numbers:EF508689 and EU567325) was obtained through the amplification using a SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (TaKaRa,Dalian, China), whereas the sequence obtained using a 5'-RACE system (version 2.0, InvitrogenTMLife Technologies) contained no full-open reading frame.The cloning efficient of two 5'-RACE systems was investigated. Results exhibited that TaKaRa SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit was more efficient in complete cDNA sequence cloning, compared with the InvitrogenTM5'-RACE system.

    Key words:glycosyltransferase;gene cloning;rapid amplification of cDNA ends (RACE);Rhodiola sachalinensis

    植物次生代謝物質(zhì)在植物生命活動(dòng)過(guò)程中起著重要作用,如細(xì)胞解毒、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御機(jī)制等[1-3]。對(duì)人類而言,很多植物次生代謝物具有很多生理功能,也是保健品和醫(yī)藥品的重要來(lái)源[4]。現(xiàn)階段天然產(chǎn)物己越來(lái)越多地被應(yīng)用于保健食品、天然香料、天然色素和藥物等產(chǎn)品的生產(chǎn)上[5-6]。但是,植物雖然能合成上萬(wàn)種次生代謝產(chǎn)物,但是它們的含量都很低。因此,利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)獲得有價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物已成為科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。

    長(zhǎng)白山高山紅景天具有明顯的抗輻射、抗疲勞、抗病毒、延緩機(jī)體衰老等生理功能[7-10],主要是由于它含有紅景天苷、酪薩維、紅景天素和草質(zhì)素苷等多種糖苷,這些物質(zhì)都是糖基轉(zhuǎn)移酶的催化產(chǎn)物[11-12],尤其是紅景天的主要功能性物質(zhì)——紅景天苷,就是在酪醇糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下合成的。因此,以長(zhǎng)白山高山紅景天為原料,克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)w外合成紅景天的功能性物質(zhì)或上調(diào)紅景天合成這些次生代謝物質(zhì)的量具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以長(zhǎng)白山高山紅景天為原料,通過(guò)基因工程方法分離糖基轉(zhuǎn)移酶家族的基因,同時(shí)比較兩種5′-RACE試劑盒克隆未知基因5′端序列的效率。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    高山紅景天野生植株采自吉林長(zhǎng)白山。

    SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 日本Takara公司;5'RACE system for rapid amplification of cDNA ends試劑盒 美國(guó)Invitrogen公司;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和上海華大鼎安公司完成。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Biometra 2000 PCR擴(kuò)增儀 德國(guó)Whatman Biometra公司;MIKRO 22R高速冷凍離心機(jī) Hettich公司;-80℃超低溫冰箱 Sanyo公司;電泳儀 北京六一儀器公司;TGL 16G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 高山紅景天總RNA提取

    采用改進(jìn)后的CTAB-LiCl法提取總RNA,具體步驟參照文獻(xiàn)[13]。

    1.3.2 引物設(shè)計(jì)

    1.3.2.1 3′-RACE簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)

    上游引物設(shè)計(jì):根據(jù)在GenBank上已發(fā)布的植物糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列及相關(guān)文獻(xiàn)[14-15],選取其中5個(gè)以簡(jiǎn)單酚類為催化底物的酶序列,其中包括藏紅花 (登錄號(hào)AY262037)、甜菊(登錄號(hào)AY345982)、擬南芥(登錄號(hào)AC002333)、煙草屬(登錄號(hào)AB052558)、甘草屬(登錄號(hào)AB098614)。將這些序列以FASTA格式提交到http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/blockmkr/www/make_blocks.html得到5個(gè)酶的氨基酸保守區(qū)序列,將最保守的序列提交到在線引物設(shè)計(jì)軟件CODEHOP (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html) 中進(jìn)行引物設(shè)計(jì),得到的引物命名為引物B,序列為5′-GTT GGAGTTTTTGTTACTCAytgyggntgga-3′。

    下游引物設(shè)計(jì):根據(jù)反轉(zhuǎn)錄的引物Q1:5′-GAG GACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTT-3′設(shè)計(jì)下游引物序列為Q2:5′-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′。

    1.3.2.2 5′-RACE特異性引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)獲得的兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的3′端序列利用Primer Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)5'-RACE實(shí)驗(yàn)巢式引物,引物序列見(jiàn)表1。

    表1 克隆UGTC和UGTR5'端引物序列Table 1 Primer sequences for cloning 5'-end ofUGTCandUGTR

    其他5′-RACE所需相關(guān)引物CDS Prime、SMART II、UPM引物為SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit自帶引物;AAP、UAP、AUAP引物為5'-RACE system for rapid amplification of cDNA ends試劑盒自帶引物。

    1.3.3 PCR擴(kuò)增條件

    以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行3'-RACE實(shí)驗(yàn),PCR條件為:95℃預(yù)變性5min;94℃ 30s,58℃45s,72℃ 1min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。5'-RACE的PCR條件按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書操作。

    目的基因的回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定均按常規(guī)方法[16]操作,序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

    1.3.4 生物信息學(xué)分析

    應(yīng)用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站上的BLAST程序完成氨基酸序列比對(duì)和蛋白質(zhì)序列同源性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 3′-RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    以提取的紅景天總RNA為模板,利用引物Q1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,利用引物Q2和B進(jìn)行PCR,反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示3′-RACE實(shí)驗(yàn)獲得兩個(gè)約500bp的基因片段,見(jiàn)圖1。所得片段與pMD18-Tsimple載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送測(cè)序公司測(cè)序。

    圖1 3'RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of 3'-RACE

    2.2 5′-RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)3′-RACE實(shí)驗(yàn)所得到的序列設(shè)計(jì)5′-RACE實(shí)驗(yàn)所需的特異性引物(表1),參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行5′-RACE實(shí)驗(yàn),反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示:采用Invitrogen公司試劑盒擴(kuò)增得到的基因片段長(zhǎng)度都為800bp左右,見(jiàn)圖2、3;而采用Takara公司試劑盒擴(kuò)增得到的基因片段長(zhǎng)度在1100bp左右,見(jiàn)圖4、5。將所得到的基因序列與T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后測(cè)序。

    圖2 Invitrogen試劑盒UGTC5'-RACE結(jié)果Fig.2 Analytical results of 5'-RACE ofUGTCgene by Invitrogen kit

    圖3 Invitrogen試劑盒UGTR5'-RACE結(jié)果Fig.3 Analytical results of 5'-RACE ofUGTRgene by Invitrogen kit

    圖4 Takara試劑盒UGTC5'-RACE結(jié)果Fig.4 Analytical results of 5'-RACE ofUGTCgene by Takara kit

    圖5 Takara試劑盒UGTR5'-RACE結(jié)果Fig.5 Analytical results of 5'-RACE ofUGTRgene by Takara kit

    測(cè)序結(jié)果顯示,兩個(gè)試劑盒擴(kuò)增的兩個(gè)酶5′端基因片段都分別都有800個(gè)左右堿基序列完全相同,但Takara公司試劑盒擴(kuò)增得到的基因序列比Invitrogen公司試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)200個(gè)堿基左右,經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析,Takara公司試劑盒擴(kuò)增得到的序列包括完整的開(kāi)放讀碼框序列,并且分別含有41個(gè)和53個(gè)堿基的上游非編碼序列。說(shuō)明利用Invitrogen公司試劑盒擴(kuò)增沒(méi)有得到基因的全部編碼序列,而利用Takara公司試劑盒擴(kuò)增可以得到包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)的全部酶基因序列。全序列的序列信息已登陸到GenBank,登錄號(hào)分別為EF508689和EU567325。

    2.3 兩個(gè)新基因的生物信息學(xué)分析

    將兩個(gè)新的基因序列翻譯成氨基酸并應(yīng)用NCBI的BLAST程序進(jìn)行分析,分析結(jié)果如圖6、7所示??梢钥闯鰞蓚€(gè)基因都屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超家族。UGTC翻譯蛋白具有PLN02152型結(jié)構(gòu)域,代表UGTC可能屬于UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶類;UGTR翻譯蛋白具有PLN02992型結(jié)構(gòu)域,代表UGTR可能屬于松柏醇葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶類。

    圖6 UGTC蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析Fig.6 Analysis of structure and function domains in UGTC protein

    圖7 UGTR蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析Fig.7 Analysis of structure and function domains in UGTR protein

    3 討 論

    紅景天苷生物合成最后一步反應(yīng)機(jī)制已經(jīng)清楚,植物體內(nèi)的尿苷二磷酸(UDP-glucosyltransferase,UDPGT)以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和酪醇為底物催化合成紅景天苷[17]。因此,提高這個(gè)關(guān)鍵酶表達(dá)量很有可能提高植物或植物細(xì)胞內(nèi)紅景天苷的含量。因此,克隆高山紅景天中的糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)在分子水平上調(diào)控紅景天苷的合成具有非常重要的意義。

    在線簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)程序CODEHOP與Takara公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit聯(lián)合使用,對(duì)于獲得未知基因的cDNA全長(zhǎng)序列的效率較高,為新基因分離提供了一條新的快捷途徑。

    CODEHOP在線設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物與傳統(tǒng)引物設(shè)計(jì)方法所得引物相比具有擴(kuò)增特異性高和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),原理在于用CODEHOP設(shè)計(jì)的引物包括兩部分:一部分是根據(jù)保守氨基酸序列設(shè)計(jì)的3′簡(jiǎn)并區(qū),一部分是根據(jù)保守氨基酸和密碼子偏好性原則預(yù)測(cè)的最有可能的5′特異夾板區(qū)[13,18]。

    由于cDNA 5'端的序列各不相同,如何利用已知片斷序列得到全長(zhǎng)的cDNA,是一個(gè)令人困擾的問(wèn)題。常見(jiàn)的做法是利用末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈cDNA的3'末端加上一連串的G或者C,再通過(guò)補(bǔ)齊黏末端,利用已知的兩頭序列進(jìn)行擴(kuò)增(Invitrogen試劑盒原理),但這種方法存在一些問(wèn)題,如接頭的連接效率較低,且這些方法需要多次用不同的酶處理有限的樣品,并經(jīng)過(guò)反復(fù)的純化,對(duì)于少量樣品中的低豐度信息,很大程度上會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外由于mRNA容易部分降解,很難確保得到的cDNA是全長(zhǎng)的cDNA。而Takara試劑盒中應(yīng)用的逆轉(zhuǎn)錄酶在以mRNA為模板合成cDNA的時(shí)候,當(dāng)?shù)竭_(dá)mRNA的5'末端碰到真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”時(shí),即甲基化的G時(shí)會(huì)連續(xù)在合成的cDNA末端合成幾個(gè)C,由于有5'“帽子結(jié)構(gòu)”的mRNA才能利用這個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到能擴(kuò)增的cDNA,因此被轉(zhuǎn)錄的都是沒(méi)有降解的RNA,擴(kuò)增得到的cDNA就都是全長(zhǎng)cDNA。

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    Full-length cDNA Cloning of Glycosyltransferase Family fromRhodiola sachalinensis

    YU Han-song1,ZHANG Ji-xing2,LI Yan-fang3,MA Lan-qing4,*,HU Yao-hui1,*
    (1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;2. College of Life Sciences, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028043, China;3. College of Plant Science, Jilin University, Changchun 130062, China;4. Key Laboratory of Urban Agriculture(North), Ministry of Agriculture, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

    Q785

    A

    1002-6630(2010)21-0244-04

    2010-06-30

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900112)

    于寒松(1979—),男,講師,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:yuhansong@jluhp.edu.cn

    *通信作者:馬蘭青 (1971—), 男,副教授,博士,研究方向?yàn)橹参锎紊x分子調(diào)控與代謝工程。E-mail:lqma@bac.edu.cn

    胡耀輝(1951—),男,教授,學(xué)士,研究方向?yàn)槭称飞镏圃炫c新資源利用。E-mail:huyaohui@vip.163.com

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