• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌lp15-2-1產(chǎn)共軛亞油酸發(fā)酵條件

    2010-10-19 05:26:00馬鎏镠何國慶
    食品科學(xué) 2010年21期
    關(guān)鍵詞:亞油酸共軛響應(yīng)值

    周 倩,劉 佩,馬鎏镠,阮 暉,何國慶*

    (浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310029)

    響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌lp15-2-1產(chǎn)共軛亞油酸發(fā)酵條件

    周 倩,劉 佩,馬鎏镠,阮 暉,何國慶*

    (浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310029)

    對植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸(CLA)發(fā)酵工藝進行研究。通過單因素試驗確定最佳接種量、培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時間、亞油酸添加時間、亞油酸質(zhì)量濃度。采用響應(yīng)面Box-Benhnken試驗設(shè)計,建立初始pH值、培養(yǎng)溫度和亞油酸質(zhì)量濃度的二次多項式回歸方程模型,所得植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)共軛亞油酸的最佳參數(shù)為:溫度30℃、亞油酸質(zhì)量濃度0.21mg/mL、初始pH6.3,此條件下,CLA得率為44.77μg/mL,CLA理論得率為45.326μg/mL,轉(zhuǎn)化率為21.32%,與優(yōu)化前轉(zhuǎn)化率7.78%相比,有了很大提高。

    共軛亞油酸;植物乳桿菌;響應(yīng)面法

    Abstract:In this work, the fermentation conditions for converting linoleic acid into conjugated linoleic acid (CLA) byLactobacillus plantarumlp15-2-1 were studied. Single factor experiments were done to understand the effects of inoculum amount,incubation temperature, pH, incubation time and initial level of linoleic acid on CLA production. Using response surface Box-Benhnken design, a quadratic polynomial regression model was established. The results indicated that the optimal levels of incubation temperature, initial level of linoleic acid and pH were30 ℃, 0.21 mg/mL and 6.3, respectively. Under these optimal fermentation conditions, the yield and conversion rate of CLA were 44.77μg/mL and 21.32 %, which were higher than the predicted values of 45.326 μg/mL and 7.78 %, respectively.

    Key words:conjugated linoleic acid (CLA);Lactobacillus plantarum;response surface methodology

    共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是一系列含有共軛雙鍵、具有位置和構(gòu)象異構(gòu)的十八碳二烯酸的總稱,是必需脂肪酸亞油酸(linoleic acid,LA)的一組異構(gòu)體。人類和動物中最主要的異構(gòu)體是順-9,反-11-十八碳二烯酸(c9,t11-CLA)[1-2],被命名為瘤胃酸(rumenic acid)。研究表明,CLA具有抗氧化、抗癌、抗動脈粥樣硬化、減少機體脂等功能[3-5]。

    目前商業(yè)化生產(chǎn)CLA主要是以富含LA的種子油(如向日葵油(64% LA)、玉米油(57% LA)、棉籽油(53%LA)、豆油(51% LA)等)進行堿催化異構(gòu)。其機理是:在強堿條件下,LA第11位碳被奪去一個質(zhì)子,形成碳負(fù)離子,然后由于熱力學(xué)因素引起碳負(fù)離子遷移,從而形成不同的共軛化產(chǎn)物[6-7]。采用化學(xué)方法原理比較簡單,但在反應(yīng)過程中會產(chǎn)生一系列CLA異構(gòu)體混合物、飽和或不飽和脂肪酸及有毒物質(zhì),活性CLA提純工藝繁瑣,應(yīng)用成本較高。

    已發(fā)現(xiàn)一些瘤胃菌、丙酸菌和乳酸菌能生物合成CLA。微生物合成CLA在培養(yǎng)方面靈活、不需要高溫高壓;生成的異構(gòu)體以c9,t11-CLA為主,分離純化步驟相對簡單。但是,瘤胃菌是嚴(yán)格厭氧菌,培養(yǎng)困難,且發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)雜,發(fā)酵條件難以控制。而乳酸菌是人體益生菌,可以兼性發(fā)酵或微含氧發(fā)酵,發(fā)酵成本低廉,發(fā)酵條件易控制,且發(fā)酵產(chǎn)物對人體安全,用其生產(chǎn)CLA可以直接應(yīng)用于食品,或精制成藥品,因此應(yīng)用乳酸菌生產(chǎn)CLA將有廣闊的應(yīng)用前景[8-10]。

    本實驗采用從泡菜中分離篩選,并經(jīng)過誘變處理后獲得的一株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1。利用單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵條件,為實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)做準(zhǔn)備。

    1 材料與方法

    1.1 菌種與培養(yǎng)基

    植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1由實驗室分離篩選。

    MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g、牛肉提取物10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖20.0g、無水乙酸鈉5.0g、檸檬酸三胺2.0g、Tween-801.0mL、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.02g、硫酸錳0.05g、蒸餾水1.0L,pH6.0~6.5。配好的培養(yǎng)液分裝至10mL厭氧管中。121℃滅菌20min。

    1.2 試劑與儀器

    亞油酸(LA)、共軛亞油酸(CLA) Sigma公司。

    雙層大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;PHS-9V型酸度計 杭州華光無線電廠;L-550臺式低速大容量離心機 長沙湘儀離心機有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

    1.3 方法

    菌種活化:取保存在4℃冰箱的植物乳桿菌活化兩次后,接種至裝有10mL MRS培養(yǎng)液的厭氧管(15mm×160mm)中,振蕩或靜止培養(yǎng)。

    亞油酸的乳化:配制體積分?jǐn)?shù)1%吐溫-80溶液,121℃、20min滅菌。滅菌后加入適量LA,混勻,冰水浴下超聲波乳化分散(功率600W,工作5s,間歇10s,20次);之后用0.22μm無菌濾膜過濾[11]。

    1.3.1 單因素試驗

    考察氮氣排氧(采用氮氣驅(qū)除氧氣和未驅(qū)除氧氣的比較)、振蕩培養(yǎng)(180r/min振蕩和靜止培養(yǎng)的比較)、LA質(zhì)量濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)、接種量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%)、培養(yǎng)溫度(25、30、33、37、42℃)、初始pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、培養(yǎng)時間(0、12、24、36、48、60、72h)、LA添加時間(接種0、2、4、6、8、10、12h后,再加入LA)對CLA生成的影響。

    1.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

    在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上,采用軟件Design-Expert 6.0中的Box-Behnken試驗設(shè)計原理,以溫度、LA質(zhì)量濃度、pH值3個因素為自變量,以CLA得率為響應(yīng)值設(shè)計試驗。

    表1 Box-Benhnken試驗設(shè)計因素和水平Table 1 Factors and levels in the Box-Benhnken experiment design

    1.3.3 測定方法

    共軛亞油酸在波長233nm處有明顯吸收峰,利用共軛亞油酸的這一特性,采用紫外分光光度法進行檢測。以正己烷為溶劑,將CLA標(biāo)樣配成不同質(zhì)量濃度的溶液,以正己烷為參比,測定233nm波長處的吸光度,以CLA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:y=0.1058x+0.1452,R2=0.9918。

    樣品處理:用等體積的正己烷、異丙醇萃取發(fā)酵液,振蕩混勻后,離心;再水洗、離心。于233 nm波長處測定吸光度,空白對照為同條件培養(yǎng)的MRS(添加同質(zhì)量濃度LA)培養(yǎng)液的正己烷提取液[12-13],根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到CLA質(zhì)量濃度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗

    2.1.1 接種量的影響

    圖1 接種量對CLA得率的影響Fig.1 Effect of inoculum amount on the yield of CLA

    如圖1所示,接種量為1%時,CLA得率達到最大值;接種量從1%~2%,CLA得率緩慢降低;接種量從2%~4.5%,CLA得率變化較小,趨于直線??赡苡捎谠诎l(fā)酵液體積相等的情況下,菌體可利用的營養(yǎng)物質(zhì)有限,而菌體生長速度較快,在較短時間內(nèi)即可達到最大值。

    2.1.2 N2排氧的影響

    圖2 N2排氧對CLA得率的影響Fig.2 Effect of oxygen amount on the yield of CLA

    如圖2所示,用高純氮氣驅(qū)除培養(yǎng)液中的氧氣,造成微氧環(huán)境對生成CLA有利。微氧條件可以防止發(fā)酵液中的LA和CLA被氧化,減少因氧化造成的底物和產(chǎn)物損失。

    2.1.3 振蕩培養(yǎng)的影響

    圖3 振蕩培養(yǎng)對CLA得率的影響Fig.3 Effect of shaking on the yield of CLA

    如圖3所示,振蕩培養(yǎng)時,CLA得率較靜止培養(yǎng)高。振蕩過程中,底物L(fēng)A在培養(yǎng)液中分散地更均勻,有利于營養(yǎng)物質(zhì)和LA進入菌體細胞內(nèi)部。

    2.1.4 培養(yǎng)溫度的影響

    圖4 培養(yǎng)溫度對CLA得率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the yield of CLA

    如圖4所示,當(dāng)培養(yǎng)溫度從25℃升高至30℃時,發(fā)酵液中CLA得率逐漸增大;到30℃時,達到最大值;隨著溫度的繼續(xù)升高,CLA生成受到抑制,得率逐漸降低??梢?,較低或較高溫度均不利于CLA的生成。

    2.1.5 培養(yǎng)時間的影響

    圖5 培養(yǎng)時間對CLA得率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the yield of CLA

    如圖5所示,0~24h內(nèi)發(fā)酵液中的CLA含量迅速增加;24~48h內(nèi)CLA得率增加放緩,48h達到最大值;48h后CLA得率又逐漸降低,呈下降趨勢。

    2.1.6 培養(yǎng)基初始pH值的影響

    圖6 培養(yǎng)基初始pH值對CLA得率的影響Fig.6 Effect of initial pH on the yield of CLA

    如圖6所示,pH值在5.5~7.0范圍內(nèi),CLA得率較高,6.0時達到最大值;pH值在4.0、4.5、8.5~10.0范圍內(nèi),基本不能合成CLA。pH值對CLA得率的影響很大,可能是因為pH值在CLA共軛雙鍵的形成過程中對質(zhì)子傳遞過程起決定作用。

    2.1.7 LA質(zhì)量濃度的影響

    圖7 LA質(zhì)量濃度對CLA得率的影響Fig.7 Effect of initial level of linoleic acid on the yield of CLA

    如圖7所示,隨著LA質(zhì)量濃度的增大,CLA得率逐漸增大,CLA轉(zhuǎn)化率逐漸降低。當(dāng)LA質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時,CLA得率達到72.24μg/mL,而轉(zhuǎn)化率較低;LA質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時,轉(zhuǎn)化率最大,達到24.34%。綜合考慮CLA得率和轉(zhuǎn)化率,選取0.2mg/mL進行響應(yīng)面試驗。

    2.1.8 LA添加時間的影響

    圖8 LA添加時間對CLA得率的影響Fig.8 Effect of addition time of LA on the yield of CLA

    如圖8所示,在菌體培養(yǎng)10h后添加LA,CLA得率達到最大值??赡苡捎谂囵B(yǎng)時間過短,菌株生長較弱,LA將影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的利用,抑制其分裂、繁殖;培養(yǎng)時間過長時,發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)迅速減少,LA被當(dāng)作營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用了。

    2.2 響應(yīng)面試驗[14-15]

    2.2.1 回歸方程的檢驗與優(yōu)化

    Box-Behnken設(shè)計對3個因素分為3個水平進行編碼,設(shè)計17組試驗,分為12個析因點和5個零點。其中析因點為自變量,取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點上;零點為區(qū)域的中心點,零點重復(fù)5次,以估計試驗誤差。Box-Benhnken設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果見表2。其中編碼因素取值為A、B、C,分別代表溫度、LA質(zhì)量濃度及pH值。運用Design Expert 6.0對表2的數(shù)據(jù)進行二次回歸分析,回歸分析結(jié)果見表3,得到回歸方程如下:

    表2 Box-Benhnken設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design and experimental results

    表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Significance of coefficients of quadratic regression model

    由表3可知,模型對試驗擬合良好,模型的P<0.0001<0.05,表明該試驗?zāi)P惋@著。失擬項P=0.1169>0.05,說明失擬項檢驗不顯著,方程對試驗的擬合度較好,此方法可靠。其中,pH值0.0001<0.01,表明pH值對CLA得率的影響達到極顯著水平;溫度0.0130<0.05,達到顯著水平。此外,該模型的變異系數(shù)為3.22%,在可接受范圍內(nèi)。

    2.2.2 響應(yīng)面分析圖

    通過多元回歸方程分析得知3個因素及其交互作用對CLA得率的影響。該影響可用響應(yīng)面和等高線表示。圖9~11分別表示溫度和LA質(zhì)量濃度、溫度和pH值、LA質(zhì)量濃度和pH值3個因素對CLA得率的影響。

    響應(yīng)面圖是指在其他因素固定的條件下,響應(yīng)值與試驗中的兩個因素所構(gòu)成的三維曲面圖,可直觀地反映各因素之間的相互作用對響應(yīng)值的影響。由圖10~12可知,3個因素在所選擇范圍之內(nèi)均能產(chǎn)生最佳的響應(yīng)值,說明三因素的選擇及其試驗范圍合理有效。其中,響應(yīng)值隨著三因素的上升而顯著增大,各因素值過高,響應(yīng)值又呈下降趨勢;溫度和LA質(zhì)量濃度的交互作用較顯著,LA質(zhì)量濃度和pH值、溫度和pH值的交互作用較小,近似圓形。

    圖9 溫度和LA質(zhì)量濃度對CLA得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots showing the interactive effects of fermentation temperature and LA concentration on the yield of CLA

    圖10 溫度和pH值對CLA得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots showing the interactive effects of fermentation temperature and pH on the yield of CLA

    圖11 LA質(zhì)量濃度和pH值對CLA得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots showing the interactive effects of LA concentration and pH on the yield of CLA

    2.2.3 最優(yōu)工藝條件

    由Design軟件可得CLA得率的最佳工藝條件:溫度29.35℃、LA質(zhì)量濃度0.209mg/mL、初始pH6.31,此條件下,CLA理論得率為45.326μg/mL。為檢驗RSM法的可靠性,在最佳條件下進行驗證實驗。考慮實際操作,將最佳條件修正為:溫度30℃、LA質(zhì)量濃度0.21mg/mL、初始pH6.3。此條件下,進行3次驗證實驗,CLA平均得率為44.77μg/mL,與理論預(yù)測值基本相符,說明該回歸方程能較真實的模擬三因素對CLA得率的影響。

    3 結(jié) 論

    本實驗對植物乳桿菌lp15-2-1生長細胞轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的基本特性進行了研究。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過Design expert 6.0軟件采用Box-Benhnken試驗設(shè)計法對植物乳桿菌產(chǎn)共軛亞油酸的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明,培養(yǎng)溫度、初始pH值、LA質(zhì)量濃度對共軛亞油酸得率有顯著影響。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的條件為:溫度30℃、LA質(zhì)量濃度0.21mg/mL、初始pH6.3,此條件下,CLA的實際得率為44.77μg/mL,轉(zhuǎn)化率為21.32%,與優(yōu)化前轉(zhuǎn)化率(7.78%)相比,有了很大提高,說明該響應(yīng)面模型可優(yōu)化CLA發(fā)酵工藝條件。

    [1] PARODI P W. Conjugated octadecadienoic acids of milk fat[J]. Journal of Dairy Science, 1977, 60(10):1550-1553.

    [2] BRITTON M, FONG C, WICKENS D, et al. Diet as a source of phospholipid esterified 9, 11-octadecadienoic acid in humans[J]. Clinlical Sscience, 1992, 83(1):97-101.

    [3] SHULTZ T D, CHEW B P, SEAMAN W R. Differential stimulatory and inhibitory responses of human MCF-7 breast cancer cells to linoleic acid and conjugated linoleic acid in culture[J]. Anticancer Research,1992, 12(6B):2143-2145.

    [4] HA Y L, GRIMM N K, PARIZA M W. Anticarcinogens from fried ground beef:heat-altered derivatives of linoleic acid[J]. Carcinogenesis,1987, 8(12):1881-1887.

    [5] 劉佩, 沈生榮, 阮暉, 等. 共軛亞油酸的生理學(xué)功能及健康意義[J].中國糧油學(xué)報, 2009, 24(6):161-165.

    [6] GANGIDI R R, PROCTOR A. Photochemical production of conjugated linoleic acid from soybean oil[J]. Lipids, 2004, 39(6):577-582.

    [7] LIN T Y, LIN C W, WANG Y J. Linoleic acid isomerase activity in enzyme extracts fromLactobacillus acidophilusandPropionibacterium freudenreichiissp.Shermanii[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(4):1502-1505.

    [8] 邵群, 張慧, 邊際, 等. 乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生共軛亞油酸條件的研究[J].山東師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2010, 16(4):443-446.

    [9] KIM Y J, LIU R H. Increase of conjugated linoleic acid content in milk by fermentation with lactic acid bacteria[J]. Journal of Food Science,2002, 67(5):1731-1737.

    [10] ALONSO L, CUESTA E P, GILLILAND S E. Production of free conjugated linoleic acid byLactobacillus acidophilusandLactobacillus caseiof human intestinal origin[J]. Journal of Dairy Science, 2003, 86(6):1941-1946.

    [11] 張中義. 植物乳桿菌轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

    [12] PARIZA M W, YANG X Y. Method of producing conjugated fatty acids:USA, 6060304[P]. 2000-05-09.

    [13] 劉佩, 周倩, 沈生榮, 等. 產(chǎn)共軛亞油酸植物乳桿菌的篩選、鑒定與誘變[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(9):135-139.

    [14] 王根女, 蘇平, 黃愷婷, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取紫蘇葉多酚物質(zhì)[J]. 中國食品學(xué)報, 2009, 9(5):87-92.

    [15] 朱鳳妹, 杜彬, 李軍, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉3.481產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵工藝的研究[J]. 中國食品學(xué)報, 2009, 9(5):35-42.

    Optimization of Fermentation Conditions for Producing Conjugated Linoleic Acid inLactobacillus plantarumlp15-2-1 by Response Surface Analysis

    ZHOU Qian,LIU Pei,MA Liu-liu,RUAN Hui,HE Guo-qing*(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

    Q815

    A

    1002-6630(2010)21-0195-05

    2010-02-06

    國家“863”計劃重點項目(2007AA100402)

    周倩(1986—),女,碩士研究生,研究方向為食品科學(xué)。E-mail:zyq04010@163.com

    *通信作者:何國慶(1957—),男,教授,博士,研究方向為食品微生物與發(fā)酵工程。E-mail:gqhe@zju.edu.cn

    猜你喜歡
    亞油酸共軛響應(yīng)值
    一個帶重啟步的改進PRP型譜共軛梯度法
    一個改進的WYL型三項共軛梯度法
    基于熒光光譜技術(shù)的不同食用淀粉的快速區(qū)分
    巧用共軛妙解題
    一種自適應(yīng)Dai-Liao共軛梯度法
    NH3和NaCl對共軛亞油酸囊泡化的影響
    提高環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性初探
    紫外熒光法測硫各氣路流量對響應(yīng)值的影響
    山東化工(2019年1期)2019-01-24 03:00:16
    冷凍丙酮法提取山核桃油中的亞油酸和亞麻酸
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:37:06
    超聲場中亞油酸共軛反應(yīng)的動力學(xué)
    午夜精品一区二区三区免费看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 精品久久久噜噜| 嫩草影院新地址| 日韩中字成人| 最近中文字幕2019免费版| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 男女边吃奶边做爰视频| 边亲边吃奶的免费视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产片特级美女逼逼视频| 精品午夜福利在线看| 国产黄色免费在线视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 成年女人在线观看亚洲视频 | 九九爱精品视频在线观看| 久久久久久久精品精品| 免费观看av网站的网址| 国产91av在线免费观看| 18禁在线播放成人免费| 亚洲欧洲国产日韩| 人妻一区二区av| 麻豆成人午夜福利视频| 国产成人91sexporn| 日韩欧美一区视频在线观看 | 日韩制服骚丝袜av| 不卡视频在线观看欧美| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费黄网站久久成人精品| 久久97久久精品| 欧美性感艳星| 色5月婷婷丁香| 亚洲精品第二区| 天美传媒精品一区二区| 插逼视频在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 国产乱来视频区| xxx大片免费视频| 日韩电影二区| 精品久久久精品久久久| 色吧在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 黄色欧美视频在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 欧美xxⅹ黑人| 国产高清三级在线| 在线 av 中文字幕| 国产男女内射视频| 国产乱人视频| 亚洲精品一区蜜桃| 丝袜脚勾引网站| 搡老乐熟女国产| 日韩中字成人| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩成人伦理影院| 极品少妇高潮喷水抽搐| 熟女人妻精品中文字幕| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲伊人久久精品综合| 成年版毛片免费区| 成年免费大片在线观看| 一本一本综合久久| 777米奇影视久久| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产永久视频网站| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品伦人一区二区| 久久韩国三级中文字幕| 少妇人妻久久综合中文| 国产成人精品福利久久| tube8黄色片| 国产乱来视频区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 天天躁日日操中文字幕| 一级av片app| av卡一久久| av国产免费在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 成人美女网站在线观看视频| 国产淫片久久久久久久久| 在线观看国产h片| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费av不卡在线播放| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色5月婷婷丁香| 如何舔出高潮| 婷婷色综合www| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 97超碰精品成人国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 十八禁网站网址无遮挡 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99re6热这里在线精品视频| 极品教师在线视频| 春色校园在线视频观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩人妻高清精品专区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 免费黄频网站在线观看国产| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久97久久精品| 亚洲内射少妇av| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 人体艺术视频欧美日本| 国产精品一二三区在线看| 老司机影院成人| 大片免费播放器 马上看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲精品乱久久久久久| 蜜臀久久99精品久久宅男| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲国产精品国产精品| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 在线观看一区二区三区| 人妻一区二区av| 中国美白少妇内射xxxbb| 联通29元200g的流量卡| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美zozozo另类| 久久久精品94久久精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产永久视频网站| 欧美日韩视频精品一区| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲伊人久久精品综合| 国产男女内射视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 卡戴珊不雅视频在线播放| 在线免费十八禁| 久久精品国产a三级三级三级| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 男女无遮挡免费网站观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 丝袜喷水一区| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美高清性xxxxhd video| 97精品久久久久久久久久精品| 久久韩国三级中文字幕| 久久久久久久精品精品| 综合色丁香网| 国产男人的电影天堂91| 成年女人看的毛片在线观看| 日韩国内少妇激情av| 国产成人a区在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲国产成人一精品久久久| 午夜激情福利司机影院| 亚洲av成人精品一二三区| 久久精品国产自在天天线| h日本视频在线播放| 中文字幕免费在线视频6| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日日啪夜夜撸| 交换朋友夫妻互换小说| 精品酒店卫生间| 亚洲图色成人| 99久久人妻综合| 99热全是精品| 人妻少妇偷人精品九色| 精品久久久精品久久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| av播播在线观看一区| 国产乱人视频| 搞女人的毛片| 国产乱人偷精品视频| 91精品国产九色| 免费在线观看成人毛片| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产精品伦人一区二区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久久性生活片| 久久精品夜色国产| 性色av一级| 六月丁香七月| 久久99热这里只频精品6学生| av在线播放精品| 色视频在线一区二区三区| 深爱激情五月婷婷| 嫩草影院精品99| 激情 狠狠 欧美| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 中文天堂在线官网| 国产免费福利视频在线观看| 欧美精品一区二区大全| 中文天堂在线官网| 三级经典国产精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 视频中文字幕在线观看| 黄片wwwwww| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 只有这里有精品99| 一个人看视频在线观看www免费| 久久鲁丝午夜福利片| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 嫩草影院精品99| 亚洲熟女精品中文字幕| 免费观看a级毛片全部| 日本免费在线观看一区| 久久久久久久久久久免费av| 欧美三级亚洲精品| 久久久久性生活片| a级毛色黄片| 国产淫语在线视频| 色网站视频免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 成人特级av手机在线观看| 久久久色成人| 日本三级黄在线观看| 中文资源天堂在线| 欧美xxⅹ黑人| 男女下面进入的视频免费午夜| 有码 亚洲区| 六月丁香七月| 99热6这里只有精品| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 少妇高潮的动态图| 街头女战士在线观看网站| 夫妻午夜视频| 在线 av 中文字幕| 夜夜爽夜夜爽视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品无大码| 国产黄a三级三级三级人| 国产亚洲精品久久久com| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 大陆偷拍与自拍| 一区二区av电影网| 一区二区三区免费毛片| 国产一级毛片在线| 欧美日本视频| 在线看a的网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久热久热在线精品观看| 特级一级黄色大片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 色视频在线一区二区三区| 国产视频内射| 午夜免费观看性视频| 国产高潮美女av| 一本色道久久久久久精品综合| 国产免费视频播放在线视频| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲国产精品999| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 激情五月婷婷亚洲| 人妻系列 视频| 色5月婷婷丁香| 中文字幕av成人在线电影| 男女边吃奶边做爰视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲av成人精品一区久久| 永久网站在线| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产乱人偷精品视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品午夜福利在线看| 日本一二三区视频观看| av在线app专区| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲av.av天堂| 国产精品熟女久久久久浪| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 老司机影院毛片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品久久久精品久久久| 涩涩av久久男人的天堂| 成人免费观看视频高清| 久久久亚洲精品成人影院| 又大又黄又爽视频免费| 久久久久久久精品精品| 麻豆乱淫一区二区| 国产在线男女| 日韩欧美 国产精品| 久久久久久久久大av| 一二三四中文在线观看免费高清| 中文字幕免费在线视频6| 欧美最新免费一区二区三区| 日韩精品有码人妻一区| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 日本午夜av视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 又大又黄又爽视频免费| 91久久精品国产一区二区成人| 一级av片app| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久久久久久精品精品| 又爽又黄无遮挡网站| 国产毛片a区久久久久| 精品久久久久久久久亚洲| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲性久久影院| 日日啪夜夜撸| 观看美女的网站| 美女高潮的动态| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产黄片美女视频| 26uuu在线亚洲综合色| 免费电影在线观看免费观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品蜜桃在线观看| 色综合色国产| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲四区av| 看黄色毛片网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 综合色av麻豆| 女人被狂操c到高潮| 三级经典国产精品| 亚洲av.av天堂| 久久久久网色| 18+在线观看网站| 日韩欧美精品v在线| 国产精品女同一区二区软件| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 如何舔出高潮| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲,一卡二卡三卡| 水蜜桃什么品种好| 国产v大片淫在线免费观看| 网址你懂的国产日韩在线| av在线蜜桃| 精品一区二区免费观看| 一本久久精品| 中文字幕久久专区| 亚洲av中文av极速乱| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品国产三级国产专区5o| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产黄频视频在线观看| 69av精品久久久久久| 午夜免费观看性视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 在线观看美女被高潮喷水网站| 人妻系列 视频| 亚洲最大成人中文| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 99久国产av精品国产电影| 精品久久久噜噜| 老司机影院成人| av国产久精品久网站免费入址| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲经典国产精华液单| 久久久久久伊人网av| 嫩草影院入口| 真实男女啪啪啪动态图| 午夜福利在线观看免费完整高清在| av免费在线看不卡| 久久久久网色| 国产成人午夜福利电影在线观看| 中文天堂在线官网| 国产男人的电影天堂91| 免费黄色在线免费观看| 搞女人的毛片| 日本色播在线视频| 嫩草影院新地址| 熟妇人妻不卡中文字幕| 黄色一级大片看看| 成人国产av品久久久| 人人妻人人看人人澡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 大片电影免费在线观看免费| 国产淫片久久久久久久久| 青春草视频在线免费观看| 日韩欧美 国产精品| 久久久久久久久大av| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品国产自在天天线| 久久热精品热| 欧美精品一区二区大全| 国产精品.久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产av国产精品国产| 国产久久久一区二区三区| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲综合色惰| 99久国产av精品国产电影| 日韩在线高清观看一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 午夜精品国产一区二区电影 | 午夜福利在线观看免费完整高清在| 免费av毛片视频| 能在线免费看毛片的网站| 可以在线观看毛片的网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 美女cb高潮喷水在线观看| 人妻 亚洲 视频| 黄片wwwwww| 春色校园在线视频观看| 秋霞伦理黄片| 亚洲天堂av无毛| 亚洲va在线va天堂va国产| 日韩电影二区| 中文欧美无线码| 久久午夜福利片| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲欧洲国产日韩| 禁无遮挡网站| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩欧美精品v在线| 一级毛片我不卡| 联通29元200g的流量卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 又爽又黄a免费视频| freevideosex欧美| 久久午夜福利片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲欧美精品专区久久| 禁无遮挡网站| 免费看光身美女| 观看美女的网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 婷婷色麻豆天堂久久| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲av免费在线观看| 国产视频内射| 尾随美女入室| 国产一区二区在线观看日韩| 在线 av 中文字幕| 亚洲最大成人中文| 精品久久国产蜜桃| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产精品国产三级专区第一集| videossex国产| 99re6热这里在线精品视频| 777米奇影视久久| 久热久热在线精品观看| 男人舔奶头视频| videossex国产| 在线精品无人区一区二区三 | 国产成年人精品一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产高潮美女av| 久久午夜福利片| 天天一区二区日本电影三级| 色哟哟·www| 国产成人a区在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 国产高清不卡午夜福利| 一级毛片电影观看| 老女人水多毛片| 五月伊人婷婷丁香| 97精品久久久久久久久久精品| 国产av码专区亚洲av| 久久97久久精品| 国产精品国产av在线观看| 亚州av有码| 欧美 日韩 精品 国产| 国产极品天堂在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费av不卡在线播放| 超碰av人人做人人爽久久| 中文资源天堂在线| 日韩av免费高清视频| 黄片wwwwww| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美xxxx性猛交bbbb| 简卡轻食公司| 观看美女的网站| 久久久精品免费免费高清| 少妇人妻 视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产成人精品久久久久久| 男男h啪啪无遮挡| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品久久久久久久久免| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲欧美成人精品一区二区| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲av成人精品一二三区| 如何舔出高潮| av在线观看视频网站免费| 少妇 在线观看| 日韩欧美 国产精品| 最后的刺客免费高清国语| 精品少妇黑人巨大在线播放| 在线观看国产h片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲av福利一区| 国产乱人偷精品视频| 婷婷色综合大香蕉| 女人被狂操c到高潮| 久久久亚洲精品成人影院| 一本一本综合久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲伊人久久精品综合| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 看免费成人av毛片| 97在线视频观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲精品456在线播放app| 日本与韩国留学比较| 国产中年淑女户外野战色| 在线a可以看的网站| 亚洲精品色激情综合| 久久久久久久大尺度免费视频| 精品人妻视频免费看| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 简卡轻食公司| 高清午夜精品一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品99久久久久久久久| 97在线视频观看| 国产色婷婷99| 免费av毛片视频| av在线app专区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 18禁动态无遮挡网站| 精品人妻视频免费看| 免费看日本二区| 国产精品国产三级专区第一集| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美三级亚洲精品| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品.久久久| 美女内射精品一级片tv| 久久久久国产网址| 99九九线精品视频在线观看视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 在线 av 中文字幕| 天堂中文最新版在线下载 | 乱码一卡2卡4卡精品| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲天堂国产精品一区在线| 高清日韩中文字幕在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲欧洲国产日韩| 九九爱精品视频在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 国产久久久一区二区三区| 免费av毛片视频| 亚洲精品一区蜜桃| 欧美zozozo另类| 国产成人一区二区在线| 嫩草影院精品99| 日韩成人伦理影院| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产av不卡久久| 日韩视频在线欧美| 欧美精品国产亚洲| 国产成人a区在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩一区二区视频免费看| 七月丁香在线播放| 中文字幕久久专区| 综合色av麻豆| 熟女av电影| 亚洲,一卡二卡三卡| 免费av观看视频| 国产一区二区在线观看日韩| 久久精品国产亚洲av天美| 精品国产三级普通话版| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 午夜精品一区二区三区免费看| 久久人人爽人人爽人人片va| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久久精品94久久精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 久久午夜福利片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品熟女久久久久浪| 久久久亚洲精品成人影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 激情 狠狠 欧美| 黄色配什么色好看| 最近手机中文字幕大全|