金黃色葡萄球菌脈沖磁場殺菌實驗、生物學(xué)窗效應(yīng)及其失活動力學(xué)

許審時，馬海樂,2,*

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013，2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

金黃色葡萄球菌脈沖磁場殺菌實驗、生物學(xué)窗效應(yīng)及其失活動力學(xué)

許審時1，馬海樂1,2,*

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013，2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

以金黃色葡萄球菌為對象，研究磁場強度、脈沖數(shù)和樣品溫度對殺菌效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨磁場強度的增加，金黃色葡萄球菌殘留率總體呈下降趨勢，其中磁場強度3.5T時殺菌效果最好；活菌殘留率隨脈沖數(shù)的增加而降低，在20個脈沖數(shù)時達到最低，之后殘留率趨于穩(wěn)定；溫度對殺菌效果有一定的協(xié)同促進作用。研究得到了脈沖磁場殺菌的最優(yōu)條件為：磁場強度3.5T、脈沖數(shù)20個、樣品溫度30℃，此條件下金黃色葡萄球菌殘留率為7.29%。在本實驗中，金黃色葡萄球菌ATCC25923的脈沖磁場殺菌效果表現(xiàn)出生物學(xué)窗效應(yīng)：脈沖數(shù)的窗值為20；當(dāng)脈沖數(shù)為20時，磁場強度的窗值IW符合如下遞推關(guān)系：IW(n)=n(9－n)/4－1(n為“強度窗”的出現(xiàn)序次，n=1、2、3)。通過分析Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型決定系數(shù)(R2)表明，Gelow模型最好地擬合了脈沖磁場作用下金黃色葡萄球菌殘留率動力學(xué)變化。

脈沖磁場；金黃色葡萄球菌；殺菌；窗效應(yīng)；動力學(xué)

Abstract：The sterilization effect of pulsed magnetic field treatment onStaphylococcus aureuswas examined under different levels of field intensity, pulse number and bacterial suspension temperature. As field intensity increased, the residual survival rate ofStaphylococcus aureusgenerally tended to decrease and the best sterilization effect was observed at a filed intensity of 3.5 T. The effect of pulse number on the residual survival rate of this strain was similar to that of field intensity, and the residual survival rate of this strain reached its minimum after 20 pulses were completed, and then tended to be unchanged with increasing pulse number. Additionally, environmental temperature had a synergistic promoting effect on the inactivation ofStaphylococcus aureus. The above results demonstrate that the optimal levels of field intensity, pulse number and bacterial suspension temperature for sterilizingStaphylococcus aureuswere 3.5 T, 20 and 30℃, respectively. The percentage of residual viable cells was 7.29%under these conditions. The sterilization of pulsed magnetic field onStaphylococcus aureusdisplayed a biological window effect.The window value of field intensity under 20 pulse number and 20 window value of pulse number accorded with the following recurrence formula:IW(n)=n(9－n)/4－1 (nis appearing sequence of the window value of field intensity,n=1, 2 and 3). The comparative analysis of correlation coefficients (R2) of the Gelow, the Weibull and the Hulsheger models indicates that the Gelow model is the best model describing the dynamic change of percentage of residual viableStaphylococcus aureuscells during pulsed magnetic field treatment.

Key words：pulsed magnetic field；Staphylococcus aureus；sterilization；biological window effect；dynamics model

目前，食品工業(yè)中主要的殺菌方式是熱殺菌，如傳統(tǒng)的巴氏殺菌、高溫短時、超高溫等殺菌技術(shù)。但大多熱殺菌技術(shù)存在破壞食品色澤、滋味及功能等問題，既能保證食品安全又能保持固有的營養(yǎng)成分的非熱殺菌技術(shù)已成為食品工業(yè)的研究熱點，大量研究表明，脈沖磁場技術(shù)殺菌效果顯著，是一種有前途的非熱殺菌技術(shù)[1-5]，不過脈沖磁場殺菌技術(shù)的機理研究還非常欠缺。為此，本實驗以食品中常見的金黃色葡萄球菌為研究對象，研究殺菌操作參數(shù)對金黃色葡萄球菌殺滅效果的影響，進一步探討脈沖磁場(pulsed magnetic field，PMF)殺菌的生物學(xué)窗效應(yīng)、研究動力學(xué)模型。

1 材料與方法

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)ATCC25923由中國微生物研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

脈沖磁場殺菌設(shè)備 自行研制(專利號ZL0322055111)；LZ- 610H型特斯拉計 湖南婁底市聯(lián)眾科技有限公司；WFJ7200型分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司；QYC-211型恒溫培養(yǎng)搖床 上海?，斣囼炘O(shè)備有限公司；YX1400Z型電熱蒸汽壓力消毒器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SHZ-88A型恒溫水浴振蕩器 太倉市試驗設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數(shù)測定

參照GB/T 4789.12—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》進行。

1.3.2 金黃色葡萄球菌生長曲線測定

參照文獻[6]進行。

1.3.3 脈沖磁場殺菌

脈沖磁場殺菌設(shè)備場度范圍為0.66～4.0T。磁場強度可通過調(diào)節(jié)充電電壓進行調(diào)節(jié)，并用特斯拉計進行測量。殺菌時將菌液放入殺菌室內(nèi)，接通電源，調(diào)整電壓到需要值，進行充電，當(dāng)電容兩端電壓達到規(guī)定的放電電壓時，進行放電，完成一個脈沖數(shù)的殺菌。之后讓脈沖磁場發(fā)生器停止工作30s，以削弱焦耳熱導(dǎo)致螺旋線圈的溫度升高，然后再進行下一次的殺菌實驗。完成殺菌處理后，取出樣品，將菌液搖勻后進行殺菌效果的檢驗。

每一次實驗取1mL菌液，保持初始菌液中金黃色葡萄球菌的菌濃在106～107CFU/mL之間，將菌液加入盛有9mL生理鹽水的離心管中，將離心管放入殺菌室進行殺菌處理。

1.3.4 殺菌效果檢驗

采用平板菌落計數(shù)法統(tǒng)計金黃色葡萄球菌殘留率來檢測殺菌效果。金黃色葡萄球菌殘留率按式(1)計算。

式中：N為殺菌后菌液中金黃色葡萄球菌數(shù)；N0為殺菌前菌液中金黃色葡萄球菌數(shù)。

根據(jù)公式計算得出的殘留率研究金黃色葡萄球菌生長時期、磁場強度、脈沖數(shù)及樣品溫度對脈沖磁場殺菌效果的影響。

1.3.5 金黃色葡萄球菌殺菌動力學(xué)模型

受脈沖磁場處理，金黃色葡萄球菌活性變化的動力學(xué)過程用Gelow模型[7]、Weibull模型[8]和Hulsheger模型[9]進行擬合。

式中：S=N/N0，N0和N分別是PMF處理前后活菌的數(shù)量/(CFU/mL)；t為處理時間/s，在本實驗中用脈沖數(shù)代表；D為十進制減少時間。

式中：bt為回歸系數(shù)；tc為PMF處理的臨界時間，本實驗中為臨界脈沖數(shù)；t為處理時間/s，在本實驗中用脈沖數(shù)代表。

式中：a和b分別是比例因子(scale factor)和形狀因子(shape factor，b＜1時存活率曲線呈凹形，b＞1時存活率曲線呈凸形，b=1時存活率曲線呈線性)；t為處理時間，在本實驗中用脈沖數(shù)代表。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌脈沖磁場殺菌效果的研究

2.1.1 金黃色葡萄球菌生長時期對殺菌效果的影響

圖1 金黃色葡萄球菌的生長曲線Fig.1 Growth curve ofStaphylococcus aureus

如圖1所示，金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)時間0～1.5h為延遲生長期，1.5～16h為對數(shù)生長期，從16h起進入穩(wěn)定生長期與衰亡期。課題組的相關(guān)實驗研究表明，處于對數(shù)生長期的微生物對高強度脈沖磁場輻射最為敏感[2]，尤其是對數(shù)生長期的中期，因此后續(xù)實驗采用的金黃色葡萄球菌都是處于對數(shù)生長期中期8h的菌株。

2.1.2 磁場強度對殺菌效果的影響

圖2 磁場強度對脈沖磁場殺菌效果的影響Fig.2 Effect of magnetic field intensity onStaphylococcus aureusinactivation

在脈沖數(shù)分別為10、20、30，樣品溫度30℃，pH7.0的條件下，不同磁場強度對殺菌效果的影響如圖2所示。在不同的脈沖數(shù)下，隨著磁場強度增加，金黃色葡萄球菌的活菌殘留率整體呈下降趨勢，尤其重要的是當(dāng)磁場強度為某些特定值時，殘留率表現(xiàn)出低于其兩側(cè)磁場強度下殘留率的變化規(guī)律，并且殘留率的波動呈現(xiàn)一種規(guī)律性，即谷值呈現(xiàn)出遞推關(guān)系，這一現(xiàn)象符合電磁波生物學(xué)窗效應(yīng)的特征，該效應(yīng)是指生物體只有受特定頻率參數(shù)與特定強度參數(shù)恰當(dāng)組合的電磁波作用時才能產(chǎn)生最佳作用效果的一種生物學(xué)現(xiàn)象[10]。脈沖磁場殺菌的生物學(xué)窗效應(yīng)在本課題組的研究中多次出現(xiàn)過[1-5]。在本研究中，相同磁場強度下，脈沖數(shù)為20時，殺菌效果最好；當(dāng)脈沖數(shù)為20時，1、2.5T和3.5T是3個強度的窗值IW。

IW符合如下遞推關(guān)系：IW(n)=n(9－n)/4－1

式中：n為“強度窗”的出現(xiàn)序次，n=1、2和3。其中，當(dāng)n=3時，即磁場強度為3.5T，殺菌效果最好。

脈沖磁場殺菌的強度窗效應(yīng)發(fā)生的機理尚在探索之中。

2.1.3 脈沖數(shù)對殺菌效果的影響

在磁場強度分別為1.0、2.5、3.5T，樣品溫度30℃、pH7.0的條件下，脈沖數(shù)變化對金黃色葡萄球菌殺菌效果的影響如圖3所示。隨著脈沖數(shù)的增大，不同磁場強度下的金黃色葡萄球菌殘留率均呈現(xiàn)降低趨勢，隨著脈沖數(shù)的進一步增加，活菌殘留率趨于穩(wěn)定。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是細胞膜在瞬時脈沖周期性反復(fù)作用下，使離子容易穿過細胞膜，導(dǎo)致細胞膨脹，細胞膜變薄，而引起微孔迅速變大[11-12]。當(dāng)脈沖數(shù)持續(xù)增加，一旦超過細胞膜所能承受的臨界壓力時，可造成胞內(nèi)物質(zhì)外噴，將導(dǎo)致細胞膜發(fā)生不可修復(fù)的破裂，即出現(xiàn)電穿孔[13]。雖然脈沖數(shù)的窗效應(yīng)不像強度窗效應(yīng)那么明顯，但從圖3還可以看出，脈沖數(shù)的窗值是20。脈沖磁場殺菌中脈沖數(shù)的窗效應(yīng)在本課題組以往的研究中也出現(xiàn)過[1-5]，但其發(fā)生機理也有待探討。

圖3 脈沖數(shù)對脈沖磁場殺菌效果的影響Fig.3 Effect of pulse number onStaphylococcus aureusinactivation

2.1.4 樣品溫度對殺菌效果的協(xié)同作用

圖4 溫度對脈沖磁場殺菌效果的影響Fig.4 Effect of environmental temperature onStaphylococcus aureusinactivation

在磁場強度3.5T、脈沖數(shù)20、pH7.0的條件下，樣品溫度對殺菌效果的影響如圖4所示。隨著溫度的升高，金黃色葡萄球菌殘留率逐漸降低，在30℃以后殺菌效果較好且趨于平緩，而在5～20℃范圍內(nèi)殺菌效果的改善非常顯著，但此溫度遠低于金黃色葡萄球菌的熱致死溫度，說明溫度對脈沖磁場的殺菌效果有協(xié)同作用。金黃色葡萄球菌的最適生長溫度為37℃[15]，一般來講，當(dāng)介質(zhì)溫度處于最適生長溫度范圍內(nèi)時，微生物對脈沖磁場的殺菌處理比較敏感，容易被殺死，而在較低溫度下，殺菌效果不好，可能是由于微生物對不利其生存的環(huán)境表現(xiàn)出的抗逆性。

2.2 金黃色葡萄球菌脈沖磁場殺菌動力學(xué)的研究

由圖3可知，在PMF作用下金黃色葡萄球菌的殘留率變化與代表著殺菌總時間的脈沖數(shù)之間并非線性關(guān)系，因此在PMF作用下活菌殘留率曲線不符合一級動力學(xué)模型。這與其他學(xué)者研究脈沖電場殺菌結(jié)果相一致[9,14]。為了研究PMF作用下金黃色葡萄球菌失活的動力學(xué)特性，用Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型擬合圖3中金黃色葡萄球菌殘留率曲線數(shù)據(jù)的動力學(xué)參數(shù)值。擬合結(jié)果見表1。

表1 Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型擬合的動力學(xué)參數(shù)Table 1 Parameters of Gelow, Weibull and Hulsheger models for percentage of residue viable cells

表1顯示，不同磁場強度下3個模型中，3個磁場強度下Gelow模型擬合金黃色葡萄球菌殘留率的相關(guān)系數(shù)R2均為最高，說明Gelow模型很好的擬合了PMF金黃色葡萄球菌殘留率曲線。

3 結(jié) 論

3.1 磁場強度、脈沖數(shù)、溫度等對脈沖磁場殺菌效果均有一定影響。隨著磁場強度的增大，金黃色葡萄球菌ATCC25923殘留率總體呈下降趨勢，其中3.5T時殺菌效果最好?；罹鷼埩袈孰S脈沖數(shù)的增加也呈現(xiàn)降低趨勢，在20個脈沖時達到最低，之后殘留率趨于穩(wěn)定。溫度對脈沖磁場殺菌具有協(xié)同促進作用。

3.2 在磁場強度3.5T、脈沖數(shù)20個、樣品溫度30℃的條件下，脈沖磁場對金黃色葡萄球菌具有明顯的殺菌效果，殘留率可達7.29%。

3.3 金黃色葡萄球菌的脈沖磁場殺菌在本實驗中表現(xiàn)出生物學(xué)窗效應(yīng)，脈沖數(shù)的窗值為20；當(dāng)脈沖數(shù)為20時，磁場強度的窗值IW符合如下遞推關(guān)系：IW(n)=n(9－n)/4－1(n為“強度窗”的出現(xiàn)序次，n=1、2和3)。

3.4 Gelow模型、Weibull模型和Hulsheger模型中，Gelow模型能夠較好地擬合脈沖磁場殺菌對金黃色葡萄球菌殘留率的動力學(xué)曲線。

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Sterilization and Biological Window Effects of Pulsed Magnetic Field onStaphylococcus aureusand Its Inactivation Dynamics

XU Shen-shi1，MA Hai-le1,2,*
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Jiangsu Provincial Research Center of Agricultural Products Bio-processing and Separation Engineering, Zhenjiang 212013, China)

TS205.9

A

1002-6630(2010)21-0020-04

2010-03-21

國家“863”計劃重點項目(2007AA100405)

許審時(1985—)，男，碩士，主要從事強磁場設(shè)備與強磁場技術(shù)研究。E-mail：xushenshi@163.com

*通信作者：馬海樂(1963—)，男，教授，博士，主要從事食品功能因子及其分離技術(shù)研究。E-mail：mhl@ujs.edu.cn