延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)系 張秋華 張 敏
菌體蛋白飼料富含蛋白質(zhì),還具有一定香味,營養(yǎng)價值較高 (曹鈺等,2007)。由于其具有成本低、原料廣、周期短、產(chǎn)量高等優(yōu)點而成為目前研究的熱點。本試驗以雜粕(豆粕、玉米臍子粕、菜籽粕、棉籽粕)為基質(zhì),利用酵母菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,通過單因素試驗設(shè)計對其發(fā)酵周期、接種量、料水比、溫度、氮源添加量等因素進(jìn)行研究,以確定菌體蛋白飼料的最佳發(fā)酵生產(chǎn)條件。
1.1 材料 雜粕市售,其主要成分為:玉米5%、豆粕20%、玉米臍子粕25%、菜籽粕10%、棉籽粕24%。
高活性干酵母,由某酵母公司提供。
1.2 培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基:葡萄糖2 g,酵母粉0.5 g,蛋白胨 1 g,丙酸鈉 0.25 g,瓊脂 2 g,水 100 mL,pH 4.5。
液體培養(yǎng)基(YPD):葡萄糖 2 g,酵母粉0.5 g,蛋白胨 1 g,水 100 mL,pH 4.5。
斜面培養(yǎng)基:土豆50 g,葡萄糖 5 g,瓊脂5 g,水 250 mL,pH 自然。
1.3 液體菌種培養(yǎng) 取一定量干酵母粉制成懸液,將其稀釋涂單菌落平板,將單菌落挑至含有100 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,在恒溫?fù)u床30℃振蕩培養(yǎng)24 h左右,搖床轉(zhuǎn)速130 r/min,制得酵母懸液含孢量為2.4×108~2.6×108個/mL。后轉(zhuǎn)移到冰箱中備用。
1.4 粗蛋白質(zhì)含量的測定 采用凱氏定氮法。計算公式如下:
粗蛋白質(zhì)含量=[(V2-V0)×N×0.0140×6.25]/[m×(V1/V)]×100%;
式中V0為滴定空白時所需鹽酸溶液體積,mL;V1為試樣分液蒸餾用體積,mL;V2為滴定試樣時所需鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;V為試樣分解液總體積,mL;C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度,mol/L;m 為試樣質(zhì)量,g;0.0140 為 1 mmol氮的克數(shù);6.25為氮的蛋白質(zhì)換算系數(shù)。
2.1 原料的不同處理對粗蛋白質(zhì)含量的影響將固體培養(yǎng)基分成兩組,每組培養(yǎng)基5 g。一組進(jìn)行蒸汽滅菌為熟料(121℃,滅菌20 min),另一組不進(jìn)行任何處理為生料。將酵母菌懸液取1 mL接種于生料和熟料中,加入適量的水分、氮源,在30℃下用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,結(jié)果見表1。表1結(jié)果表明,熟料發(fā)酵后較生料未滅菌發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量明顯增加??赡苁墙?jīng)熱處理后破壞了雜粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子,更易于微生物吸收營養(yǎng)基質(zhì)使其更好地增殖;另外,其內(nèi)部化學(xué)鍵的斷裂也促使雜粕中的營養(yǎng)物質(zhì)最大可能地轉(zhuǎn)化為菌體蛋白。
表1 生料與熟料發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量
2.2 發(fā)酵周期對發(fā)酵效果的影響 見圖1。
圖1 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響
發(fā)酵周期會影響發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量。發(fā)酵周期過短,菌體不能充分生長,導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量過低;發(fā)酵周期過長,生產(chǎn)成本增加,且容易滋生雜菌 (司翔宇等,2005)。圖1結(jié)果表明,通過接種量 4%,料水比 1∶1.2,溫度 30℃,氮源添加量3.5%(1.5%尿素+2.0%硫酸銨)發(fā)酵后,隨著發(fā)酵時間的遞增,菌體蛋白含量呈先上升后又逐漸下降的趨勢,發(fā)酵雜粕(熟料,下同)粗蛋白質(zhì)含量在24 h時含量最高,為56.24%。其原因可能是酵母菌的呼吸作用消耗了部分有機(jī)物而產(chǎn)生了蛋白質(zhì)的“濃縮效應(yīng)”(張紅和西寧,1996),使雜粕中的營養(yǎng)物質(zhì)慢慢被耗竭。
2.3 接種量對發(fā)酵效果的影響 見圖2。接種量過大,會使微生物生長速率過快,營養(yǎng)物質(zhì)很快消耗,并釋放大量的熱能,容易導(dǎo)致溫度過高使菌體失活,同時也增加了生產(chǎn)成本;過小反而容易感染雜菌不利于發(fā)酵。圖2結(jié)果表明,在24 h,料水比1∶1.2,溫度 30℃,氮源添加量 3.5%(1.5%尿素+2.0%硫酸銨)發(fā)酵后,隨著接種量的增加,曲線表現(xiàn)為逐漸上升至最大值后小幅下降,雜粕粗蛋白質(zhì)含量在6%接種量時含量最高,為55.47%。這可能是因為發(fā)酵前期菌體快速增長致使發(fā)酵后期營養(yǎng)供應(yīng)不足,而使菌體產(chǎn)生自溶現(xiàn)象,使菌體蛋白含量下降。
圖2 接種量對發(fā)酵效果的影響
2.4 料水比對發(fā)酵效果的影響 見圖3。
圖3 料水比對發(fā)酵效果的影響
水分的控制在飼料發(fā)酵過程中非常重要,若原料過干,則菌株生長緩慢,得到的產(chǎn)品干枯,無酸香味;若原料水分過大,使料黏結(jié)則造成通氣困難,易使原料腐敗變質(zhì)。圖3結(jié)果表明,通過接種量 6%,24 h,溫度 30℃,氮源添加量3.5%(1.5%尿素+2.0%硫酸銨)發(fā)酵后,雜粕粗蛋白質(zhì)含量在料水比1∶1.4時含量最高,為55.29%。
2.5 溫度對發(fā)酵效果的影響 見圖4。
圖4 溫度對發(fā)酵效果的影響
溫度是影響有機(jī)體存活和生長的重要因素之一。若溫度過高,蛋白質(zhì)可能受到不可逆的破壞,溫度過低又抑制了酶的活性,蛋白質(zhì)的合成速度降低(周德慶,1996)。圖4結(jié)果表明,通過接種量6%,料水比 1∶1.4,24 h,氮源添加量 3.5%(1.5%尿素+2.0%硫酸銨)發(fā)酵后,隨著溫度的增加,菌體蛋白含量先小幅度上升,達(dá)到極值后又迅速下降,雜粕粗蛋白質(zhì)含量在30℃時含量最高,為51.63%??赡苡山湍妇磻?yīng)速率逐漸加快,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率明顯上升,隨著溫度繼續(xù)升高酶蛋白變性失活,導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率下降所致。
2.6 氮源添加量對發(fā)酵效果的影響 微生物發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白時,需要較高的氮濃度,以促使微生物盡可能地利用無機(jī)氮源合成蛋白質(zhì)。其來源有兩方面:培養(yǎng)料自身的含氮物質(zhì)和外界加入的含氮物質(zhì)。通常外界加入的氮源對微生物生長有更明顯的作用(Emtiazi等,2003)。本試驗采用混合氮源,氮源配比見表2。
表2 氮源配比%
圖5結(jié)果表明,通過接種量6%,料水比1∶1.4,30℃發(fā)酵24 h后,隨著氮源添加量的增加,蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢。雜粕粗蛋白質(zhì)含量在3.5%(1.5%尿素+2.0%硫酸銨)時含量最高,為57.76%。這可能是由于加入的無機(jī)氮源通過微生物代謝轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì),造成蛋白質(zhì)的絕對數(shù)量大幅度地增加。
圖5 氮源對發(fā)酵效果的影響
本試驗利用酵母菌對雜粕進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)在接種量6%、料水比1∶1.4、氮源添加量3.5%(1.5%尿素+2.0%硫酸銨)、溫度 30℃、發(fā)酵24 h的條件下,發(fā)酵終產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到57.76%,比發(fā)酵前(即空白對照組)提高了18.82個百分點 (即粗蛋白質(zhì)的提高率為48.33%),效果較理想。但有關(guān)發(fā)酵雜粕對動物生理和生產(chǎn)性能的影響有待進(jìn)一步研究。
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