大球蓋菇黃酮類化合物提取及抑菌性研究

陳君琛, 李怡彬, 吳 俐, 周學劃, 段永剛, 賴譜富

(福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,福建福州 350003)

大球蓋菇(Stropharia rugoso-annulataFarlow),又名皺環(huán)球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅色球蓋菇[1],其營養(yǎng)豐富,人工容易栽培,是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)向發(fā)展中國家推薦栽培的食用菌之一[2].黃酮類化合物是指中央三碳原子與兩個具有酚羥基的苯環(huán)(A-環(huán)與 B-環(huán))相互連接所形成的一系列化合物[3],易溶于甲醇、乙醇、水等極性溶劑中,不易溶于氯仿、苯等有機溶劑.黃酮類化合物的基本骨架是 C6—C3—C6,在植物界分布非常廣泛,是一種對人體非常有用的活性物質(zhì),是許多藥品和保健品的主要成分,它具有殺蟲、抗病毒、保護心腦血管系統(tǒng)和袪痰的生理活性[4-5].人們對黃酮類化合物的抑菌性做了實驗研究,結(jié)果表明,一些植物的黃酮類化合物有很好的抑菌效果,如從大豆中提取的大豆異黃酮化合物對芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、梨頭霉菌和米曲霉都有很好的抑制作用[6].目前對大球蓋菇主要集中在營養(yǎng)成分分析和多糖生理活性方面的研究[7-8],在黃酮類化合物方面的研究是在抗氧化方面[9],對其在抑菌性方面的研究至今未見報道.本文通過正交試驗對大球蓋菇黃酮類化合物提取工藝進行優(yōu)化,并對大球蓋菇黃酮類化合物在抑菌性方面進行評價,為大球蓋菇的綜合開發(fā)利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大球蓋菇,采自福建省將樂縣;馬鈴薯,購自福州永輝超市;大腸桿菌、青霉菌、啤酒酵母,福建農(nóng)林大學食品科學學院微生物實驗室提供;瓊脂糖粉,青島瓊脂制造公司;牛肉粉,阜陽雙旋生物制品廠;蔗糖,天津大茂化學試劑廠;蘆丁標準品,北京市化學試劑廠;硝酸鋁、亞硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、甲醇、乙酸乙脂等均為分析純試劑.

1.2 儀器與設(shè)備

GFSJ-8型高效粉碎機,無錫寶輝機械制造有限公司;756P型紫外-可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司;1601AMP8-1型電子天平,日本島津公司;HH-6型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;LHS-150SC型恒溫恒濕箱,上海一恒科技有限公司;CA-1480-2型潔凈工作臺,上海凈化設(shè)備廠;LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;85-2A型數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器,江蘇省金壇市榮光儀器制造有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 不同溶劑提取大球蓋菇黃酮類化合物試驗

大球蓋菇黃酮類化合物提取工藝流程:大球蓋菇→60℃烘干→粉碎→過 60目篩→加溶劑提取→抽濾→定容→定量分析.

準確稱取 1.0 g大球蓋菇粉末,分別用水、丙酮、乙酸乙脂、無水乙醇為溶劑,以物料比 1∶60,在60℃的溫度下回流提取 2 h,趁熱抽濾,倒入 100 mL的容量瓶,并用相應(yīng)的溶劑定容到 100mL,即為待測液.然后分別測定不同溶劑樣品中的黃酮含量,獲得黃酮含量最高的溶劑(為乙醇)用于后續(xù)實驗.

1.3.2 標準溶液制備和標準曲線的繪制

用分析天平精確稱取 12.5 mg蘆丁(120℃干燥至恒重),用少量 70%的乙醇在燒杯里微熱溶解,倒入 50mL容量瓶,定容至 50mL,混合均勻后即配成 0.25 g/L的蘆丁標準溶液.取 6個 10mL具塞管,標為 1～6號,分別加入蘆丁標準溶液(0.25 g/L)0.00,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00mL,加入 5%亞硝酸鈉溶液 0.4mL混勻,放置6m in,再加入 10%硝酸鋁溶液 0.4mL,混勻,放置 6m in,最后再加入 1 moL/L氫氧化鈉溶液 4.0mL,用 70%的乙醇補足到刻度,搖勻,放置 15m in.以未加蘆丁標準液者為空白,用分光光度計在 510 nm處測吸光度,得到吸光度A與蘆丁含量Y之間的回歸方程:Y=1.747 4A+0.031(R2=0.999 7).

1.3.3 提取物中黃酮類化合物含量的測定

取 1.3.1待測液 1mL,其他步驟如 1.3.2,測定510 n m處的吸光度,由回歸方程求得黃酮類化合物含量,并按下式計算提取率:

1.3.4 黃酮類化合物優(yōu)化的提取工藝條件的正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上,確定了溶劑提取各影響因素的幾個水平條件;采用 L9(34)正交試驗對乙醇濃度、物料比、提取溫度、提取時間四個影響因素進行探討,以提取率為指標,確定最佳提取條件.用DPS v6.55版對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理.

1.3.5 大腸桿菌培養(yǎng)基的配制

準確稱取牛肉粉10g、瓊脂糖粉 6 g混合后加水1 000mL在電磁爐上加熱溶解,配制備用.

1.3.6 青霉菌、酵母菌培養(yǎng)基的配制

青霉菌、啤酒酵母所使用的培養(yǎng)基配制:將馬鈴薯去皮切成小塊,準確稱取 200 g,加適量的水在電磁爐上煮沸 30m in后,過濾得濾液,準確稱取蔗糖20 g加適量的水溶解,然后將蔗糖溶液和馬鈴薯溶液混合后加水至 1 000mL即可.

1.3.7 培養(yǎng)基的滅菌

將配好的培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋中 121℃滅菌20m in.

1.3.8 菌種的活化

在無菌室的超凈工作臺上將供試菌種接至各自的試管斜面培養(yǎng)基中,放入恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),其中大腸桿菌培養(yǎng)溫度為 37℃,培養(yǎng)時間為 24 h;青霉菌、啤酒酵母菌的培養(yǎng)溫度和時間分別為 29℃、48 h.

1.3.9 濾紙片的制備

用打孔器將濾紙制成若干直徑為 6mm的圓形濾紙片,放入干燥潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi),經(jīng) 121℃濕熱滅菌 20m in,浸入黃酮類化合物溶液以及蒸餾水中 6 h后取出,無菌條件下晾干備用.

1.3.10 菌懸液的制備

在無菌室的超凈工作臺上,用接種環(huán)分別挑取少量活化的菌種放入無菌水中,制成菌體或孢子濃度為 106～107CFU/mL的菌懸液,用振蕩器震蕩均勻,備用.

1.3.11 抑菌作用的測定

選用直徑為 9 cm的培養(yǎng)皿,每皿加大約 15mL經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)基,待冷卻凝固后,放置于培養(yǎng)箱中觀察 24h,然后將有雜菌生長的培養(yǎng)皿廢棄,在無雜菌生長的培養(yǎng)基中每皿加入供試菌懸液 0.5mL,涂布均勻后,用無菌鑷子夾取制備好的濾紙片貼于含菌培養(yǎng)基上,每皿放置 2片,各紙片間的距離均等,每一樣品重復(fù) 3次,倒置培養(yǎng).同時用浸有無菌水的濾紙片作空白對照.青霉菌和啤酒酵母菌在 29℃培養(yǎng) 48h,細菌在 37℃培養(yǎng) 24 h,觀察抑菌圈,用游標卡尺量取各個培養(yǎng)皿的抑菌圈直徑,抑菌圈直徑越大,抗菌活性越強.

1.3.12 不同濃度黃酮類化合物抑菌性的測定

把大球蓋菇黃酮類化合物在無菌條件下配成質(zhì)量濃度為10,20,40 g/L的黃酮溶液,按照 1.3.11的方法測量不同濃度的抑菌圈直徑,得出不同濃度的黃酮類化物抑菌性的強弱.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對大球蓋菇黃酮類化合物提取率的影響

不同溶劑對大球蓋菇黃酮類化合物提率的影響見圖1.

圖 1 溶劑的篩選結(jié)果Fig.1 Results of solvent screening

從圖 1可以看出,水提取率最低,乙醇的提取率最高,丙酮和乙酸乙脂在中間,且乙醇來源容易、經(jīng)濟,因此本試驗選乙醇作為溶劑.

2.2 黃酮類化合物提取工藝的優(yōu)化條件

表 1至表 3分別為黃酮類化合物提取工藝的正交試驗設(shè)計情況、正交試驗結(jié)果和方差分析結(jié)果.

表 1 正交試驗因素水平表 L9(34)Tab.1 Factors and levels of orthogonal exper iment

表 2 正交試驗結(jié)果Tab.2 Results of orthogonalexper iment

表 3 正交試驗方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance results

從表 2可知,A(物料比 )、B(體積分數(shù) )、C(時間)和D(溫度)極差R的大小順序分別是RD＞RC＞RA＞RB,表明溫度對提取率的影響最大,時間次之,物料比的影響位居第三,乙醇的體積分數(shù)影響最小.最佳提取組合為A2B3C1D3,即物料比 1∶90,乙醇體積分數(shù) 95%,時間 120m in,溫度 60℃.

從表 3可看出,提取因素A(物料比)、C(時間)和D(溫度)的F值均達極顯著水平,B(體積分數(shù))的F值達顯著水平,可見各個因素對提取率都有較大的影響.對A2B3C1D3組合進行驗證性試驗,所得的提取率為 7.94‰,高于其他組合,表明A2B3C1D3組確實是本試驗條件下大球蓋菇黃酮類化合物的優(yōu)化提取工藝組合.

2.3 大球蓋菇黃酮類化合物對不同菌的抑制效果

2.3.1 黃酮類化合物溶液對不同菌的抑制效果

表 4列出了黃酮溶液對不同菌的抑菌情況,圖2、圖 3分別為 40 g/L黃酮溶液對大腸桿菌和青霉菌的抑菌效果圖.

表 4 40 g/L黃酮溶液對不同菌種的抑菌圈直徑Tab.4 40 g/L flavonoids solution on the inhibition zone diameter of different bacteria

從表 4抑菌圈直徑的大小可以看出,40 g/L黃酮溶液對這 3種菌的抑制作用的大小為大腸桿菌﹥青霉菌﹥啤酒酵母.

圖 3 40 g/L黃酮溶液對青霉菌的抑菌效果Fig.3 40 g/L flavonoids solution on the antibacterial effects of Penicillium

2.3.2 不同質(zhì)量濃度黃酮類化合物抑菌效果

表 5列出了不同質(zhì)量濃度黃酮溶液對不同菌種的抑菌情況。

表 5 不同質(zhì)量濃度黃酮溶液對不同菌種的抑菌圈直徑Tab.5 D ifferent concentrations flavonoids solution to different bacteria in bacteria circle diameter

從表 5可知,40,20,10 g/L的大球蓋菇黃酮類化合物溶液對大腸桿菌都有抑制作用,且抑制效果差異極顯著.40 g/L的大球蓋菇黃酮類化合物溶液對青霉菌也有抑制作用,20 g/L和 10 g/L對青霉菌沒有抑制作用,大球蓋菇黃酮類化合物對啤酒酵母沒有抑制作用.

3 結(jié) 論

通過比較不同溶劑對大球蓋菇黃酮類化合物提取率大小的影響,發(fā)現(xiàn)乙醇是大球蓋菇黃酮類化合物所選定幾種樣本溶劑中最好的提取溶劑;在單因素試驗的基礎(chǔ)上,分析濃度、物料比、溫度、時間對大球蓋菇黃酮類化合物提取率的影響,運用正交分析法和 DPS軟件進行數(shù)據(jù)處理得到優(yōu)化的提取工藝組合為,溫度 60℃,時間 120 m in,乙醇體積分數(shù)95%,物料比為 1∶90,提取率為 7.94‰;通過用大球蓋菇黃酮類化合物對大腸桿菌、青霉菌、啤酒酵母進行抑菌性研究,結(jié)果表明,大球蓋菇黃酮類化合物對大腸桿菌的抑制效果最好,對青霉菌的抑制作用要弱于大腸桿菌,而對啤酒酵母菌沒有抑制作用.

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