甲硝唑諾氟沙星栓微生物限度檢查方法研究

周修森，李道明

（河南省信陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南信陽 464000）

甲硝唑諾氟沙星栓是河南信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室配制的外用制劑，以甲硝唑和諾氟沙星為主藥、硬脂酸聚烴氧（40）酯為基質(zhì)混合制成的栓劑。其中甲硝唑?qū)Υ蠖鄶?shù)厭氧菌具強(qiáng)大抗菌作用，對阿米巴原蟲和滴蟲也有較強(qiáng)的殺滅作用，諾氟沙星為第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、作用強(qiáng)等特點(diǎn)。臨床用于治療陰道滴蟲、陰道炎，各種阿米巴病及術(shù)后預(yù)防和治療厭氧菌引起的感染等。本文按照《中國藥典》2005年版二部附錄ⅪJ微生物限度檢查法[1]有關(guān)要求，對甲硝唑諾氟沙星栓微生物限度檢查方法的建立進(jìn)行探討。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HTY-Ⅲ智能集菌儀、HTY反復(fù)使用集菌培養(yǎng)器（杭州泰林醫(yī)療器械廠）；YJA型電動勻漿儀（臺州市椒江五星機(jī)械儀器有限公司）；lRH-150B型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；電熱三用水箱（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）；JM3102電子天平（余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備公司）。

1.2 試藥

甲硝唑諾氟沙星栓（規(guī)格：3.4 g，批號：20090311，河南信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供）；大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均購自河南省食品藥品檢驗(yàn)所，菌株傳代數(shù)均為第4代；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：070328）；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：070531）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：070508）；改良馬丁培養(yǎng)基（批號：070302）；膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號：070419）；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號：070520）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：080520）；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號：070620）均為北京三藥科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)；pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：070523，北京三藥科技開發(fā)有限公司）；吐溫-80、硫酸錳為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

分別取經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24 h的大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 ml，經(jīng)25～28℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋成每毫升含菌數(shù)50～100 cfu的菌懸液；取經(jīng)25～28℃培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，用5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸孢子懸液1 ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量，稀釋成與標(biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相當(dāng)?shù)逆咦討乙?，? ml孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋成每毫升含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試品溶液制備[2]

取供試品10 g，加45℃無菌含1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱稀釋液）100 ml，置勻漿儀勻漿，1檔2 min，制成1∶10的供試品溶液。

2.3 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組 常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法分別取供試品溶液1.0、0.5和0.2 ml，注入平皿，分別加50～100 cfu的試驗(yàn)菌，立即傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，按規(guī)定培養(yǎng)及測定其菌落數(shù)；薄膜過濾+中和法取供試品溶液1 ml，加至100 ml 45℃無菌含0.1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱沖洗液）中，濾過，再用沖洗液沖洗3次，每次100 ml，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的試驗(yàn)菌，過濾后取出濾膜，將濾膜沖洗面朝上貼至含有5 ml中和劑（0.1 mol/L的MnSO4）的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，每種試驗(yàn)菌制備2張膜，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～48 h，計(jì)數(shù)。

2.3.2 菌液組 測定加入的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.3.3 供試品對照組 取供試品溶液，按試驗(yàn)組的方法，不加入試驗(yàn)菌，按菌落計(jì)數(shù)法測定供試品本底菌數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對照組 制備供試品溶液和沖洗時，都加入了吐溫-80，選擇稀釋液代替供試品溶液，按試驗(yàn)組常規(guī)法試驗(yàn)。

2.3.5 回收率的測定 計(jì)算公式如下，結(jié)果見表1。

表1 加菌回收率試驗(yàn)結(jié)（%）

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證[3]

2.4.1 試驗(yàn)組 取供試品溶液10 ml，加至250 ml沖洗液中，濾過，再用沖洗液沖洗3次，每次100 ml，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的金黃色葡萄球菌（或銅綠假單胞菌），過濾后，灌注100 ml含有5 ml中和劑的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或膽鹽乳糖培養(yǎng)基），培養(yǎng)18～24 h后，劃線于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（或溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基）的平板上，依照金黃色葡萄球菌（或銅綠假單胞菌）的檢查方法進(jìn)行檢查。

2.4.2 陰性菌對照組 加入菌改為大腸埃希菌，其余操作同試驗(yàn)組。

2.4.3 陽性對照組 取50～100 cfu的金黃色葡萄球菌（或銅綠假單胞菌）加至100 ml含有5 ml中和劑的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或膽鹽乳糖培養(yǎng)基）中，依法培養(yǎng)，按試驗(yàn)組同法檢查。

2.5 結(jié)果

2.5.1 由表1結(jié)果可知，用培養(yǎng)基稀釋法白色念珠菌、黑曲霉菌的加菌回收率可達(dá)到70%，提示可以用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行該供試品的霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)測定；用薄膜過濾+中和劑法培養(yǎng)計(jì)數(shù)，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的加菌回收率均在70%以上，提示可以用該法對細(xì)菌數(shù)進(jìn)行測定。

2.5.2 控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果 試驗(yàn)組、陽性對照組均呈陽性，陰性菌對照組均未檢出陰性菌。試驗(yàn)組呈陽性表明試驗(yàn)菌能夠正常生長；陰性菌對照組未檢出陰性菌表明試驗(yàn)菌對其相對應(yīng)的增菌液或瓊脂培養(yǎng)基具有專屬性。因此，該控制菌檢查可采用薄膜過濾沖洗后，在含有中和劑的增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，依法檢查。

2.6 微生物限度檢查方法的建立

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甲硝唑諾氟沙星栓微生物限度檢查方法為：照微生物限度檢查法（附錄Ⅺ J），取供試品10 g，加45℃無菌含1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，置勻漿儀勻漿，1檔2 min，制成1∶10的供試品溶液。

細(xì)菌數(shù)計(jì)數(shù)測定：取供試品溶液1 ml，加至100 ml 45℃無菌含0.1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，按薄膜過濾法（沖洗量300 ml/膜），將濾膜貼至含有5 ml中和劑（0.1 mol/L的MnSO4）的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，依法測定；霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)測定：取供試品溶液按培養(yǎng)基稀釋法依法測定。

控制菌檢查：取供試品溶液10 ml，加至250 ml 45℃無菌含0.1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，按薄膜過濾法（沖洗量300 ml/膜），灌注含5 ml中和劑的100 ml相應(yīng)培養(yǎng)基，依法檢查。

3 討論

該制劑有較強(qiáng)的抗細(xì)菌作用，消除抑菌成分的有效方法是薄膜過濾，但所制備的供試品溶液必須能順利通過濾膜。硬脂酸聚烴氧（40）酯是一種常用的水溶性基質(zhì)，因其不溶于十四烷酸異丙酯，故不適用十四烷酸異丙酯溶解供試品、pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液萃取分層的 《中國藥典》方法制備供試品溶液。

吐溫-80是一種親水性的表面活性劑，具有增溶和乳化的作用。用含1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作溶劑制備供試品溶液，能提高供試品的溶解性，降低黏稠度，使供試品溶液分散均勻；用含0.1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗液，可減小膜壓力，增加濾過流暢性，縮短操作時間[5]。

利用硫酸錳能與喹諾酮類藥物形成穩(wěn)定的六元環(huán)絡(luò)合物，掩蓋它的活性基團(tuán)的特征，消除細(xì)菌計(jì)數(shù)中喹諾酮類藥物的抑菌性和膜吸附性，可有效減少沖洗液的用量，簡化操作[4]。

稀釋劑和沖洗劑應(yīng)保溫45℃，可增加供試品溶液的均一性和流動性，保證取樣量準(zhǔn)確，同時使濾過容易。

細(xì)菌測定時，若培養(yǎng)后培養(yǎng)基透明度差而不利計(jì)數(shù)，可在100 ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入0.1%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）1 ml（含 0.001%的 TTC），利用細(xì)菌的琥珀酸脫氫酶在其生長繁殖過程中的活化作用，使無色的TTC還原為紅色物質(zhì)，使培養(yǎng)基變紅，易于辨認(rèn)計(jì)數(shù)[6]。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄 93-101.

[2]易大為，陳野，潘強(qiáng).薄膜過濾法在局部給藥制劑微生物限度檢查中的應(yīng)用[J].中國藥事,2008,22(4):342-345.

[3]葉興法,杜燕燕,胡江英.風(fēng)痛靈微生物限度檢查方法的驗(yàn)證[J].西北藥學(xué)雜志,2009,24(2):140-141.

[4]張光華,余立,劉文杰.硫酸錳在幾種喹諾酮類藥物無菌檢查中的應(yīng)用[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2008,9(1):35-38.

[5]劉文杰,江志杰,余立,等.吡咯類抗真菌藥物制劑微生物限度檢查方法的研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2008,5(29):28-30.

[6]葉超,錢維清.2,3,5-三苯基氯化四氮唑濃度對細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)影響的驗(yàn)證[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2007,8(1):66-69.

[7]林冬杰.中藥退黃外洗液中大黃酸的含量測定[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2009,16(4):42-43.