海藻糖對豬精子冷凍真空干燥保存效果的影響

孟祥黔，顧曉龍，吳彩鳳，戴建軍，張廷宇，謝一妮，吳志強，劉亮，馬恒東，張德福

1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，雅安 625014 2 上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106 3 上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室 動物遺傳工程研究室，上海 201106

海藻糖對豬精子冷凍真空干燥保存效果的影響

孟祥黔1,2,3，顧曉龍1,2,3，吳彩鳳2,3，戴建軍2,3，張廷宇2,3，謝一妮1,2,3，吳志強1,2,3，劉亮2,3，馬恒東1，張德福2,3

1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，雅安 625014 2 上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106 3 上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室 動物遺傳工程研究室，上海 201106

豬精子經(jīng)冷凍干燥后，在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)，并借助輔助生殖技術(shù)將其注入豬卵母細(xì)胞后，進一步觀察受精卵的發(fā)育情況。結(jié)果表明：海藻糖組雄原核形成率(68.52%)、卵裂率(59.17%)和囊胚率(19.16%)優(yōu)于EDTA組(64.59%、56.26%和15.62%)和對照組(35.36%、52.33%和8.60%)(P＜0.05)；海藻糖組的冷凍真空干燥豬精子分別在4℃下保存60、120、180 d，雄原核形成率、卵裂率和囊胚率均無顯著差異(P＞0.05)；海藻糖組的冷凍真空干燥豬精子復(fù)水化后孵育1 h和2 h，卵裂率、卵裂率和囊胚率均差異顯著(P＜0.05)；海藻糖處理組與 EDTA處理組中的冷凍真空干燥豬精子分別在 4℃和?20℃下保存后各處理組間精子形態(tài)差異不顯著(P＞0.05)；海藻糖組中B級冷凍真空干燥精子百分?jǐn)?shù)顯著多于EDTA處理組(P＜0.05)。超微結(jié)構(gòu)分析表明，冷凍真空干燥豬精子的損傷主要表現(xiàn)在頂體和頸部的腫脹與缺損、尾部斷裂。

豬精子，冷凍真空干燥，單精子注射

Abstract:After freeze-drying, the ultrastructure of boar sperms was observed by optical and electron microscopy.The in vitro development ability of the sperm was also examined with intracytoplasmic sperm injection(ICSI).The rate of male pronuclear formation was(68.52%), for cleavage(59.17%)and for blastocyst formation(19.16%)of the trehalose group(0.2 mol/L),significantly higher than those of the 50 mmol/L EDTA group(64.59%, 56.26% and 15.62%)and the control group(35.36%, 52.33%and 8.60%)(P＜0.05).After storage for 60, 120 and 180 d at 4°C, no significant difference in the in vitro development was observed(P＞0.05).The male pronuclear, cleavage and blastocyst formation after ICSI with freeze-dried spermatozoa incubated for 1 h was superior than those incubated for 2 h(P＜0.05).No significant differences in the structures after stored at 4°C or ?20°C(P＞0.05)were observed between the trehalose group and EDTA group.The percent of B grade freeze-dried boar spermatozoa in the trehalose group was higher than that of the EDTA group(P＜0.05).Based on the ultrastructure observation, main cryogenic damage in freeze-dried boar spermatozoa was swelling, damage or rupture in the sperm acrosome, neck and tail.

Keywords:boar spermatozoa, freeze-drying, intracytoplasmic sperm injection

早在1949年P(guān)olge等[1]首次發(fā)現(xiàn)甘油對精子具有冷凍保護作用，同時也進行了精子冷凍真空干燥的試驗。以往的研究表明，冷凍真空干燥的精子在復(fù)水化后完全喪失運動能力，不能在自然條件下授精，不具備深入研究的意義。由于冷凍真空干燥保存后的精子具有完整的雄性遺傳物質(zhì)，并隨著胞內(nèi)單精子注射技術(shù)(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的不斷發(fā)展和完善，使這種方法保存的精子能夠成功獲得后代。目前已經(jīng)成功應(yīng)用ICSI技術(shù)使冷凍真空干燥精子獲得發(fā)育正常的胚胎，且已相繼在小鼠[2]、大鼠[3]和及兔[4]等實驗動物上獲得正常后代。在大家畜(尤其是豬)上，冷凍真空干燥精子鮮有報道，僅見 Nakai等技術(shù)獲得發(fā)育良好的胚胎，但移植后流產(chǎn)[5]。

冷凍真空干燥的精子可在4℃條件下長期保存，無需很多冷藏設(shè)備，更容易保存和運輸。然而，目前豬精子冷凍真空干燥技術(shù)尚處于探索階段，國際上至今還沒有一個被認(rèn)可的冷凍真空干燥和復(fù)水化程序。本研究試圖在前人研究基礎(chǔ)上，對豬冷凍真空干燥技術(shù)進行改進，并借助 ICSI技術(shù)和掃描電鏡，探討海藻糖與EDTA在冷凍真空干燥過程中對豬精子的保護效果，以期為提高豬精子乃至哺乳動物精子冷凍真空干燥保存技術(shù)提供一些理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗中，藥品除特殊說明外均購自 Sigma公司。

1.1 豬精液預(yù)處理

豬精液采自上海白豬原種豬場 2～3歲、健康、性欲旺盛的上海白豬 3頭，手握法采集精液，收集精液中段濃厚部分，經(jīng)4層紗布過濾，除去膠狀物。用HARMONY稀釋液在等溫條件下作1:1稀釋，保存于保溫瓶中，2 h內(nèi)運回實驗室。取50 mL豬精液常溫下 600×g離心 10 min，棄上清加入等體積Modena液(23.5 mmol/L檸檬酸鈉、11.9 mmol/L碳酸氫鈉、6.3 mmol/L EDTA-2Na、46.7 mmol/L Tris、15.1 mmol/L檸檬酸、152.6 mmol/L葡萄糖、0.3 mg/mL慶大霉素)，放入 17℃恒溫冰箱中使精子上浮。30 min后，吸取上層10 mL懸浮液移入離心管中，常溫下600×g離心10 min，棄上清后底部沉淀的精子用于以下實驗。向含有精子沉淀的離心管中加入3 mL凍干保護劑(50 mmol/L NaCl+10 mmol/L Tris-HCl+0.2 mol /L海藻糖，pH 8.0，滲透壓為268 mOsm/kg；50 mmol/L NaCl+10 mmol/L Tris-HCl+50 mmol/L EDTA，pH 8.0，滲透壓為 268 mOsm/kg)，保護劑的添加并混勻分為3步，每步添加1 mL凍干保護劑，添加間隔為2 min，以便達(dá)到滲透壓平衡，精子密度為3×108/mL，最后按照100 μL/瓶分裝到安培瓶中。

1.2 豬精子冷凍干燥及復(fù)水化

豬精子冷凍真空干燥：分裝后的安培瓶放入冷凍真空干燥儀中，使精子在?40℃下冷凍8 h，隨后進行冷凍真空干燥，具體參數(shù)如下：步驟Ⅰ：?40℃～?20℃ ， 壓 強 為 7.0 Pa， 冷 凍 速 率 為0.03℃/min，且在?20℃停留 1 h；步驟Ⅱ：?20℃～4℃，壓強不變，冷凍速率為2℃/min，4℃停留1 h。設(shè)定之后對豬精子進行冷凍干燥。最后對安培瓶進行火焰封口，并保存于4℃冰箱中，見圖1A。

冷凍真空干燥豬精子的復(fù)水化：水化前對安培瓶進行斷口，立即添加 100 μL的去離子水，充分混勻。

1.3 頂體染色及分級觀察

考馬斯染色制片：1)取1 mL生理鹽水于1.5 mL離心管中，加入200 μL 精液，立即常溫下離心，9 168×g，15 s(從離心機開始轉(zhuǎn)動時計時)；2)棄上清，加入1 mL 3.7%的多聚甲醛，固定0.5 h，再離心，9 168×g，15 s(從離心機開始轉(zhuǎn)動時計時)；3)棄上清，加入1 mL PBS，再離心，9 168×g，15 s(從離心機開始轉(zhuǎn)動時計時)；4)棄上清，加入50～100 μL PBS，取10 μL 精液于載玻片一頭，用一邊緣整齊的玻片呈35度角將精液樣品均勻拖布于載玻片上，制成精液涂片，自然風(fēng)干；5)將考馬斯亮藍(lán)染液滴于涂片上，染色20 min，用去離子水輕輕沖洗，晾干備檢。

按照精子形態(tài)、精子膜、頂體和尾部的完整與否，將精子分為4種類型：A.頂體完整(精子頭部外形正常，細(xì)胞膜和頂體完整著色均勻，頂脊、赤道段清晰)與尾部完整型；B.頂體膨脹(頂體著色均勻，但頭部邊緣不整齊呈畸形，核前細(xì)胞膜不明顯或部分缺損)與尾部完整或出現(xiàn)部分?jǐn)嗔眩籆.頂體破損(頂體著色不均勻，頂體脫離細(xì)胞核，形成缺口或陷凹)、頂體脫落(赤道段以前的細(xì)胞膜缺損，頂體已全部脫離細(xì)胞核)，尾部完整或出現(xiàn)部分?jǐn)嗔眩籇.只剩精子頭部。

1.4 冷凍干燥豬精子超微結(jié)構(gòu)觀察

掃描電鏡：冷凍干燥豬精子經(jīng)PBS洗2～4次后，于2.5% 戊二醛中4℃固定6 h，再經(jīng)PBS清洗3次，每次30 min；再于1%鋨酸中固定1.5 h，然后再經(jīng)PBS清洗3次，每次30 min；之后，用乙醇逐級(30%、50%、70%、90%、100%、100%)脫水，每級20 min；樣品脫水后，用乙酸異戊脂置換；置換后的樣品直接移到樣品臺上，再放入臨界點干燥儀干燥，粘臺，IB-5離子濺射儀噴金，置于掃描電子顯微鏡(PHILIPS2505)下觀察、拍照。

1.5 冷凍真空干燥豬精子的顯微注射

卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備：自上海市長寧區(qū)復(fù)興屠宰場采集豬卵巢，根據(jù)本實驗室建立的方法進行卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)[6]，挑選有第一極體排除的卵母細(xì)胞進行顯微注射。

豬凍干精子的準(zhǔn)備：復(fù)水化后的精子常溫下600×g離心2 min，棄上清后加入500 μL的Pig-FM(90 mmol/L氯化鈉，12 mmol/L氯化鉀，25 mmol/L碳酸氫鈉，8 mmol/L氯化鈣，0.5 mmol/L磷酸二氫鈉，0.5 mmol/L硫酸鎂，2 mmol/L丙酮酸鈉，10 mmol/L乳酸，2 mmol/L咖啡因，5 mg/mL牛血清白蛋白和10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，并在38.5℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育備用[7]。

顯微注射：將2 μL孵育后的冷凍真空干燥豬精子吹入含有4% PVP的N-23中，再將卵母細(xì)胞吹入N-23滴中，一次25枚左右。最后，持卵針吸住卵母細(xì)胞，并調(diào)整極體的位置，使其保持在“12點或6點”方向，再橫向?qū)⒆⑸溽樦械木幼⑷肼涯讣?xì)胞中[7]，見圖1 B。

卵母細(xì)胞激活和培養(yǎng)：注射后先放入N-23中在培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 min，使卵母細(xì)胞復(fù)原。隨后采取電激活(1 000 V/cm)30 s，轉(zhuǎn)入化學(xué)激活劑(CHX)中激活，4 h后轉(zhuǎn)入N-23中進行培養(yǎng)觀察卵裂率和囊胚率。

原核檢查：ICSI 胚胎培養(yǎng) 15 h 后，利用Hochest33342進行熒光染色，以判斷精子頭部染色體的變化狀態(tài)。仍為致密染色體的視為雄原核沒有形成，精子頭部染色體去致密化、膨脹或擴張則視為原核正在形成或已經(jīng)形成，見圖1F。

1.6 統(tǒng)計分析

使用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，P＜0.05時即視為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 添加不同保護劑的凍干精子對ICSI后胚胎發(fā)育的影響

以添加0.2 mol/L海藻糖和50 mmol/L EDTA的冷凍真空干燥豬精子，研究4℃保存7 d并觀察單精注射后胚胎的發(fā)育情況。冷凍真空干燥豬精子水化后孵育時間均1 h，注射入卵后觀察雄原核、卵裂率和囊胚率。由表1可知：海藻糖處理組中雄原核形成率(68.52%)顯著高于 EDTA處理組(64.59%)和對照組(未添加保護劑)(35.36%)，后者之間差異顯著(P＜0.05)；添加0.2 mol/L海藻糖的冷凍干燥豬精子在ICSI后的卵裂率(59.17%)和囊胚率(19.16%)較添加50 mmol/L EDTA的卵裂率(56.26%)和囊胚率(15.62%)差異顯著，二者較未添加組(52.33%和 8.60%)均差異顯著(P＜0.05)。圖1C、1D、1E分別為海藻糖處理組，EDTA處理組和對照組中冷凍真空干燥豬精子ICSI后培養(yǎng)7 d所獲取的囊胚。

表1 添加海藻糖對ICSI后胚胎發(fā)育的影響Table 1 Effect of trehalose on embryonic development

圖1 凍干豬精子及其單精子注射后體外發(fā)育Fig.1 Freeze-dried boar spermatozoa and thein vitrodevelopment after ICSI.(A)Freeze-dried boar spermatozoa.(B)ICSI process.(C)Blastula formed from trehalose group.(D)Blastula formed from EDTA group.(E)Blastula formed from control group.(F)Male and female pronucleus.

2.2 冷凍真空干燥豬精子的保存時間對胚胎發(fā)育的影響

以0.2 mol/L海藻糖作為保護劑的冷凍干燥豬精子，研究在4℃下分別保存60、120和180 d，水化后孵育時間均為 1 h，隨后進行 ICSI，觀察雄原核、卵裂率和囊胚率。由表 2可知：保存在 4℃下60、120和180 d的冷凍干燥豬精子通過ICSI注射后，雄原核形成率(69.32%、68.61%、68.14%)，卵裂率(53.65%、52.60%和 51.71%)和囊胚率(17.82%、17.43%和17.15%)均無顯著差異(P＞0.05)。

表2 冷凍干燥豬精子不同保存時間對胚胎發(fā)育的影響Table 2 Effect of different storage time of freeze-dried sperm on embryonic development

2.3 冷凍干燥豬精子水化后孵育時間對培養(yǎng)發(fā)育的影響

保存在4℃下，以0.2 mol/L海藻糖為保護劑的冷凍干燥豬精子復(fù)水化后孵育時間分別為1 h和2 h，注射入卵后，對比水化后孵育時間長短對胚胎發(fā)育的影響。由表3可知：冷凍干燥豬精子水化后孵育1 h和2 h后，雄原核形成率，卵裂率和囊胚率均差異顯著(P＜0.05)，且囊胚率上，孵育1 h(17.98%)的凍干精子優(yōu)于孵育2 h(12.67%)組(P＜0.05)。

表3 冷凍干燥豬精子水化孵育時間對培養(yǎng)發(fā)育的影響Table 3 Effects of different hydration time for freeze-dried sperm on embryonic development

2.4 保存溫度對冷凍干燥豬精子形態(tài)的影響

本試驗海藻糖處理組(0.2 mol/L 海藻糖)和EDTA處理組(50 mmol/L EDTA)中的豬凍干豬精子保存在 4℃和?20℃下，180 d后水化，對凍干精子整體形態(tài)分為A、B、C、D四個等級進行染色觀察，結(jié)果見表 4，海藻糖處理組與 EDTA處理組中的凍干精子分別在4℃和?20℃下保存后各處理組間差異不顯著(P＞0.05)；海藻糖處理組中B級凍干精子百分?jǐn)?shù)顯著多于EDTA處理組(P＜0.05)。

表4 保存溫度對冷凍干燥豬精子的影響Table 4 Effect of storage temperature for freeze-dried boar sperm

2.5 掃描電鏡觀察冷凍干燥豬精子

通過掃描電鏡對冷凍真空干燥保存豬精子進行超微結(jié)構(gòu)觀察。由圖可知，冷凍真空干燥時添加0.2 mmol/L海藻糖作為豬精子保護劑，對精子外部形態(tài)具有較好的保護效果。精子在冷凍真空干燥后仍具有較完整的形態(tài)，如頂體和尾部(圖2A)，冷凍干燥豬精子頭部的頂體和赤道清晰可見(圖2B)。冷凍干燥時添加50 mmol/L EDTA作為豬精子保護劑，豬精子外部形態(tài)較為完整，樣品處理時精子尾部尚存少許雜質(zhì)(圖2C)，頂體清晰可見(圖2D)，而尾部與頭部后環(huán)(RING)之間出現(xiàn)斷痕(圖2D，箭頭處)，并未完全斷裂。未添加保護劑的冷凍干燥豬精子在干燥過程中出現(xiàn)不同程度的損傷，如頂體的丟失(圖2E)，精子頭部后環(huán)(RING)與尾部中段相連處出現(xiàn)斷裂損傷，尾部并未完全脫落和精子尾部完全脫落(圖2F，箭頭處)。

圖2 凍干豬精子的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 ultrastructure of freeze-dried boar sperm.(A)Acrosome(AC)of freeze-dried spermatozoa of trehalose group(arrow).(B)Acrosome(AC)and equatorial segment(ES)of freeze-dried spermatozoa of trehalose group.(C)Freeze-dried spermatozoa of EDTA group.(D)Acrosome(AC)of freeze-dried spermatozoa of EDTA group.Basal cords and posterior ring aren’t seen as well as the beginning of the middle piece with circumferential strings of particles around the plasma membrane(arrow).(E)Acrosome loss of freeze-dried spermatozoa of control group.(F)Posterior ring is clearly seen.Freeze-dried spermatozoa tail of control group damage or loss(arrow).

3 討論

在冷凍真空干燥過程中水分子橋的失去、蛋白構(gòu)象的改變會引起精子的損傷。精子在冷凍真空干燥的惡劣條件下會產(chǎn)生應(yīng)變蛋白，這種蛋白能避免干燥所帶來的損傷影響，人們也在尋找能夠替代這種蛋白的物質(zhì)。精子膜在干燥狀態(tài)下，其完整性會被破壞，影響對離子的傳輸能力，降低膜上脂質(zhì)的融點，造成相變從而導(dǎo)致?lián)p傷。在冷凍真空干燥過程中精子經(jīng)歷了低溫(?40℃)和干燥，這必將受到來自這兩方面的損傷，特別是形態(tài)發(fā)生變化，如：精子質(zhì)膜的破損，尾部損傷甚至脫落，細(xì)胞器(線粒體)暴露在與胞內(nèi)不一樣的環(huán)境中等等，冷凍真空干燥豬精子的電鏡圖可以清晰看到上述損傷。這些可能都是減低顯微注射后受精率低下的原因[8-9]。在保護精子質(zhì)膜方面，Aisen等[10]認(rèn)為海藻糖效果較好，Bayarad等[11]在小鼠和Aboagla等[12]在山羊精液冷凍保存研究中也得到相同的結(jié)論，本試驗所得的結(jié)果完全與上述一致。

目前關(guān)于冷凍真空干燥豬精子所添加的保護劑都是基于生化角度來選擇保護劑的成分。Ca2+與Mg2+與核酸內(nèi)切酶作用，增大長期保存后精子染色體異常的比例，而添加保護劑則可以與之結(jié)合，防止與核酸內(nèi)切酶作用。目前冷凍真空干燥精子所使用的保護劑多為EDTA或EGTA的Tris-HCl緩沖液[3-4,8,13-17]。而本試驗結(jié)果顯示海藻糖更有利于保護豬冷凍真空干燥精子。

Jennings等[18]認(rèn)為凍干保護劑在蛋白分子周圍形成環(huán)境，提供水分子，避免因為蛋白分子中水分子橋的失去和蛋白構(gòu)象的改變而引起細(xì)胞損傷。其中糖在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性保持中具有重要作用，能大幅提高細(xì)胞中酶的穩(wěn)定性。當(dāng)環(huán)境惡劣時，海藻糖呈現(xiàn)出優(yōu)于其他糖類的優(yōu)點。在許多生物中，海藻糖的自動生成經(jīng)常是與一些應(yīng)變蛋白同時出現(xiàn)的[19-21]。這些蛋白處于精子膜上，能參與保護精子免受冷凍真空干燥損傷的影響，作用類似與海藻糖。該機理可能與海藻糖有利于許多生物材料的穩(wěn)定性有關(guān)[22-23]。關(guān)于海藻糖保護細(xì)胞的分子機理，不同學(xué)者提出不同學(xué)說，但眾多研究表明[24-25]，海藻糖的保護機制與其晶體結(jié)構(gòu)、溶液的物理構(gòu)象和化學(xué)特性密切相關(guān)。當(dāng)干燥過程中水分被去除時，海藻糖和脂質(zhì)之間的氫鍵能避免脂質(zhì)分子改變構(gòu)象，這就是所謂的“水替代假說”[26]。與其他糖類相比，海藻糖更有利于保存膜在干燥狀態(tài)下的完整性和對離子的傳輸能力[27]，降低膜上脂質(zhì)的融點，防止膜相變造成的損傷[26,28]，具有很高的玻璃化溫度，是細(xì)胞懸浮液容易達(dá)到玻璃化[29]。

Kaneko等[13]還發(fā)現(xiàn)精子凍干保護劑的pH 8.0～8.2時效果較好。精子核內(nèi)的一些酶，如核酸內(nèi)切酶在酸性條件下較穩(wěn)定，高pH值的環(huán)境下這些酶的活性被抑制，這對保護染色體的完整是有益的。故本試驗中添加的保護劑的pH值均為8.0。

冷凍真空干燥精子的目標(biāo)是能在 4℃下長期保存。2003年，Monika等[30]利用保存了1.5年的小鼠冷凍真空干燥精子成功獲得后代。本研究保存180 d的冷凍真空干燥豬精子ICSI后雖能獲得囊胚，但并未進行胚胎移植，因此還有待于進一步的研究。

Kwon等[16]注入冷凍真空干燥豬精子頭部和整個精子并進行發(fā)育對比，發(fā)現(xiàn)前者形成雄原核率要優(yōu)于后者，筆者只注入整體的精子在雄原核形成率上低于上述凍干4 h、9 h、16 h且保存在4℃或25℃的冷凍真空干燥豬精子，但獲得囊胚率上要高于上述試驗。Nakai等對冷凍真空干燥豬精子進行了水化后孵育時間(0～60 min、60～120 min、20～180 min)之間的對較，發(fā)現(xiàn) 0～60 min水化后孵育時間的冷凍真空干燥精子單精注射后囊胚率為23.1%，120～180 min的為22.6%，二者之間差異不顯著[5]。本試驗中針對水化后孵育時間(1 h和2 h)做了研究，所得結(jié)果與上述不一致。

綜上所述，海藻糖對豬冷凍真空干燥的精子具有較好的保護作用，但仍需對凍干工藝等進一步優(yōu)化和完善。

致謝：感謝上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護研究所在冷凍真空干燥，上海同濟大學(xué)在掃描電鏡觀察中的幫助！

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Effect of trehalose on the freeze-dried boar spermatozoa

Xiangqian Meng1,2,3, Xiaolong Gu1,2,3, Caifeng Wu2,3, Jianjun Dai2,3, Tingyu Zhang2,3,Yini Xie1,2,3, Zhiqiang Wu12,3, Liang Liu2,3, Hengdong Ma1, and Defu Zhang2,3
1 Life and Physical Science College, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China 2 Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanghai Academy of Agricultural Science, Shanghai 201106, China 3 Division of Animal Genetic Engineering, Shanghai Municipal Key Laboratory of Agri-genetics and Breeding, Shanghai 201106, China

Received:January 11, 2010;Accepted:May 21, 2010

Supported by:Shanghai Agricultural Genetics and Breeding Laboratory(No.Shagb2008-03), Youth Science and Technology Development Fund of Shanghai Academy of Agricultural Science(No.2009(15)), Shanghai Agriculture Committee(No.2007-3-7), Trangentic Major Projects of New Varieties(Nos.2009ZX08006-014B, 2008ZX08006-005), Shanghai Municipal Science and Technology Committee(No.103919N1800).

Corresponding author:Defu Zhang.Tel: +86-21-52235475; E-mail: zhangdefu10@yahoo.com.cn Hengdong Ma.E-mail: mahengdong007@163.com上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室開放課題(No.Shagb2008-03)，上海市農(nóng)科院青年科技發(fā)展基金(No.2009(15))，上海市科技興農(nóng)推廣項目(No.2007-3-7)，轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(Nos.2009ZX08006-014B, 2008ZX08006-005)，上海市科委科技成果轉(zhuǎn)化項目(No.103919N1800)資助。