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    輔助病毒依賴型腺病毒載體轉(zhuǎn)基因的體外表達(dá)效率

    2010-10-16 08:09:10鄭嫻嫻何金生付遠(yuǎn)輝徐少華謝燦石長(zhǎng)信張梅王小波洪濤
    生物工程學(xué)報(bào) 2010年8期
    關(guān)鍵詞:腺病毒轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒

    鄭嫻嫻,何金生,付遠(yuǎn)輝,徐少華,謝燦,石長(zhǎng)信,張梅,王小波,洪濤,4

    1 安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,合肥 230032 2 北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院,北京 100044 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所,北京 100052

    輔助病毒依賴型腺病毒載體轉(zhuǎn)基因的體外表達(dá)效率

    鄭嫻嫻1,2,何金生1,2,付遠(yuǎn)輝2,徐少華2,謝燦1,石長(zhǎng)信3,張梅1,王小波1,2,洪濤2,4

    1 安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,合肥 230032 2 北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院,北京 100044 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所,北京 100052

    構(gòu)建可表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的輔助病毒依賴型腺病毒載體(Helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制備、純化和體外表達(dá)鑒定。熒光顯微鏡證實(shí)HDAd/EGFP可表達(dá),電鏡下觀察到經(jīng) CsCl純化后的腺病毒的典型形態(tài)。分光光度計(jì)法測(cè)定病毒的濃度為 4.0×1012顆粒數(shù)(Virus particle,vp)/mL。與可表達(dá)EGFP的第一代腺病毒載體(First generation adenoviral vector,F(xiàn)GAd)FGAd/EGFP進(jìn)行了體外感染和轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的比較研究,分別用約2 000 vp/細(xì)胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP的表達(dá)情況。通過(guò)相同時(shí)間點(diǎn)流式細(xì)胞儀分析EGFP的表達(dá)情況,可見(jiàn)HDAd/EGFP感染早期的A549細(xì)胞較 FGAd/EGFP有更高的熒光表達(dá)率及更高的表達(dá)強(qiáng)度,顯示 HDAd載體具有轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)高表達(dá)的特性,是一種更有價(jià)值的疫苗載體。

    輔助病毒依賴型腺病毒載體,第一代腺病毒載體,增強(qiáng)型綠色熒光蛋白,轉(zhuǎn)基因表達(dá)

    Abstract:To investigate the transgenic expressing efficacy of helper-dependent adenoviral vector(HDAd)in vitro, we constructed a HDAd encoding enhanced green fluorescent protein(EGFP), denominated as HDAd/EGFP, performed large scale preparation and purification, and then identified the purified HDAd/EGFP under fluorescent microscope and electron microscope.After the concentration of HDAd/EGFP was determined by spectrophotometer, the transgenic expression efficiency of HDAd/EGFP was compared with first generation adenoviral vector encoding EGFP(FGAd/EGFP)in vitro.Therefore, we infected A549 cells with 2 000 virus particles(vp)per cell by HDAd/EGFP and FGAd/EGFP respectively and analyzed EGFP expressing level by flow cytometry.Consequently, the fluorescent expression rate and fluorescent intensity ofEGFP were higher in early infected A549 cells by HDAd/EGFP than by FGAd/EGFP.HDAd, capable of expressing transgene instantly and efficiently in vitro, is a potential vaccine vector.

    Keywords:helper-dependent adenoviral vector(HDAd), first generation adenoviral vector(FGAd), enhanced green fluorescent protein(EGFP), transgenic expression

    輔助病毒依賴型腺病毒載體(Helper-dependent adenoviral vector,HDAd)是在第一代腺病毒載體(First generation adenoviral vector,F(xiàn)GAd)基礎(chǔ)上研制的一種全缺失的腺病毒載體[1],僅含有腺病毒復(fù)制信號(hào)(ITRs)和包裝信號(hào)(Ψ),需要輔助病毒為其提供包裝所需的所有蛋白。與 FGAd相比,HDAd具有轉(zhuǎn)基因容量大、轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、安全性高等優(yōu)點(diǎn),十多年來(lái),HDAd主要用于基因治療,作為疫苗載體的研究起步較晚,通過(guò)肌肉或靜脈注射發(fā)現(xiàn) HDAd具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)轉(zhuǎn)基因的免疫反應(yīng)[2-4],我們通過(guò)滴鼻途徑免疫動(dòng)物也獲得了類似的結(jié)果[5]。這種增強(qiáng)的免疫應(yīng)答主要與HDAd可在體內(nèi)高表達(dá)轉(zhuǎn)基因及減弱的載體反應(yīng)有關(guān),關(guān)于這 2種載體體外轉(zhuǎn)基因表達(dá)情況的研究較少。

    綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)為Shimomura等[6]于1962年從多管水母屬Aequorea victoria中首次分離獲得,1992年由Prasher等完成其 cDNA的克隆,其開(kāi)放讀碼框(Open reading frame,ORF)編碼 238個(gè)氨基酸[7]。GFP無(wú)種屬特異性、可在不同種屬細(xì)胞或組織中穩(wěn)定發(fā)出熒光,熒光檢測(cè)不需要外加底物和輔助因子[8-9]。利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,F(xiàn)CM)可直接觀察[10],無(wú)細(xì)胞毒性作用[8,11],因此被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)與調(diào)控、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位和功能研究等方面,成為繼LacZ、CAT后國(guó)內(nèi)外分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的報(bào)告基因。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)是經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化及氨基酸突變等一些列基因改造后獲得的 GFP突變體[12],這種突變體不僅保留了GFP的所有優(yōu)點(diǎn),且更易于在真核細(xì)胞中表達(dá),蛋白表達(dá)量增加,使EGFP表達(dá)的熒光強(qiáng)度比GFP高100倍以上,大大提高了檢測(cè)靈敏度[13],而且因其具有 B細(xì)胞、Th細(xì)胞和CTL細(xì)胞表位[14-15],成為一種應(yīng)用非常廣泛的示蹤蛋白和模式蛋白。

    因此,本文以 EGFP作為報(bào)告基因,構(gòu)建可表達(dá)EGFP的 HDAd/EGFP載體,大量擴(kuò)增純化及表達(dá)鑒定,并與FGAd/EGFP一起開(kāi)展轉(zhuǎn)基因體外表達(dá)效率的比較研究,以期為HDAd作為疫苗載體的研究提供更全面的基礎(chǔ)信息。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞株和毒株

    HDAd Cre/loxP系統(tǒng)及 293Cre4細(xì)胞和輔助病毒H14購(gòu)自加拿大Microbix公司,A549細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院魏海明教授饋贈(zèng),293細(xì)胞、CsCl超速離心純化的可表達(dá)EGFP的復(fù)制缺陷型重組腺病毒FGAd/EGFP由本室保存。

    1.1.2 菌株和質(zhì)粒

    E.coliDH10B菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存,pSC11、pSC15B由美國(guó)梅奧醫(yī)院血液腫瘤科石長(zhǎng)信博士構(gòu)建[16]。

    1.1.3 主要試劑

    限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、I-SceⅠ、I-CeuⅠ購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司,SAP酶、DL 1 kb marker購(gòu)自Fermentas公司,T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pfu酶購(gòu)自上海 Promega公司,DL2000 marker、ExTaqDNA聚合酶、其他限制性內(nèi)切酶是TaKaRa公司的產(chǎn)品,質(zhì)粒提取及純化試劑盒、PCR產(chǎn)物回收及純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司,引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 PCR獲得CMV-EGFP-SV40片段

    用 FGAd/EGFP按 500 vp/細(xì)胞感染豐度約為90℅的293細(xì)胞,待72 h后,收集細(xì)胞采用Hirt法快速提取腺病毒 DNA,以此為模板,用 PCR法擴(kuò)增獲得目的片段 CMV-EGFP-SV40。上、下游引物分別為:5′-GTCGACTAGTAATCAATTACGGGG-3′和 5′-ACGCGTTAAGATACATTGATGAG-3′,并在引物5′端分別引入SalⅠ和MluⅠ的酶切位點(diǎn)。PCR條件:95℃預(yù)變性 5 min;94℃變性1 min,58℃退火30 s,72℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán);72℃最終延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

    將 CMV-EGFP-SV40的 PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T連接、轉(zhuǎn)化、挑菌、搖菌和小提質(zhì)粒,獲得質(zhì)粒命名為pGEM-T/EGFP,進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序鑒定正確后用SalⅠ和MluⅠ酶切pGEM-T/EGFP,切膠回收純化CMV-EGFP-SV40片段,置于?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pSC15B/EGFP的構(gòu)建

    用SalⅠ和MluⅠ雙酶切pSC11,將CMV-EGFPSV40與pSC11連接、轉(zhuǎn)化、挑菌、搖菌,然后小提質(zhì)粒,用SalⅠ和MluⅠ酶切鑒定。獲得的重組質(zhì)粒命名為pSC11/EGFP。

    用NheⅠ和PmeⅠ酶切pSC11/EGFP,T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶進(jìn)行末端補(bǔ)平及連接,去除PmeⅠ酶切位點(diǎn),獲得重組質(zhì)粒命名為 pSC11/EGFPNheⅠ-PmeⅠ。

    用 I-SceⅠ和 I-CeuⅠ雙 酶 切 pSC11/EGFPNheⅠ-PmeⅠ和pSC15B,進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、挑菌和搖菌。提取質(zhì)粒用Hind Ⅲ酶切鑒定,同時(shí)以Hind Ⅲ酶切 pSC15B作對(duì)照。得到連接成功的質(zhì)粒進(jìn)一步用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、Hind Ⅲ、PstⅠ酶切鑒定,獲得的重組質(zhì)粒命名為pSC15B/EGFP[17]。

    1.2.3 重組腺病毒HDAd/EGFP的獲得

    用60 mm×15 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)293Cre4細(xì)胞待豐度達(dá)到90%左右時(shí),取PmeⅠ酶切消化的pSC15B/EGFP線性化片段經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后第2天,棄掉培養(yǎng)液,加入含2% FBS的DMEM維持液。取輔助病毒H14,按500 vp/細(xì)胞感染293Cre4細(xì)胞,置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。約48~72 h后,細(xì)胞完全病變、脫落,收集脫落后的細(xì)胞及上清,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,2 000 r/min離心5 min。棄部分上清,保留約4 mL,用吸管重懸沉淀,?80℃冰箱凍存30 min,37℃水浴融化,反復(fù)3次,獲得P0代HDAd/EGFP粗體液,取1 mL接種至形成單層、含2% FBS的DMEM維持液的293Cre4細(xì)胞中,同時(shí)按 100 vp/細(xì)胞加入輔助病毒,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞病變。約48 h后,細(xì)胞完全病變、脫落,按上法處理293Cre4細(xì)胞,重復(fù)6輪獲得P6代HDAd/EGFP粗提液[17]。

    1.2.4 重組腺病毒HDAd/EGFP的大量制備及純化

    用30個(gè)150 mm×25 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)293Cre4細(xì)胞,待細(xì)胞豐度約為90%時(shí),取HDAd/EGFP和輔助病毒H14共感染293Cre4細(xì)胞,約48~72 h后,收集細(xì)胞及培養(yǎng)液。采用 CsCl密度梯度和連續(xù)密度梯度法 2次超速離心純化HDAd/EGFP,樣品在4℃、10 mmol/L Tris-HCl 8.0中透析24 h,期間換液 3次[17]。電鏡下觀察純化后病毒形態(tài)并保存于?80℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.5 轉(zhuǎn)基因EGFP的表達(dá)鑒定

    用100 mm×20 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)293Cre4細(xì)胞,待細(xì)胞豐度約為90%時(shí),用純化的HDAd/EGFP感染293Cre4細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.6 分光光度計(jì)測(cè)定純化重組腺病毒HDAd/EGFP的病毒顆粒濃度

    用含0.1℅ SDS的TE溶液稀釋純化的HDAd/EGFP,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。56℃溫育 10 min,渦旋振蕩樣品后使用分光光度計(jì)測(cè)OD260的值。根據(jù)公式計(jì)算純化重組腺病毒HDAd/EGFP的病毒顆粒濃度[18]:

    病毒顆粒濃度(vp/mL)=(OD260值×稀釋倍數(shù)×1.1×1012×36)/HDAd/EGFP 堿基數(shù)(kb)

    1.2.7 重組腺病毒HDAd/EGFP和FGAd/EGFP轉(zhuǎn)基因EGFP表達(dá)的比較

    用 2塊 24孔板培養(yǎng)A549細(xì)胞,待豐度達(dá)到90%左右時(shí),分別用2 000 vp/細(xì)胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞,同時(shí)以培養(yǎng)的正常A549細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

    在感染后1、3、8 d時(shí)分別隨機(jī)取HDAd/EGFP或FGAd/EGFP感染的A549細(xì)胞各3孔,棄培養(yǎng)液,用PBS液洗滌2遍后用0.25%胰酶消化,鏡下觀察待呈單個(gè)貼壁細(xì)胞時(shí),棄胰酶,用PBS液吹打成單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀檢測(cè)每10 000個(gè)A549細(xì)胞的EGFP表達(dá)率和EGFP平均熒光強(qiáng)度。

    1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

    采用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)重組腺病毒HDAd/EGFP和FGAd/EGFP轉(zhuǎn)基因EGFP表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組比較使用單因素多組方差分析,當(dāng)方差不齊時(shí)使用t檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR獲得EGFP表達(dá)盒

    以 FGAd/EGFP為模板,用 PCR法擴(kuò)增獲得EGFP表達(dá)盒CMV-EGFP-SV40片段,1℅瓊脂糖凝膠電泳,觀察到介于1 000~2 000 bp的DNA片段,與預(yù)期值 1 627 bp相符(圖1)。回收的 CMVEGFP-SV40片段與pGEM-T連接,測(cè)序正確。

    圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.1 PCR product of CMV-EGFP-SV40.1: DL2 000 marker;2: PCR product of CMV-EGFP-SV40.

    2.2 構(gòu)建 HDAd/EGFP重組質(zhì)粒 pSC15B/EGFP及酶切鑒定

    將CMV-EGFP-SV40克隆至載體pSC11,SalⅠ和MluⅠ酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示得到2條帶,約為3 000 bp和1 600 bp,與pSC11、CMVEGFP-SV40大小一致(圖2)。為進(jìn)一步將EGFP表達(dá)盒克隆至pSC15B,需去除pSC11/EGFP中的PmeⅠ酶切位點(diǎn),用NheⅠ和PmeⅠ酶切pSC11/EGFP,末端補(bǔ)平、連接后用PmeⅠ和XbaⅠ進(jìn)行酶切鑒定,可觀察到5 000 bp左右的線性化條帶,證實(shí)已去除了PmeⅠ酶切位點(diǎn)。

    進(jìn)一步克隆EGFP基因至pSC15B,大提質(zhì)粒并用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、Hind Ⅲ、PstⅠ酶切鑒定,與預(yù)計(jì)結(jié)果一致(圖3)。

    2.3 超速離心純化后病毒帶的觀察

    HDAd/EGFP與輔助病毒 H14共感染 293Cre4細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)CsCl密度梯度和連續(xù)密度梯度超速離心純化后,在管的中下部可見(jiàn)到上下2條乳白色病毒帶,上面的帶即為純化后的HDAd/EGFP(圖4)。

    2.4 電鏡鑒定重組腺病毒HDAd/EGFP形態(tài)

    純化后的 HDAd/EGFP經(jīng)磷酸鎢負(fù)染,在透射電鏡下可見(jiàn)腺病毒典型的二十面體結(jié)構(gòu),直徑約為70 nm,病毒結(jié)構(gòu)完整(圖5)。

    圖2 酶切鑒定pSC11/EGFPFig.2 pSC11/EGFP identified by restriction endonuclease assay.1: DL2 000 marker; 2: pSC11/EGFP digested withSalⅠandMluⅠ.

    圖3 酶切鑒定pSC15B/EGFPFig.3 pSC15B/EGFP identified by restriction endonuclease assay.1:PstⅠ; 2:EcoRⅤ; 3:EcoRⅠ; 4:BamHⅠ; 5:HindⅢ;M: DL1kb marker.

    圖4 經(jīng)CsCl超速離心后HDAd/EGFP病毒條帶Fig.4 HDAd/EGFP purified by CsCl ultracentrifugation.

    圖5 純化的 HDAd/EGFP電鏡下形態(tài)(1%磷鎢酸pH 6.8負(fù)染,TECNAI-12)Fig.5 Purified HDAd/EGFP under electron microscope(TECNAI-12).

    2.5 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因EGFP的表達(dá)

    將純化后的 HDAd/EGFP感染 293Cre4細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)明顯的綠色熒光(圖6)。

    2.6 重組腺病毒HDAd/EGFP濃度計(jì)算

    圖6 HDAd/EGFP感染 293Cre4細(xì)胞后表達(dá)的 EGFP(Nikon TE2000-S,100×)Fig.6 EGFP expressed by HDAd/EGFP infected 293Cre4 cells(Nikon TE2000-S, 100×).

    純化后的HDAd/EGFP稀釋10倍后測(cè)得OD260值為0.33,HDAd/EGFP堿基數(shù)為33.089 kb,可得HDAd/EGFP 的病毒顆粒濃度為:(0.33×10×1.1×1012×36)/33.089≈4.0×1012vp/mL。

    2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞后EGFP的表達(dá)

    以2 000 vp/細(xì)胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞的熒光表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度。

    圖7 A549細(xì)胞感染后1天時(shí)的流式直方圖Fig.7 Flowcytometric histograms of infected A549 cells on day 1 after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).(A)A549 cells.(B)FGAd/EGFP infected A549 cells.(C)HDAd/EGFP infected A549 cells.

    圖8 A549細(xì)胞感染后3天時(shí)的直方細(xì)胞圖Fig.8 Flowcytometric histograms of infected A549 cells on day 3 after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).(A)A549 cells.(B)FGAd/EGFP infected A549 cells.(C)HDAd/EGFP infected A549.

    圖9 A549細(xì)胞感染后8天時(shí)的直方細(xì)胞圖Fig.9 Flowcytometric histograms of infected A549 cells on day 8 after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).(A)A549 cells.(B)FGAd/EGFP infected A549 cells.(C)HDAd/EGFP infected A549.

    圖10 HDAd/EGFP、FGAd/EGFP感染 A549細(xì)胞后EGFP的表達(dá)率分析Fig.10 Percentage of EGFP expressed A549 cells after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).

    圖11 HDAd/EGFP、FGAd/EGFP感染 A549細(xì)胞后EGFP的熒光強(qiáng)度Fig.11 Fluorescence intensity of EGFP expressed by A549 cells after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).

    圖7、圖8、圖9分別顯示A549細(xì)胞感染重組腺病毒后 1、3、8 d時(shí)流式細(xì)胞儀所檢測(cè)得到的流式直方圖。圖7A、圖8A、圖9A為A549細(xì)胞作為陰性對(duì)照,設(shè)置M1區(qū)域,圖7B/C、圖8B/C、圖9B/C中M2區(qū)代表有EGFP表達(dá)的A549細(xì)胞。圖10顯示感染 HDAd/EGFP的 A549細(xì)胞在感染后的第 1天和第3天較FGAd/EGFP有更高的EGFP表達(dá)率(P<0.05),在第8天兩者沒(méi)有明顯差異(P>0.05);圖11顯示感染HDAd/EGFP的A549細(xì)胞在感染后第 1天和第 3天,EGFP的平均熒光強(qiáng)度均比FGAd/EGFP強(qiáng)(P<0.05),在第 8天兩者的平均熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

    3 討論

    腺病毒為長(zhǎng)約36 kb的線性雙鏈DNA病毒,無(wú)包膜,具有宿主范圍廣、可感染分裂和非分裂細(xì)胞、外源基因容納量大、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、病毒滴度高、易繁殖和純化等優(yōu)點(diǎn)[19],被廣泛應(yīng)用于基因治療和疫苗研究中。FGAd由于保留了腺病毒的大部分基因,低水平表達(dá)的腺病毒蛋白不僅對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,在體內(nèi)也可引起針對(duì)腺病毒載體的免疫反應(yīng),當(dāng)再次使用腺病毒載體時(shí),容易被機(jī)體免疫系統(tǒng)快速清除而無(wú)法長(zhǎng)期表達(dá)轉(zhuǎn)基因[20]。HDAd又被稱為空殼載體(Gutless or gutted vector),缺失除了腺病毒復(fù)制信號(hào)(ITRs)和包裝信號(hào)(Ψ)以外的其他所有腺病毒基因,感染后無(wú)病毒自身蛋白表達(dá)[1],大大降低了細(xì)胞毒性和機(jī)體的免疫反應(yīng)[20],可以持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因達(dá)1年以上[21],安全性更好;大量病毒自身基因的缺失使得HDAd的外源基因容納量高達(dá)37 kb,可同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因用于多基因疾病的研究[22];另外,HDAd在包裝過(guò)程中需要借助輔助病毒為其提供所有的結(jié)構(gòu)和功能蛋白,來(lái)源于不同血清型的輔助病毒,可形成不同血清型的腺病毒,避免反復(fù)使用同一血清型腺病毒載體所產(chǎn)生的中和抗體的影響[23]。

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)HDAd和FGAd體外感染轉(zhuǎn)基因表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了比較,我們分別用約2 000 vp/細(xì)胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞,結(jié)果顯示感染HDAd/EGFP的細(xì)胞3 d內(nèi)EGFP的表達(dá)率高于FGAd/EGFP感染的細(xì)胞,隨著時(shí)間的推移2組 EGFP的表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示在體外感染肺泡來(lái)源的上皮細(xì)胞后,感染的早期HDAd較FGAd有更高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)率;同時(shí)我們監(jiān)測(cè)了 HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549細(xì)胞后EGFP的表達(dá)強(qiáng)度,結(jié)果同樣顯示在感染后3天內(nèi)HDAd/EGFP較FGAd/EGFP有更高的EGFP表達(dá),隨著時(shí)間的推移 2組的表達(dá)率也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說(shuō)明感染早期HDAd在體外感染的肺泡上皮來(lái)源的細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)較 FGAd具有一定優(yōu)勢(shì)。我們的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的體內(nèi)結(jié)果基本一致[2-3]。由于HDAd/EGFP和FGAd/EGFP均為5型腺病毒來(lái)源,具有相同的衣殼蛋白,HDAd/EGFP較FGAd/EGFP有更高的體外轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的原因,目前仍不是十分清晰,我們推測(cè):1)FGAd/EGFP除了含有EGFP表達(dá)盒外,還含有17個(gè)腺病毒蛋白的ORF[3],雖然缺失了E1和E3區(qū),仍存在的低水平表達(dá)會(huì)影響或干擾EGFP的表達(dá),而 HDAd/EGFP僅有一個(gè) EGFP表達(dá)盒,不存在任何腺病毒蛋白的干擾,因此轉(zhuǎn)基因的表達(dá)更加迅速、高效;2)兩種載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率趨向一致的時(shí)間長(zhǎng)短,與細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有關(guān),細(xì)胞活性的下降直接影響了HDAd轉(zhuǎn)基因的高效表達(dá)。我們認(rèn)為HDAd載體這種轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)高表達(dá)的特性是其作為疫苗載體,獲得比 FGAd載體更好的免疫原性的重要原因之一。需要指出的是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平由多種因素決定,不僅與載體有關(guān),也與轉(zhuǎn)基因本身的生物學(xué)性質(zhì)如細(xì)胞毒性作用等有關(guān),這些因素會(huì)對(duì)HDAd的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率產(chǎn)生一定影響。

    由于大多數(shù)病毒通過(guò)黏膜途徑,尤其是呼吸道入侵機(jī)體,因此我們認(rèn)為應(yīng)及時(shí)開(kāi)展HDAd作為黏膜免疫載體的可行性及效率研究,以期為開(kāi)發(fā)RSV等經(jīng)黏膜途徑感染的病毒疫苗探索一條新的途徑。鑒于這種認(rèn)識(shí),我們選擇了具有較好的免疫原性、不抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答[3,15-16]、也沒(méi)有細(xì)胞毒性的EGFP作為模式蛋白,用于探討 HDAd作為黏膜疫苗載體的可行性,避免轉(zhuǎn)基因?qū)DAd免疫效果不利的影響,以期真實(shí)反映HDAd作為黏膜疫苗載體的可行性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了我們的想法,經(jīng)滴鼻途徑免疫 BALB/c小鼠的比較研究表明:HDAd/EGFP能誘導(dǎo)產(chǎn)生更好的體液、細(xì)胞及黏膜免疫應(yīng)答,具有Th1和Th2平衡的特點(diǎn),HDAd/EGFP加強(qiáng)(Boost)免疫具有明顯的免疫增強(qiáng)效果。證實(shí)了HDAd作為黏膜疫苗載體用于預(yù)防經(jīng)呼吸道黏膜途徑感染的RSV等病毒病原的疫苗研究是合理、可行的,將有助于克服目前RSV等疫苗研究中存在的安全性不足、免疫效果不理想等問(wèn)題,作為安全有效的黏膜疫苗載體,HDAd具有較好的應(yīng)用前景[5]。

    總之,我們已成功構(gòu)建了 HDAd/EGFP載體,獲得可高效表達(dá)EGFP的HDAd/EGFP,并在體外開(kāi)展了轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的初步研究,與 FGAd載體相比,HDAd載體具有轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)高表達(dá)的特性,證實(shí)HDAd是很有潛力的疫苗載體。

    REFERENCES

    [1]Mitani K, Graham FL, Caskey CT,et al.Rescue,propagation and partial purification of a helper virus-dependent adenovirus vector.Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(9): 3854?3858.

    [2]Harui A, Roth MD, Kiertscher SM,et al.Vaccination with helper-dependent adenovirus enhances the generation of transgene-specific CTL.Gene Ther, 2004, 11(22):1617?1626.

    [3]Eric AW, Pramod NN, Stephanie SB,et al.Comparison of replication-competent, first generation, and helper-dependent adenoviral vaccine.PloS ONE, 2009, 4(3): 5059.

    [4]Weaver EA, Nehete PN, Nehete BP,et al.Protectin against mucosal sHIV challenge by peptide and helper-dependent adenovirus vaccine.Viruses, 2009, 1(2):920?938.

    [5]Fu YH, He JS, Zheng XX,et al.Intranasal vaccination with a helper-dependent adenoviral vector enhances transgene-specific immune responses in BALB/c mice.Biochem Biophys Res Commun, 2010, 391(1): 857?861.

    [6]Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y.Extraction,puirification and properties of Aequoria, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan Aequorea.J Cell Comp Physiol, 1962, 59(2): 223?229.

    [7]Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW,et al.Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene, 1992, 111(2): 229?233.

    [8]Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G,et al.Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science, 1994,263(5148): 802?805.

    [9]Heim R, Prasher DC, Tsien RY.Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(26):12501?12504.

    [10]Cormack BP, Valdivia RH, Falkow S.FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP).Gene,1996, 173(1 Spec No): 33?38.

    [11]Simon PD, Vorwerk CK, Mansukani SS,et al.bcl-2 Gene therapy exacerbates excitotoxicity.Hum Gene Ther, 1999,10(10): 1715?1720.

    [12]Zhang G, Gurtu V, Kain SR.An enhanced green fluorescent protein allows sensitive detection of gene transfer in mammalian cells.Biochem Biophys Res Commun, 1996, 227(3): 707?711.

    [13]Chiu WL, Niwa Y, Zeng W,et al.Engineered GFP as a vital reporter in plants.Curr Biol, 1996, 6(3): 325?330.

    [14]Stripecke R, Carmen Villacres M, Skelton D,et al.Immune response to green fluorescent protein:implications for gene therapy.Gene Ther, 1999, 6(7):1305?1312.

    [15]Rosenzweiq M, Connole M, Glickman R,et al.Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+)hematopoietic cells.Blood, 2001, 97(7): 1951?1959.

    [16]Shi CX, Graham FL, Hitt MM.A convenient plasmid system for construction of helper-dependent adenoviral vectors and its application for analysis of the breast-cancer-specific mammaglobin promoter.J Gene Med, 2006, 8(4): 442?451.

    [17]Yang B, He JS, Shi CX,et al.Construction and preparation of helper-dependent adenoviral vector expressing human respiratory syncytial virus F gene.Acta Mcrobiol Sin, 2007, 47(4): 682-685.楊兵, 何金生, 石長(zhǎng)信, 等.可表達(dá)人呼吸道合胞病毒融合蛋白輔助病毒依賴型腺病毒載體的構(gòu)建與制備.微生物學(xué)報(bào), 2007, 47(4): 682?685.

    [18]Ng P, Parks RJ, Graham FL.Methods in Molecular Medicine.Gene Therapy Protocols.2nd ed.Totowa:Humana Press Inc., 2002, 69: 384.

    [19]Patterson S, Papaqatsias T, Benlahrech A.Use of adenovirus in vaccines for HIV.Handb Exp Pharmaacol,2009,(188): 275?293.

    [20]Fu YH, He SJ, Shi CX,et al.Advances in helper-dependent adenoviral vector.Acta Mcrobiol Sin,2009, 49(2): 147?152.付遠(yuǎn)輝, 何金生, 石長(zhǎng)信, 等.輔助病毒依賴型腺病毒載體的研究進(jìn)展.微生物學(xué)報(bào), 2009, 49(2):147?152.

    [21]Morral N, O’Neal W, Rice K,et al.Administration of helper-dependent adenoviral vectors and sequential delivery of different vector serotype for long-term liver-directed gene transfer in baboons.Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(22): 12816?12821.

    [22]Jozkowicz A, Dulak J.Helper-dependent adenoviral vector in experimental gene therapy.ActaBiochim Pol,2005, 52(3): 589?599.

    [23]Parks R, Evelegh C, Graham F,et al.Use of helper-dependent adenoviral vectors of alternative serotypes permits repeat vector administration.Gene Ther,1999, 6(9): 1565?1573.

    Journals.im.ac.cn

    In vitro transgenic expression efficacy of a helper-dependent adenoviral vector encoding enhanced green fluorescent protein

    Xianxian Zheng1,2, Jinsheng He1,2, Yuanhui Fu2, Shaohua Xu2, Can Xie1, Changxin Shi3,Mei Zhang1, Xiaobo Wang1,2, and Tao Hong2,4
    1 Department of Immunology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2 College of Life Sciences & Bioengineering, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 Institute of Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China

    Received:February 21, 2010;Accepted:April 28, 2010

    Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30671965).

    Corresponding author:Jinsheng He.Tel: +86-10-51684080; Fax: +86-10-51683887; E-mail: jshhe@bjtu.edu.cn國(guó)家自然科學(xué)基金(No.30671965)資助。

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