丙酮丁醇梭菌發(fā)酵菊芋汁生產(chǎn)丁醇

陳麗杰，辛程勛，鄧攀，任劍剛，梁環(huán)環(huán)，白鳳武

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024 2 大慶九環(huán)生物新能源有限公司，大慶 163511

丙酮丁醇梭菌發(fā)酵菊芋汁生產(chǎn)丁醇

陳麗杰1，辛程勛2，鄧攀1，任劍剛1，梁環(huán)環(huán)1，白鳳武1

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024 2 大慶九環(huán)生物新能源有限公司，大慶 163511

對(duì)丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicumL7發(fā)酵菊芋汁酸水解液生產(chǎn)丁醇進(jìn)行了初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以該水解液為底物生產(chǎn)丁醇，不需要添加氮源和生長因子。當(dāng)水解液初始糖濃度為48.36 g/L時(shí)，其發(fā)酵性能與以果糖為碳源的對(duì)照組基本相同，發(fā)酵終點(diǎn)丁醇濃度為8.67 g/L，丁醇、丙酮和乙醇的比例為0.58∶0.36∶0.06，但與以葡萄糖為碳源的對(duì)照組相比，發(fā)酵時(shí)間明顯延長，表明該菌株葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)于果糖。當(dāng)水解液初始糖濃度提高到62.87 g/L時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)殘?zhí)菨舛葟?.09 g/L增加到3.26 g/L，但丁醇濃度卻提高到11.21 g/L，丁醇、丙酮和乙醇的比例相應(yīng)為0.64∶0.29∶0.05，表明適量糖過剩有助于C.acetobutylicumL7胞內(nèi)代謝從丙酮合成向丁醇合成途徑調(diào)節(jié)；繼續(xù)提高水解液初始糖濃度，發(fā)酵終點(diǎn)殘?zhí)菨舛妊杆偕?，丁醇生產(chǎn)的技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)受到明顯影響。

丙酮丁醇梭菌，菊芋汁水解液，丁醇發(fā)酵

Abstract:Butanol production from acid hydrolysate of Jerusalem artichoke juice byClostridium acetobutylicumL7 was investigated, and it was found that natural components of the hydrolysate were suitable for solvent production with the species.With batch fermentation using the medium containing 48.36 g/L total sugars, 8.67 g/L butanol was produced at 60 h, and the ratio of butanol to acetone to ethanol was 0.58:0.36:0.06, which were similar to the fermentation with fructose as carbon source, but both of these two fermentations were slower than that with glucose as carbon source, indicating the fructose transport of the species might not be effective as that for glucose.When the total sugars of the medium were increased to 62.87 g/L, the residual sugars increased slightly from 3.09 g/L to 3.26 g/L, but butanol production of the fermentation system was improved significantly, with 11.21 g/L butanol produced and the ratio of butanol to acetone to ethanol at 0.64:0.29:0.05, which illustrated that an excess in sugars enhanced the butanol biosynthesis of the species by compromising its acetone production.When the sugar concentration of the medium was further increased, much more sugars were remained unconsumed, making the process economically unfavourable.

Keywords:Clostridium acetobutylicum, hydrolysate of Jerusalem artichoke juice, butanol fermentation

與乙醇相比，丁醇具有能量密度高、親水性弱、腐蝕性小、更易與汽油或柴油混合等優(yōu)點(diǎn)，更適宜于作為發(fā)動(dòng)機(jī)燃料，因此被認(rèn)為是第 2代生物燃料[1]。目前丁醇主要以淀粉質(zhì)原料如玉米、小麥、黍米等和糖質(zhì)原料如糖蜜生產(chǎn)[2]，原料成本高的問題十分突出。此外，與燃料乙醇一樣，以糧食類淀粉質(zhì)原料大規(guī)模生產(chǎn)丁醇作為燃料，也會(huì)產(chǎn)生影響糧食安全的社會(huì)問題。開發(fā)廉價(jià)的、非糧生物質(zhì)原料，是發(fā)展丁醇作為生物燃料的必然出路。

菊芋Jerusalem artichoke，又名洋姜或鬼子姜，為菊科向日葵屬多年生宿根性草本植物，其生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱、耐寒、耐鹽堿，能夠在不適宜于糧食和經(jīng)濟(jì)作物生長的鹽堿地、灘涂地等邊際土地上種植，生物量產(chǎn)量高[3]。鮮菊芋塊莖中含水70%～80%，碳水化合物15%～20%，以菊粉的形式存在。菊粉(Inulin)，又稱菊糖，是由D-果糖經(jīng)β-2,1糖苷鍵連接的聚合度不高的聚果糖，末端為一個(gè)葡萄糖殘基[4]。與目前國內(nèi)外普遍關(guān)注的以農(nóng)作物秸稈為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)原料相比，菊芋易被酸或菊粉酶水解而生成果糖和葡萄糖的混合物，是生產(chǎn)果糖、果糖基產(chǎn)品和微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料和生物基化學(xué)品等的良好原料[5]。

以菊芋塊莖為原料生產(chǎn)乙醇的研究工作在國內(nèi)外均有報(bào)道[6-7]，然而鮮菊芋塊莖含水量高，直接水解獲得的糖難以滿足乙醇發(fā)酵對(duì)高濃度底物的要求，但卻可以很好地滿足丁醇發(fā)酵的要求。由于丁醇發(fā)酵梭菌沒有菊粉酶生產(chǎn)能力，不能水解菊芋中的菊粉多糖，因此生產(chǎn)丁醇時(shí)需要對(duì)菊芋原料進(jìn)行水解。本文以菊芋汁稀酸水解糖為底物，研究其發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的可行性，為第 2代生物燃料丁醇生產(chǎn)開辟新的原料來源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室馴化保存的丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌Clostridium acetobutylicumL7。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)原料

菊芋汁：鮮菊芋塊莖直接壓榨，由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所杜昱光教授提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

葡萄糖培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，乙酸銨2.3，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，鄰氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，初始pH 5.5。

果糖培養(yǎng)基(g/L)：果糖 50，乙酸銨 2.3，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，鄰氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，初始pH 5.5。

菊芋汁用硫酸調(diào)節(jié)至 pH值2.0～3.0，沸水浴保溫維持60 min使菊粉水解，用NaOH調(diào)節(jié)水解液至pH 6.0，即得菊芋汁水解液(Hydrolysate of Jerusalem artichoke juice，HJA)，于121℃蒸汽滅菌20 min，冷卻后保存?zhèn)溆?。將?zhǔn)備好的菊芋汁水解液稀釋到所需的糖濃度，添加對(duì)照培養(yǎng)基中除碳源外的其他成分，用少量硫酸調(diào)節(jié)其初始pH 5.5。

以上培養(yǎng)基接種前均在 121℃下蒸汽滅菌15 min。

1.2.2 培養(yǎng)方法

菌種活化培養(yǎng)：將1 mL冷凍保藏的菌種接種于20 mL玉米醪試管培養(yǎng)基中，沸水浴下處理1～2 min，在溫度37.5℃下厭氧活化培養(yǎng)，自然pH值。

搖瓶培養(yǎng)：將活化好菌種以體積比10%的接種量接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，充無菌氮?dú)?0 min,于溫度37.5℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，初始pH為5.5。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：在2.5 L發(fā)酵罐(KF-2.5)中進(jìn)行，裝液量為1 L，接種量10%(V/V)，攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵溫度37.5℃，初始pH 5.5。接種后向發(fā)酵罐中通入無菌氮?dú)?0 min，以保證發(fā)酵罐內(nèi)的厭氧環(huán)境。

1.2.3 糖的測(cè)定

糖濃度測(cè)定采用DNS法[8]。對(duì)葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基和發(fā)酵液，其標(biāo)準(zhǔn)曲線使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制；以果糖和菊芋汁水解液為碳源的培養(yǎng)基和發(fā)酵液，其標(biāo)準(zhǔn)曲線使用果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制。樣品離心處理后，取適當(dāng)稀釋的上清液1 mL，加入1 mL水，再加入1.5 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴5 min，立即冷卻至室溫，加蒸餾水至25 mL，搖勻，540 nm測(cè)吸光度，根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品糖濃度。

接種后立即取樣，測(cè)定初始糖濃度；發(fā)酵過程中或發(fā)酵結(jié)束后取樣，測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛取?/p>

1.2.4 生物量的測(cè)定

搖瓶發(fā)酵由于菌體濃度低，且發(fā)酵液中含有的少量固形物對(duì)生物量測(cè)定干擾嚴(yán)重，因此嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組接種量和其他實(shí)驗(yàn)條件，比較添加氮源和維生素對(duì)溶劑生產(chǎn)的影響。發(fā)酵罐培養(yǎng)過程生物量測(cè)定方法如下：取2.5 mL發(fā)酵液離心，12 000 r/min離心5 min后，用去離子水洗滌2次，在85℃下干燥至恒重。

1.2.5 溶劑測(cè)定方法

用氣相色譜 HP-INNOWAX(19091N-233)測(cè)定溶劑各組分，F(xiàn)ID檢測(cè)器。色譜條件：毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.50 μm)，柱溫 100℃；進(jìn)樣溫度250℃；FID檢測(cè)器溫度300℃，H2流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min；載氣N2流速30 mL/min；進(jìn)樣量0.2 μL，分流比50∶1。采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為異丁醇。

2 結(jié)果與討論

發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)C.acetobutylicum生長和溶劑生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控至關(guān)重要。目前以玉米為原料生產(chǎn)丁醇，按照發(fā)酵要求濃度調(diào)配的粉漿蒸煮后，冷卻到發(fā)酵溫度即可使用，無需添加任何營養(yǎng)組分。與玉米原料相比，菊芋塊莖灰分偏高，磷含量足以滿足需求，但蛋白含量很低，因此以菊芋汁為發(fā)酵底物是否需要補(bǔ)充氮源，需要通過實(shí)驗(yàn)來確定。此外，已有研究工作表明生物素和氨基苯甲酸是C.acetobutylicum菌體生長和溶劑生產(chǎn)必需的維生素[9]，但菊芋汁水解液作為發(fā)酵底物是否需要添加這兩種維生素尚未見報(bào)道。

2.1 氮源對(duì)菊芋汁丁醇生產(chǎn)的影響

添加乙酸鹽有助于溶劑生產(chǎn)[10]，因此乙酸銨是C.acetobutylicum培養(yǎng)的良好氮源。表1所示為向培養(yǎng)基中添加2.3 g/L乙酸銨時(shí)批式發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢?，與對(duì)照組相比，添加乙酸銨沒有明顯促進(jìn)溶劑，特別是丁醇的生產(chǎn)，表明菊芋汁水解液作為底物培養(yǎng)C.acetobutylicumL7生產(chǎn)丁醇不需要添加氮源。

表1 培養(yǎng)基中氮源對(duì)菊芋汁丁醇發(fā)酵的影響Table 1 Effect of nitrogen sources on butanol production from Jerusalem artichoke juice hydrolysate by C.acetobutylicum L7

2.2 鄰氨基苯甲酸和生物素對(duì)菊芋汁水解液丁醇生產(chǎn)的影響

表2所示為菊芋汁酸水解液中添加鄰氨基苯甲酸和生物素對(duì)溶劑生產(chǎn)的影響?？梢姡c未添加這兩種維生素的對(duì)照組相比，不論是單獨(dú)添加還是混合添加，均沒有顯著影響，表明菊芋汁水解液作為底物培養(yǎng)C.acetobutylicumL7生產(chǎn)丁醇不需要添加這兩種維生素。

可見，盡管菊芋塊莖的營養(yǎng)組份不如玉米豐富，但足以滿足C.acetobutylicumL7培養(yǎng)生產(chǎn)丁醇的需要，這對(duì)降低丁醇生產(chǎn)成本十分有利。

2.3 菊芋汁水解液為底物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇

菊芋汁水解液是以果糖和葡萄糖為主要成分的混合糖，其發(fā)酵過程糖消耗、菌體生長和溶劑各組分生成情況圖1～5所示。

表2 培養(yǎng)基中生長因子對(duì)菊芋汁丁醇發(fā)酵的影響Table 2 Effect of growth factors on butanol production from Jerusalem artichoke juice hydrolysate by C.acetobutylicum L7

圖1 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵過程殘?zhí)菨舛鹊淖兓疐ig.1 Time course of residual sugars during butanol production byC.acetobutylicumL7.

圖2 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵過程生物量濃度的變化Fig.2 Time course of biomass during butanol production byC.acetobutylicumL7.

圖3 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生產(chǎn)丁醇Fig.3 Time course of butanol production byC.acetobutylicumL7.

圖4 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮Fig.4 Time course of acetone production byC.acetobutylicumL7.

圖5 丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇Fig.5 Time course of ethanol production byC.acetobutylicumL7.

從圖1可見，以菊芋汁水解液為底物時(shí)，糖消耗進(jìn)程與以果糖為碳源的培養(yǎng)基一致，因?yàn)榫沼笾庖夯旌咸堑闹饕M分是果糖，但在培養(yǎng)進(jìn)入到約16 h時(shí)，菌體生長開始進(jìn)入靜止期(圖2)，以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基糖消耗速率比果糖和菊芋汁水解液為碳源的培養(yǎng)基快，而此時(shí)產(chǎn)物丁醇開始大量合成，如圖3所示，至34 h丁醇濃度到最大值9.73 g/L；而以果糖和菊芋汁酸水解液為碳源的培養(yǎng)基，丁醇生成相對(duì)緩慢，發(fā)酵至60 h丁醇濃度分別達(dá)到最大值8.93 g/L和8.67 g/L，表明C.acetobutylicum在丁醇合成階段葡萄糖代謝速率比果糖快，但其機(jī)理有待建立胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)，分析相關(guān)代謝途徑通量分布來闡明。

丙酮和乙醇是C.acetobutylicum丁醇發(fā)酵的共生產(chǎn)物。圖4和圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙酮和乙醇與丁醇生成同步。以葡萄糖為底物時(shí)，其最高濃度分別為7.32 g/L和0.92 g/L，而以果糖為底物時(shí)，分別為6.75 g/L和0.73 g/L，當(dāng)以菊芋汁水解液為底物時(shí)，分別為5.41 g/L和0.83 g/L。

丁醇、丙酮和乙醇的比例是衡量丁醇發(fā)酵水平的主要指標(biāo)之一，發(fā)酵終點(diǎn)丁醇的比例越高，其生產(chǎn)的技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)就越好。目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室研究普遍使用的C.acetobutylicum菌株，其發(fā)酵終點(diǎn)丁醇、丙酮和乙醇的比例一般在 6∶3∶1的水平，而生產(chǎn)上使用的工業(yè)菌株可以使丁醇、丙酮和乙醇的比例維持在 7∶2∶1的水平。菊芋汁水解液發(fā)酵溶劑各組分的比例如表 3所示，可見與果糖為碳源的培養(yǎng)基相比基本相同，但與葡萄糖為碳源相比，丁醇比例略低，而丙酮比例有所提高。值得注意的是，這3種不同碳源培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乙醇生成比例基本相同，占總?cè)軇┑谋壤s 5%，而以往研究工作報(bào)道乙醇占總?cè)軇┑谋壤s10%，目前正在對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行分析。

2.4 高濃度菊芋汁水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁醇

丁醇對(duì)菌體具有強(qiáng)抑制效應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)物濃度低，是丁醇生產(chǎn)能耗高的主要原因。提高培養(yǎng)基初始糖濃度，是提高發(fā)酵液丁醇濃度的前提條件。表4所示為菊芋汁水解液中不同初始糖濃度發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可見當(dāng)糖濃度提高到62.87 g/L時(shí)，雖然發(fā)酵時(shí)間延長到84 h，但丁醇濃度從8.67 g/L增加到11.21 g/L，繼續(xù)提高糖濃度到95.63 g/L時(shí)，雖然丁醇濃度略有增加，達(dá)到12.56 g/L，但此時(shí)發(fā)酵液殘?zhí)菨舛纫呀?jīng)高達(dá)37.00 g/L，呈嚴(yán)重過剩狀態(tài)。另一方面，隨底物初始糖濃度的提高，丁醇占總?cè)軇┑谋壤黾?，丙酮生成比例相?yīng)減少，表明發(fā)酵過程糖過剩有利于C.acetobutylicumL7胞內(nèi)代謝從丙酮合成向丁醇合成途徑調(diào)節(jié)，但糖過剩不僅導(dǎo)致原料的浪費(fèi)，增加丁醇生產(chǎn)的原料消耗，而且增加發(fā)酵醪精餾操作分離丁醇的難度。因此，優(yōu)化培養(yǎng)基初始糖濃度，使其適量過剩以提高總?cè)軇┲卸〈嫉谋壤?，?duì)丁醇生產(chǎn)十分重要。

表3 菊芋汁水解液、葡萄糖和果糖作為碳源發(fā)酵丁醇性能的比較Table 3 Effect of different carbon sources on butanol production by C.acetobutylicum L7

表4 C.acetobutylicum L7發(fā)酵不同糖濃度菊芋汁酸水解液生產(chǎn)丁醇Table 4 Effect of initial sugar concentration of Jerusalem artichoke juice hydrolysate on butanol production by C.acetobutylicum L7

3 展望

菊芋汁水解液作為C.acetobutylicumL7培養(yǎng)生產(chǎn)丁醇的底物，其發(fā)酵性能與以果糖為碳源的培養(yǎng)基相似，且其天然營養(yǎng)組分可以滿足菌體生長和丁醇生產(chǎn)的基本要求，有助于工業(yè)生產(chǎn)過程節(jié)省輔助原料消耗，降低生產(chǎn)成本。

丁醇生產(chǎn)面臨的最大問題是成本高。降低丁醇生產(chǎn)成本可以從兩方面入手：一是開發(fā)高濃度發(fā)酵技術(shù)，提高發(fā)酵醪中丁醇濃度，節(jié)省能耗；二是提高總?cè)軇┲卸〈急壤?，?jié)省原料消耗。以菊芋為原料生產(chǎn)丁醇，不論是菊芋汁，還是直接使用菊芋塊莖，圍繞提高發(fā)酵終點(diǎn)丁醇濃度和總?cè)軇┲卸〈急壤?，都有大量的研究工作需要開展，但這一原料體系與以秸稈為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)相比，易于處理獲得可發(fā)酵性糖，與糧食類淀粉質(zhì)原料相比，其種植不擠占耕地，不會(huì)產(chǎn)生影響糧食安全的問題，因此菊芋原料生產(chǎn)丁醇的基礎(chǔ)研究和技術(shù)開發(fā)將越來越被關(guān)注。

REFERENCES

[1]Dürre P.Biobutanol: an attractive biofuel.Biotechnol J,2007, 2: 1525?1534.

[2]Jones DT, Woods DR.Acetone-butanol fermentation revisited.Microbiol Rev, 1986, 50: 484?524.

[3]Long XH, Liu ZP, Wang L,et al.Effects of seawater irrigation on yield composition and ion distribution of different varieties of helianthus tuberosus in coastal mudflat of semiarid region.Acta Pedol Sin, 2007, 44:300?306.隆小華, 劉兆普, 王琳, 等.半干旱地區(qū)海涂海水灌溉對(duì)不同品系菊芋產(chǎn)量構(gòu)成及離子分布的影響.土壤學(xué)報(bào), 2007, 44: 300?306.

[4]Khodzhaeva MA, Kondratenko ES.The structure of the inulin fromInula grandis.Chem Nat Compd, 1982, 3:394?395.

[5]Denoroy P.The crop physiology ofHelianthus tuberosusL.: a model orientated view.Biomass Bioenerg, 1996, 11:11?32.

[6]Nakamura T, Ogata Y, Hamada S,et al.Ethanol production from Jerusalem artichoke tubers byAspergillus niger andSaccharomyces cerevisiae.J Ferment Bioeng,1996, 81: 564?566.

[7]Caserta G, Cervigni T.The use of Jerusalem artichoke stalks for the production of fructose or ethanol.Bioresource Technol, 1991, 35: 247?250.

[8]Miller GL.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.Anal Chem, 1959, 31:426?428.

[9]Soni BK, Soucaille P, Goma G.Continuous acetone-butanol fermentation: influence of vitamins on the metabolic activity ofClostridium acetobutylicum.Appl Microbiol Biotechnol, 1987, 27: 1?5.

[10]Chen CK, Blaschek HP.Acetate enhances solvent production and prevents degeneration inClostridum beijerinckiiBA101.Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 52:170?173.

Butanol production from hydrolysate of Jerusalem artichoke juice by Clostridium acetobutylicum L7

Lijie Chen1, Chengxun Xin2, Pan Deng1, Jiangang Ren1, Huanhuan Liang1, and Fengwu Bai1
1 School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China 2 Daqing Nine Ring Bio New Energy Co., Ltd., Daqing 163511, China

Received:May 17, 2010;Accepted:June 13, 2010

Corresponding author:Fengwu Bai.Tel/Fax: +86-411-84706329; E-mail: fwbai@dlut.edu.cn