菘藍(lán)的染色體制片技術(shù)及核型研究

鹿 萍

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

菘藍(lán)的染色體制片技術(shù)及核型研究

鹿 萍

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

目的：建立板藍(lán)根染色體制片技術(shù)及核型分析方法，以解決生產(chǎn)中品種混亂、品種鑒定的實(shí)際問題.方法：以菘藍(lán)種子萌發(fā)后的根尖細(xì)胞為材料，用不同預(yù)處理方法制備染色體標(biāo)本，選擇一種較易制備理想的染色體標(biāo)本的方法，并利用這些染色體標(biāo)本對二倍體與四倍體染色體進(jìn)行了核型分析.結(jié)果：確定了菘藍(lán)染色體的制片方法，獲得了二倍體、四倍體染色體圖片，通過分析二倍體染色體數(shù)為14條，核型為公式為2n=2x=14=14m，四倍體染色體數(shù)為28條，核型公式為4n=4x=28=28m.

菘藍(lán)；染色體制片技術(shù)；核型研究

十字花科植物菘藍(lán)(Isatis indigotica)的根稱為板藍(lán)根（Radix Isatidis），板藍(lán)根藥理作用具有抗菌抗病毒，抗鉤端螺旋體及解毒作用.臨床應(yīng)用可治流行性感冒，預(yù)防流行性腮腺炎，治肝硬化，治肝炎等作用.目前，在生產(chǎn)中，板藍(lán)根品種較為混亂，加上藥材生產(chǎn)基地間的頻繁引種，使藥材生產(chǎn)者對板藍(lán)根的品種難以確定，直接影響了板藍(lán)根藥材質(zhì)量的穩(wěn)定，以及生產(chǎn)規(guī)范化的進(jìn)行.因此，建立簡便的品種鑒定方法具有重要意義.同時(shí)，在對菘藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)研究和育種過程中，也常常需要進(jìn)行染色體檢查.染色體計(jì)數(shù)可以揭示物種的基本種性.對于雙親染色體不等的種間雜種，染色體計(jì)數(shù)還可以被直接用來判斷雜種的真實(shí)性.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為二倍體種安國菘藍(lán)和四倍體種安國菘藍(lán)的種子.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 催芽 在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上兩層濾紙，在濕潤的條件下將種子培養(yǎng)萌根，在30℃左右的溫度下，待萌發(fā)后根長0.5—1.5cm時(shí)，保留根尖切下約0.5cm左右的一段作為材料.

1.2.2 預(yù)處理 （Ⅰ）將材料置于暗處的敞口培養(yǎng)皿中，用冰水混合物剛浸沒材料，處理12h以上；（Ⅱ）在18℃的恒溫振蕩器（THZ-C）中，用現(xiàn)配的0.002mol.L-1的8-羥基喹啉剛浸沒敞口培養(yǎng)皿里的材料，黑暗下振蕩，30次/min，處理1-4h.在早晨8：00~9：00之間切取根尖和卷須，設(shè)計(jì)四種預(yù)處理.a、對照，不預(yù)處理.b、（Ⅰ）；c、（Ⅱ）；d、（Ⅰ）+（Ⅱ）.

1.2.3 固定 將經(jīng)過預(yù)處理的材料用蒸餾水洗去殘液，用現(xiàn)配的Carnoy’sⅠ固定液（無水酒精的體積：冰醋酸體積=3：1）和改良Carnoy’sⅡ固定液（無水酒精：氯仿：冰醋酸=5：2：3）于低溫暗處固定材料12h以上，然后轉(zhuǎn)入70%酒精中，冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.4 解離 用1mol/LHCl在電熱恒溫水箱（HH8型）中于嚴(yán)格的60℃下解離.比較5-6min和10-15min兩種時(shí)間的解離效果.材料經(jīng)解離后，用蒸餾水洗滌數(shù)次，將材料中的酸洗凈，以便染色.

1.2.5 染色壓片 先用Schiff’s試劑（脫色的堿性品紅）于室溫下暗處染色1h再用1%醋酸洋紅復(fù)染，微烤，敲片、壓片.

1.2.6 鏡檢與攝影 OLYMPUS顯微成像系統(tǒng)鏡檢（BH-2）%照相.先用低倍鏡尋找30個(gè)分裂相良好的細(xì)胞，確定處于不同分裂時(shí)期的細(xì)胞百分率，然后用高倍鏡仔細(xì)觀察各時(shí)期染色體的行為和特征.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對實(shí)驗(yàn)的影響

根據(jù)處理效果，發(fā)現(xiàn)以低溫和化學(xué)藥劑結(jié)合的處理對于根尖是效果最佳，中期分生細(xì)胞的比例高達(dá)10~15%，僅低溫處理與不處理的幾乎沒有區(qū)別，分裂指數(shù)都界于1%~5%，兩種固定液對根尖的作用等效.對于解離過程超過10min，則容易出現(xiàn)染色體松軟膨化現(xiàn)象（表1）.

2.2 二倍體菘藍(lán)與四倍體菘藍(lán)核型分析

二倍體核型模式圖見圖1：2，核型圖見圖2：1，核型分析結(jié)果見表2.

表1 對菘藍(lán)根尖進(jìn)行的不同處理及其效果的比較

表2 核型分析結(jié)果

根據(jù)上述圖、表分析，菘藍(lán)二倍體染色體的組型公式為：2n=2x=14=14m，全組染色體總長度為12.61μm，染色體長度變異范圍為1.25-2.15μm，全為小染色體.屬4A類核型.

四倍體核型模式圖見圖1，核型圖見圖2，核型分析結(jié)果見表2.

由上述圖、表可知菘藍(lán)二倍體染色體組型公式為：4n=4x=28=28m,全組染色體總長度為23.96μm，染色體長度變異范圍為1.16-2.62μm，全為小染色體.屬4A類核型.

圖1 核型模式圖

3 討論

（1）菘藍(lán)染色體很小，因此，在測量長臂和短臂時(shí)，難以確定長、短臂的分解線，只有制作染色體分散、染色體分開，而著絲粒未分開的染色體標(biāo)本，并把染色體相片盡量放大，才能較準(zhǔn)確的確定著絲點(diǎn)的位置，使數(shù)據(jù)可靠.

（2）本實(shí)驗(yàn)最終確立的卷須制片流程為：取新萌發(fā)的根尖1-3cm，在通氣性良好的器皿中用冰水混合物暗處處理12h以上，然后于18℃下用8-羥基喹啉遮光處理2-4h，用Carony’s II固定液固定24h（隨后可以轉(zhuǎn)到70%酒精中冰箱中保存?zhèn)溆茫?，?jīng)1mol.L-1HCl于嚴(yán)格60℃下解離10-20min后，切取根尖1.5-3mm的分生區(qū)，用Schiff試劑于陰涼處遮光染色1h，再用1%醋酸洋紅滴染、微烤、敲片、壓片、鏡檢和照相.

（3）最后確立了四倍體菘藍(lán)為28條染色體，為二倍體加倍.

圖2 核型圖

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R285.5

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1673-260X（2010）01-0022-03