豬γ干擾素的表達(dá)及其抗病毒活性的安全檢測

賀番，孫元，葛金英，李淼，常天明，步志高，仇華吉

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001

2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018

豬γ干擾素的表達(dá)及其抗病毒活性的安全檢測

賀番1,2，孫元1，葛金英1，李淼1，常天明1，步志高1，仇華吉1

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001

2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018

為了提高干擾素抗病毒活性測定的生物安全性，本研究使用含有 GFP的復(fù)制缺陷型水皰性口炎病毒(VSV△G*G)為指示病毒，分別對經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組豬γ干擾素(PoIFN-γ)在MDBK細(xì)胞上進(jìn)行抗病毒活性測定。結(jié)果顯示：由桿狀病毒表達(dá)的重組PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性為105IU/mL，原核表達(dá)的重組PoIFN-γ純化后經(jīng)緩慢復(fù)性也會(huì)產(chǎn)生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性為32 IU/mL。該方法與利用表達(dá) GFP的重組水皰性口炎病毒(VSV*GFP)所檢測的干擾素抗病毒活性結(jié)果完全一致，表明復(fù)制缺陷型病毒VSV△G*G可作為復(fù)制型重組病毒的替代品，使得干擾素抗病毒活性檢測更加安全、準(zhǔn)確。

豬γ干擾素，桿狀病毒，抗病毒活性檢測

Abstract:In order to ensure the biosafty of the IFN-γ antiviral activity assay, we used a replication-deficient VSV carrying GFP as an interferon sensitive indicator virus(VSV△G*G).The antiviral activities of porcine IFN-γ expressed inEscherichia coliand in baculovirus on MDBK cells were assessed.The results showed that the antiviral activity of porcine IFN-γ expressed in baculovirus could reach 105IU/mL, while the porcine IFN-γ expressed inE.colishowed some antiviral activity(32 IU/mL)after refolding.The results of the VSV△G*G-based antiviral assay were almost identical to that of the VSV*GFP-based assay, suggesting it is highly feasible to use VSV△G*G as a substitute for VSV*GFP, making assays for IFN-γ antiviral activity safer and more accurate.

Keywords:porcine interferon-γ, baculovirus, antiviral activity

干擾素(Interferon，IFN)是在特定的誘生劑作用下，由細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有高度生物活性的糖蛋白，在同種動(dòng)物細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性。1957年，Isaacs等首先發(fā)現(xiàn)病毒感染的細(xì)胞能產(chǎn)生一種因子，作用于其他細(xì)胞能干擾病毒的復(fù)制，因而命名為干擾素[1]。目前已知干擾素并不能直接殺傷病毒，而是誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)種酶，干擾病毒的基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白組分的翻譯。根據(jù)產(chǎn)生干擾素細(xì)胞的來源不同、理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的差異，可分為Ⅰ型和Ⅱ型IFN，Ⅰ型IFN主要包括IFN-α、β、ω、δ、κ、ε、ξ和 τ等，Ⅱ型 IFN 只有 IFN-γ一種[2]。IFN-γ主要由機(jī)體內(nèi)活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生[3]。當(dāng)抗原、PHA或ConA刺激后T細(xì)胞分泌產(chǎn)生IFN-γ，通常與IL-2的產(chǎn)生相一致。IFN-γ對酸敏感，具有抑制病毒復(fù)制調(diào)節(jié)作用，但其抗病毒作用比Ⅰ型干擾素弱[4]，主要參與誘導(dǎo)主要組織相容性抗原(MHC)的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，也稱為免疫干擾素。

豬γ干擾素(PoIFN-γ)的編碼基因?yàn)?01 bp，編碼 166個(gè)氨基酸，前 23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，后143個(gè)氨基酸為成熟活性蛋白，天然活性狀態(tài)為同源二聚體的糖蛋白，單體沒有生物學(xué)活性[5]。由于IFN-γ具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能和抗腫瘤作用，是機(jī)體細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，故其在疾病的診斷、治療和預(yù)防等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。1981年，Godkin等首先將 IFN-γ基因克隆成功[6]。1990年，Dijikmans等克隆了含內(nèi)含子的PoIFN-γ基因[7]。隨后，Vandenbroeck等分段克隆了 PoIFN-γ基因的外顯子并將其拼接為完整基因后在大腸桿菌[8]和昆蟲細(xì)胞[9]中進(jìn)行了表達(dá)。1999年Cencic等在兔腎細(xì)胞中表達(dá)了 PoIFN-γ[10]。國內(nèi)研究者也先后利用不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PoIFN-γ，但抗病毒活性較低或不具有活性[11-14]。

干擾素生物學(xué)活性定量分析的研究從干擾素被發(fā)現(xiàn)以來就一直沒有間斷過?？共《痉治龇椒?Antiviral assay，AVA)是第一個(gè)建立起來的檢測IFN樣品相對活性或效能的生物學(xué)方法[15]?，F(xiàn)有的干擾素生物學(xué)活性鑒定與定量分析方法普遍存在費(fèi)時(shí)、繁瑣、不夠精確、特異性差等一系列缺陷，亟待改進(jìn)。近年來我國有研究者利用表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的重組水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)(VSV*GFP)[16]以及MDBK-Mxp-luc細(xì)胞系來檢測牛β干擾素的抗病毒活性[17]，使檢測過程更加便捷、準(zhǔn)確。

將外源提供的病毒囊膜蛋白包裝在缺失編碼相同蛋白基因病毒的核酸上所形成的病毒，稱為復(fù)制缺陷型病毒。復(fù)制缺陷型病毒具有安全性好、易于檢測、宿主范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，雖然其缺少復(fù)制能力，但是在研究病毒進(jìn)入過程、受體鑒定、中和抗體檢測、疫苗評(píng)價(jià)等方面具有重要作用。本研究利用表達(dá)GFP的復(fù)制缺陷型VSV(VSV△G*G)[18]代替復(fù)制型重組病毒VSV*GFP，通過對大腸桿菌和重組桿狀病毒表達(dá)的PoIFN-γ在MDBK細(xì)胞上進(jìn)行抗病毒生物活性測定，建立了一種干擾素生物學(xué)活性定量分析方法，該方法與利用重組 VSV*GFP病毒的抗病毒活性檢測方法所測定結(jié)果完全符合，且比后者更為安全、準(zhǔn)確。

1 材料和方法

1.1 材料

PoIFN-γ編碼基因由上海英駿生物有限公司合成(含6個(gè)His標(biāo)簽的編碼序列，以便于蛋白的純化)。原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-30a(+)、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHT B及感受態(tài)DH10BacTM受體菌及轉(zhuǎn)染試劑(Cellfectin reagent)購于美國Invitrogen公司。質(zhì)粒pVSV-G、Sf9細(xì)胞、MDBK細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。PoIFN-γ單抗購自SANTA公司，熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗、抗 His標(biāo)簽單抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG購自 Sigma公司。VSV*GFP及VSV△G*G參見文獻(xiàn)報(bào)道[16,18]。

1.2 原核表達(dá)重組PoIFN-γ蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和鑒定

1.2.1 重組蛋白的表達(dá)

將合成的PoIFN-γ基因經(jīng)BamH I和Hind III限制酶雙酶切后克隆于原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-30a(+)的相應(yīng)位點(diǎn)，PoIFN-γ基因閱讀框架與His標(biāo)簽融合。鑒定正確后轉(zhuǎn)化BL21，用IPTG誘導(dǎo)，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.2 原核表達(dá)重組蛋白的鑒定

參照文獻(xiàn)[19]方法進(jìn)行Western blotting鑒定。一抗為PoIFN-γ單抗和抗His標(biāo)簽單抗(用PBS溶液分別做1:100和1:3000稀釋)，二抗為紅外熒光抗鼠二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG(1:4000稀釋)，利用紅外熒光掃描儀檢測結(jié)果和用DAB顯色。

1.2.3 重組蛋白的純化

根據(jù)His·Bind純化試劑盒說明書，利用Ni2+樹脂柱對大腸桿菌表達(dá)的重組PoIFN-γ(His-PoIFN-γ)進(jìn)行純化。

1.3 PoIFN-γ基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)及鑒定

1.3.1 重組桿粒的獲得

將合成的PoIFN-γ基因經(jīng)BamH I和Aat Ⅱ限制酶雙酶切后克隆于桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHT B的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得重組轉(zhuǎn)移載體 pFB-PoIFN-γ。轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞得到重組桿粒rBacmidPoIFN-γ，利用M13通用引物對其進(jìn)行PCR鑒定。

1.3.2 重組病毒的獲得

參照Cellfectin reagent試劑盒說明書，將鑒定為陽性的rBacmidPoIFN-γ轉(zhuǎn)染 Sf9細(xì)胞，獲得的重組桿狀病毒rBacPoIFN-γ上清，提取基因組后利用M13通用引物對其進(jìn)行PCR鑒定。擴(kuò)大培養(yǎng)rBacPoIFN-γ，將細(xì)胞超聲波破碎進(jìn)行Western blotting檢測。

1.3.3 桿狀病毒表達(dá)蛋白的鑒定

參照文獻(xiàn)[19]方法進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)與 Western blotting鑒定。一抗為抗 PoIFN-γ單抗，間接免疫熒光試驗(yàn)二抗為 FITC標(biāo)記羊抗豬IgG，Western blotting二抗為紅外熒光抗鼠二抗，利用紅外熒光掃描儀檢測結(jié)果。

1.4 重組PoIFN-γ抗病毒活性測定與比較

按文獻(xiàn)報(bào)道的方法[20]，用VSV*GFP/MDBK細(xì)胞系統(tǒng)測定重組 PoIFN-γ抗病毒活性，以 2×104細(xì)胞/孔的密度將MDBK細(xì)胞鋪于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入101～108不同稀釋度的rBacPoIFN-γ感染Sf9細(xì)胞上清(含有重組 PoIFN-γ)以及倍比稀釋后的經(jīng)純化、緩慢復(fù)性的原核表達(dá)的 His-PoIFN-γ，37℃作用過夜，同時(shí)設(shè)不加重組蛋白的孔為對照。100 PFU/孔VSV*GFP感染細(xì)胞，1 h后換完全培養(yǎng)液，24 h后熒光顯微鏡觀察結(jié)果，以熒光亮度為對照孔50%的最高稀釋度為抗病毒活性單位(IU)。

1.5 VSV△G＊G的制備及毒價(jià)測定

采取脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法用4 μg表達(dá)VSV G蛋白的質(zhì)粒pVSV-G轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)基。20 h后用復(fù)制缺陷型水皰性口炎病毒(VSV△G*G)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，24 h后收集細(xì)胞上清，3000 r/min離心10 min以清除細(xì)胞碎片，測定毒價(jià)。

1.6 利用 VSV△G＊G 檢測重組 PoIFN-γ抗病毒活性

按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[20]，將 MDBK細(xì)胞鋪于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入 101～108不同稀釋度的重組 PoIFN-γ(rBacPoIFN-γ感染 Sf9 細(xì)胞上清)，以及倍比稀釋后的經(jīng)純化、緩慢復(fù)性的His-PoIFN-γ，37℃作用過夜。100 PFU/孔VSV△G*G感染細(xì)胞，1 h后換完全培養(yǎng)液，24 h后熒光顯微鏡觀察結(jié)果，以熒光亮度為對照孔50%的最高稀釋度為抗病毒活性單位(IU)。

1.7 相對熒光強(qiáng)度測定

按照 1.6中的方法分別利用 VSV*GFP和VSV△G*G對不同稀釋度的重組PoIFN-γ進(jìn)行抗病毒活性檢測。用以上兩種病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)MDBK細(xì)胞24 h后，用裂解液將細(xì)胞處理30 min，取200 μL置于96孔讀數(shù)板中，在 FLX800-Microplate Fluorescence Reader(Bio-TEK公司產(chǎn)品)上測定每孔中的相對熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 PoIFN-γ基因在大腸桿菌中的表達(dá)

用抗His標(biāo)簽單抗進(jìn)行Western blotting，結(jié)果表明原核表達(dá)的His-PoIFN-γ蛋白大小為25 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符。同時(shí)設(shè)含有 His標(biāo)簽的無關(guān)蛋白為陽性對照，pET-30a(+)空載體轉(zhuǎn)化菌為陰性對照。利用PoIFN-γ單抗的Western blotting結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)目的蛋白獲得表達(dá)(圖1、2)。

圖1 用抗His標(biāo)簽單抗對His-PoIFN-γ蛋白進(jìn)行Western blotting分析Fig.1 Western blotting analysis of His-PoIFN-γ protein with anti-His-tag McAb.M: PageRulerTMprestained proteinladder;1: purified His-PoIFN-γ protein; 2: irrelevant E2 protein with His-tag served as the positive control; 3: pET-30a vectortransformedE.colicells served as the negative control.

圖2 用抗 PoIFN-γ單抗對重組 PoIFN-γ進(jìn)行 Western blotting分析Fig.2 Western blotting analysis of recombinant PoIFN-γ with anti PoIFN-γ McAb.M: PageRulerTMprestained protein ladder;1: His-PoIFN-γ protein after purification served as the positive control; 2: Baculovirus-expressed recombinant PoIFN-γ protein;3: Baculovirus-expressed recombinant E2 protein of CSFV as the negative control.

2.2 PoIFN-γ基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

將重組桿狀病毒 rBacPoIFN-γ接種 Sf9細(xì)胞，72 h內(nèi)細(xì)胞病變完全，收集細(xì)胞進(jìn)行破碎，12 000 r/min離心 10 min以去除細(xì)胞碎片，進(jìn)行Western blotting檢測。

結(jié)果表明，原核表達(dá)的His-PoIFN-γ經(jīng)正確的純化、緩慢復(fù)性后可恢復(fù)有活性的二聚體形式(圖2)，之后的抗病毒活性檢測也進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。桿狀病毒表達(dá)的重組PoIFN-γ主要以二聚體形式存在，大小為34 kDa與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)，超聲裂解可少量破壞其二聚體形式。

2.3 IFA檢測PoIFN-γ在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

分別以rBacPoIFN-γ感染Sf9細(xì)胞，至細(xì)胞病變達(dá) 90%時(shí)將細(xì)胞固定，用 1:100稀釋的抗 PoIFN-γ單抗進(jìn)行IFA檢測，同時(shí)以1:100稀釋的抗豬瘟E2蛋白的單抗為陰性對照。結(jié)果顯示，抗 PoIFN-γ單抗檢測rBacPoIFN-γ感染Sf9細(xì)胞顯示陽性熒光信號(hào)(圖3A)，而抗豬瘟 E2蛋白的單抗則熒光信號(hào)為陰性(圖3B)，表明PoIFN-γ在昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)。

2.4 重組PoIFN-γ的抗病毒活性

利用 VSV*GFP/MDBK系統(tǒng)測定重組 PoIFN-γ抗病毒活性，以不同濃度桿狀病毒表達(dá)重組PoIFN-γ上清以及原核表達(dá)純化后 PoIFN-γ作用 MDBK細(xì)胞，37℃過夜，感染VSV*GFP，24 h后觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，未加重組 PoIFN-γ空白對照，細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，103倍稀釋可以完全抑制VSV*GFP的復(fù)制，細(xì)胞無明顯細(xì)胞病變，且無熒光出現(xiàn)，104和105倍稀釋部分抑制 VSV*GFP的復(fù)制，106倍稀釋幾乎不能抑制VSV*GFP的復(fù)制，105倍稀釋組的熒光亮度約為空白對照組的一半，測得其抗病毒活性為105IU/mL(圖4A)；用相同濃度桿狀病毒表達(dá)的豬瘟病毒E2蛋白上清作用MDBK細(xì)胞的對照組細(xì)胞也出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變同時(shí)可觀察到大量熒光(圖4B)；只用重組PoIFN-γ處理的MDBK細(xì)胞狀態(tài)良好，無細(xì)胞病變，與正常MDBK細(xì)胞無差異(圖5A)。而原核表達(dá)的HisPoIFN-γ在稀釋32倍后則完全失去抗病毒活性，表明 PoIFN-γ的空間結(jié)構(gòu)對其生物學(xué)活性會(huì)產(chǎn)生很大影響。

2.5 利用復(fù)制缺陷型病毒檢測重組PoIFN-γ抗病毒活性

利用復(fù)制缺陷型病毒 VSV △ G*G/MDBK 系統(tǒng)重新對重組 PoIFN-γ抗病毒活性進(jìn)行測定，期望找到一種更加安全、準(zhǔn)確的檢測方法。結(jié)果表明，利用復(fù)制缺陷型病毒測定重組 PoIFN-γ的抗病毒活性與利用重組病毒 VSV*GFP所測定的結(jié)果完全一致(圖6)。復(fù)制缺陷型病毒作為復(fù)制型重組病毒的替代品也會(huì)引起細(xì)胞病變(圖5B)。

2.6 兩種病毒檢測PoIFN-γ抗病毒活性的比較

通過檢測相對熒光強(qiáng)度比較不同稀釋度重組PoIFN-γ在 VSV*GFP/MDBK 和 VSV △ G*G/MDBK系統(tǒng)的抗病毒活性，結(jié)果表明，兩種系統(tǒng)的測定結(jié)果盡管存在差異，但總體趨勢一致(圖7)，說明復(fù)制缺陷型病毒能夠作為復(fù)制型重組病毒的替代品用于抗病毒活性檢測。

3 討論

圖3 用IFA檢測重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中的PoIFN-γ表達(dá)情況Fig.3 Detection of the PoIFN-γ expression in Sf9 cells infected with the recombinant baculovirus rBacPoIFN-γ.(A)Sf9 cells infected with rBacPoIFN-γ expressing PoIFN-γ.(B)Sf9 cells infected with the recombinant baculovirus expressing E2 protein served as the negative control.

圖4 不同濃度重組桿狀病毒表達(dá)的重組PoIFN-γ抑制VSV＊GFP在MDBK細(xì)胞上復(fù)制Fig.4 Inhibition of the replication of VSV*GFP in MDBK cells with differently diluted recombinant PoIFN-γ expressed from recombinant baculovirus.(A)Baculovirus-expressed recombinant PoIFN-γ at different dilutions.(B)Baculovirus-expressed recombinant E2 protein of CSFV at different dilutions.

干擾素一直是病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。干擾素與特異性抗體不同，其主要發(fā)揮的是抗病毒感染效力。對干擾素進(jìn)行AVA檢測時(shí)需要用干擾素提前24 h處理細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)種酶，以抵抗病毒的感染，進(jìn)一步干擾病毒的基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白組分的翻譯，從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用。如果說中和試驗(yàn)是利用中和抗體將病毒中和，從量上減少病毒的感染能力；干擾素就是從質(zhì)上對細(xì)胞產(chǎn)生作用，使其抗感染能力增強(qiáng)。

IFN-γ單體沒有生物學(xué)活性，其天然活性形式為兩條單體鏈結(jié)合形成的同型二聚體形式，它能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)功能，是機(jī)體細(xì)胞免疫的重要檢測指標(biāo)之一，在疾病的診斷、治療和預(yù)防等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。IFN-γ基因在正常情況下處于抑制狀態(tài)，只有在某些刺激因子的刺激下才能表達(dá)，同時(shí)IFN-γ產(chǎn)量低、純化困難、成本比較高，難以大量制備，隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，可以利用該技術(shù)大量制備IFN-γ。目前廣泛采用的原核表達(dá)系統(tǒng)雖然可以將 IFN-γ蛋白大量表達(dá)，但是純化、復(fù)性工藝復(fù)雜，而且表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性與真正天然干擾素相比存在明顯差距。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有與高等真核細(xì)胞類似的蛋白質(zhì)修飾、加工和轉(zhuǎn)運(yùn)體系，經(jīng)常用來表達(dá)具有特定結(jié)構(gòu)功能的蛋白。由桿狀病毒表達(dá)的重組蛋白在抗原性、免疫原性和功能上均與天然蛋白相似。因此，桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)是研究蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的一個(gè)有力工具。本研究同時(shí)利用原核表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)PoIFN-γ并進(jìn)行抗病毒活性分析，結(jié)果表明：與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可以對外源蛋白進(jìn)行多種翻譯后加工和修飾，表達(dá)的重組蛋白更接近天然結(jié)構(gòu)?？共《净钚詸z測表明經(jīng)桿狀病毒表達(dá)的PoIFN-γ的抗病毒活性可達(dá)105IU/mL，而原核表達(dá)PoIFN-γ經(jīng)純化后緩慢復(fù)性也會(huì)產(chǎn)生少量的二聚體，產(chǎn)生較低的抗病毒活性。本研究獲得的重組PoIFN-γ為后續(xù)單克隆抗體的制備以及最終建立評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫水平的檢測 PoIFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(Enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)提供技術(shù)支持。

圖5 VSV＊GFP(A)或 VSV △ G ＊G(B)感染MDBK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變Fig.5 Cytopathic effects(CPE)produced in MDBK cells infected with VSV*GFP(A)or VSV?G*G(B).

圖6 重組桿狀病毒表達(dá)的不同濃度PoIFN-γ對VSV△G＊G感染MDBK細(xì)胞的抑制作用Fig.6 Inhibition of infection of VSV?G*G in MDBK cells with differently diluted PoIFN-γ expressed from recombinant baculovirus.(A)Baculovirus-expressed recombinant PoIFN-γ protein of different dilutions.(B)Baculovirus-expressed recombinant E2 protein of CSFV of different dilutions.

圖7 利用兩種病毒檢測重組PoIFN-γ抗病毒活性的比較Fig.7 Comparison of recombinant PoIFN-γ antiviral activity using the two virus systems.

在眾多干擾素生物學(xué)活性的研究方法中，AVA是最常用的檢測方法[15]，而且適用各種類型的干擾素，成本較低，一般實(shí)驗(yàn)室都具備進(jìn)行抗病毒分析的條件，現(xiàn)在仍被廣泛使用。AVA檢測包含兩方面的內(nèi)容：抵抗病毒感染和抑制病毒復(fù)制。其中，抵抗病毒的感染是檢測的基礎(chǔ)，只有先抵抗病毒的侵染才能進(jìn)一步抑制病毒的復(fù)制。AVA檢測的判定時(shí)間對檢測結(jié)果十分重要，檢測一般都是在用病毒感染細(xì)胞20 h之后進(jìn)行觀測，這時(shí)主要測定的是干擾素對病毒的抗感染能力。若是以測定干擾素抑制病毒的復(fù)制能力為主，在加入病毒后不同的時(shí)間會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)有很大的影響。本研究采用復(fù)制缺陷型病毒作為指示病毒則解決了這一問題。AVA常用的指示病毒為VSV、腦炎心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus，SFV)、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、門戈病毒(Mengovirus)[12]等。其中VSV是最常用的病毒之一，它對干擾素很敏感，復(fù)制很快，在多種細(xì)胞株上都能夠生長至很高滴度[21]。AVA常用的細(xì)胞系有MDBK、A549、WISH、HeLa、Hep2、FS4、FL、2D9和L929等。AVA判定方法有病毒復(fù)制抑制試驗(yàn)(Virus yield-reduction assay，VYRA)[22-24]、蝕斑抑制試驗(yàn)(Plaque reduction assay，PRA)[25]、病毒蛋白表達(dá)或RNA合成抑制試驗(yàn)等，但最常用的細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)(Cytopathic effect reduction assay，CPERA)。VYRA需要滴定每個(gè)孔病毒的滴度，非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而CPERA則相對簡單，節(jié)省時(shí)間，使用也較為廣泛。CPERA常采用半數(shù)CPE抑制作為IFN活性判斷的終點(diǎn)，CPE可肉眼觀察，但主觀性太強(qiáng)以至于準(zhǔn)確性較差，因此，大部分IFN定量工作者均采用細(xì)胞染色(結(jié)晶紫、MTT、MTS或萘酚藍(lán)黑等)的方法，增加判斷的準(zhǔn)確性[15,25]。目前市場上有許多商品化的人和鼠干擾素的單克隆抗體，因此可以直接用ELISA檢測干擾素的相對含量[26]。這不需要準(zhǔn)備細(xì)胞，干擾素樣品可以直接檢測，操作方便。但其缺點(diǎn)是檢測的是干擾素的抗原性，有抗原性而無活性的干擾素分子會(huì)影響干擾素活性的判斷[27]。

反向遺傳技術(shù)使得構(gòu)建帶有報(bào)告基因的VSV成為現(xiàn)實(shí)。在 VSV中插入 GFP獲得重組病毒VSV*GFP，可以在病毒增殖時(shí)通過熒光顯微鏡觀察GFP蛋白的表達(dá)而判斷病毒的增殖情況，可以很容易地進(jìn)行蝕斑計(jì)數(shù)，并可以使用熒光酶標(biāo)儀對 GFP的表達(dá)進(jìn)行定量[16]。2007年，陳偉業(yè)使用表達(dá)GFP的重組VSV(VSV*GFP)在MDBK細(xì)胞上進(jìn)行了干擾素抗病毒活性滴定[17]。此方法在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上操作，通過GFP檢測定量半數(shù)病毒復(fù)制抑制來替代通過細(xì)胞染色定量半數(shù)CPE抑制，利用儀器檢測GFP的相對熒光值(RFU)來定量GFP蛋白的相對含量。這與細(xì)胞染色方法定量半數(shù)CPE相比，步驟得到極大簡化。

VSV是人畜共患病原，涉及到 VSV的所有操作，包括具有增殖能力的重組病毒，均應(yīng)有高等級(jí)的生物安全設(shè)施，因此測定干擾素活性所用病毒的安全性及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對環(huán)境及試劑與耗材的無害化處理問題越來越引起人們的疑慮。本研究利用表達(dá)GFP的復(fù)制缺陷型 VSV(VSV△G*G)來代替表達(dá)GFP的復(fù)制型重組VSV*GFP，分別對原核及桿狀病毒表達(dá)的PoIFN-γ在MDBK細(xì)胞上進(jìn)行了抗病毒生物活性測定。VSV△G*G是通過將外源表達(dá)VSV的G蛋白包裝在缺失了G蛋白基因、攜帶GFP基因的VSV基因組中所獲得的一種復(fù)制缺陷型病毒。與野生型病毒相比，其核酸分子上編碼G蛋白的基因被刪掉，因而不能復(fù)制，只有外源提供G蛋白后才能使其重新包裝成為新的子代病毒，所以這種病毒在宿主細(xì)胞中只能進(jìn)行“一個(gè)細(xì)胞周期”的感染，生物安全性高；同時(shí)由于該病毒不能進(jìn)行復(fù)制，更有利于定量檢測。本研究中利用復(fù)制缺陷型病毒VSV△G*G測定重組PoIFN-γ的抗病毒活性檢測結(jié)果與利用復(fù)制型重組病毒 VSV*GFP的抗病毒活性檢測結(jié)果完全符合，同時(shí)使用復(fù)制缺陷型病毒進(jìn)行檢測會(huì)避免檢測結(jié)果隨時(shí)間的改變而改變的問題，使得對干擾素的活性檢測更為安全、準(zhǔn)確。

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Expression of porcine interferon-γ and its safe antiviral assay

Fan He1,2, Yuan Sun1, Jinying Ge1, Miao Li1, Tianming Chang1, Zhigao Bu1, and Huaji Qiu1
1 State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China 2 College of Animal Science and Animal Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China

Received:November 20, 2009;Accepted:January 28, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2005CB523202).

Corresponding author:Huaji Qiu.Tel: +86-451-85935041; E-mail: huajiqiu@hvri.ac.cn國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2005CB523202)資助。