化橘紅藥材質(zhì)量評價、監(jiān)測與應(yīng)用研究

林勵，李向明，萬建義*，陳志霞，袁旭江，黃蘭珍

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；2.廣東化州市綠色生命有限公司，廣東 化州 525100）

化橘紅藥材質(zhì)量評價、監(jiān)測與應(yīng)用研究

林勵1，李向明2，萬建義2*，陳志霞1，袁旭江1，黃蘭珍1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；2.廣東化州市綠色生命有限公司，廣東 化州 525100）

目的：評價化橘紅質(zhì)量，確定質(zhì)量監(jiān)測方法。方法：以形態(tài)分類法和顯微鑒定法比較原植物及顯微構(gòu)造，以分光光度法比較總黃酮含量，以高效液相色譜法比較柚皮苷含量及指紋圖譜，以薄層掃描法比較野漆樹苷含量。結(jié)果：兩類化橘紅原植物存在外果皮絨毛、莖非腺毛等顯著差異；化橘紅總黃酮含量、柚皮苷含量均高于光橘紅，野漆樹苷含量為光橘紅的10倍，指紋圖譜也有顯著差異。化州柚鮮果重量增加峰值出現(xiàn)在成果41d時，此時其藥材質(zhì)量也較優(yōu)。結(jié)論：道地藥材化橘紅質(zhì)量顯著優(yōu)于光橘紅，化橘紅采收期宜定在41d左右。

化橘紅；品種；鑒別；采收期；指紋圖譜

中藥化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’和柚Citrus grandis（L.）Osbeck未成熟或近成熟的干燥外層果皮，具有理氣寬中，燥濕化痰功能［1］?；蓁质菑V東省化州市特有樹種，已有1 500多年的種植歷史，自古以來，其未成熟果外果皮即作為化橘紅入藥，習(xí)稱化橘紅，系道地化橘紅藥材，品質(zhì)最優(yōu)，曾列為皇室專用祛痰圣藥［2］。柚外果皮于1963年才被作為橘紅入藥，習(xí)稱光橘紅。化橘紅富含黃酮類成分［3］，有祛痰鎮(zhèn)咳作用，其中柚皮苷、野漆樹苷均為活性成分［4，5］。為科學(xué)地評價化橘紅的質(zhì)量，筆者進行了本項試驗。

1 化橘紅藥材質(zhì)量評價及采收期研究

1.1 儀器、試劑、樣品

1.1.1 儀器 Summit680A高效液相色譜儀（德國Dioen），8453E紫外分光光度計（美國Agilent），722型分光光度計（上海分析儀器二廠），CS9000型薄層掃描儀（日本島津）。

1.1.2 試劑 柚皮苷對照品（購自中國藥品生物制品

檢定所，批號722-9004），野漆樹苷對照品（自制，純度 98.13%），甲醇（色譜純），石油醚（60～90℃）、乙醚、冰醋酸、二甲苯、甲酸、甲醇、丙酮、醋酸乙酯、硝酸鋁等試劑均為分析純。

1.1.3 樣品

1.1.3.1 品種質(zhì)量對比用樣品 化橘紅和光橘紅原植物標(biāo)本均采自化州市平定鎮(zhèn)馬力村，化橘紅藥材樣品分別采或購自化州市平定鎮(zhèn)，光橘紅藥材樣品分別購于不同產(chǎn)地。

化橘紅1：2000年5月采于廣東省化州市平定鎮(zhèn)，藥材直徑約為7.0cm；

化橘紅2：2000年4月采于廣東省化州市平定鎮(zhèn)，藥材直徑約4.5cm；

化橘紅3：2000年8月購自廣東省化州市平定鎮(zhèn)，藥材直徑約4cm；

光橘紅1：2001年8月購于湖南，藥材直徑約4.0cm；

光橘紅2：2001年8月購于廣西，藥材直徑約7.0cm；

光橘紅3：購自河南省鄭州市醫(yī)藥總公司醫(yī)藥大廈，藥材直徑約10.5cm。

經(jīng)廣東省中藥研究所丘金裕主任中藥師鑒定，上述藥材中化橘紅原植物均為蕓香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’，光橘紅原植物均為柚Citrus grandis（L.）Osbeck。

1.1.3.2 采收期考察用樣品 試驗樣品均采于化州市平定鎮(zhèn)天堂嶂化橘紅GAP基地，選定5株2004年4月1日形成果實的化橘紅樹，經(jīng)廣東省中藥研究所丘金裕主任中藥師鑒定，其原植物為化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’。20d后（2004年4月21日）開始分株采收果實和樹葉，以后約一周采摘果實和樹葉1次，至2004年6月30日止，共獲12批果實和樹葉樣品，測量每個鮮果直徑和重量，各批果實直徑和重量均值見表1。各樣品常法干燥、粉碎后置干燥器備用。

表1 化橘紅鮮果直徑和重量平均值

1.2 方法

1.2.1 原植物形態(tài)比較 定期采集化橘紅與光橘紅原植物標(biāo)本，照植物形態(tài)分類法對其原植物作比較研究。

1.2.2 莖葉切片處理方法 取生長年限相同、直徑相近的化州柚與柚的莖以滑走切片法切成25μm厚的薄片。將此薄片以番紅和固綠進行染色后依次以低濃度到高濃度的乙醇進行脫水、低濃度到高濃度的二甲苯進行透明，最后以加拿大樹脂封片。晾干，得化州柚和柚莖的永久制片。取生長年限相同、大小和厚度相近的化州柚與柚的葉片以蠟埋后滑走切片法切成30μm厚的薄片，再照莖切片處理方法，得化州柚和柚葉的永久制片，于顯微鏡下觀察。

1.2.3 總黃酮含量測定方法（柚皮苷＋鋁鹽－分光光度法） 分別準(zhǔn)確吸取柚皮苷對照品溶液（6.2mg·mL－1）0，1，2，3，4，5mL于25mL量瓶內(nèi)，準(zhǔn)確加入10%硝酸鋁1mL，搖勻，以缺對照品者為空白對照，分別測定其在384mn處的吸收度值，以吸取量（mL）為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)，求得柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y＝0.186 8X－0.020 8，r＝0.999 96。精密稱定化橘紅約0.2g，分別置索氏提取器中，加入乙醚90mL，提取至無色，棄去乙醚提取液，再加甲醇90mL，提取至無色，甲醇液放冷，移至量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別取定量供試品溶液與對照品溶液依法測定，在150min內(nèi)穩(wěn)定性均良好，加樣回收率為102.95%（RSD＝2.42%），重現(xiàn)性、精密度均良好。

1.2.4 柚皮苷含量測定方法（高效液相色譜法） 色譜柱：LiChrospher?100（RP-18e，5μm，250mm×4mm，Merck）。流動相：甲醇 －冰醋酸 －水（35∶4∶61），過0.45μm濾膜。流速：1.0mL·min－1，檢測波長：283nm，柱溫：40℃。準(zhǔn)確稱取柚皮苷對照品，加甲醇溶解，制成90mg·L－1的溶液，作為對照品溶液。分別準(zhǔn)確吸取柚皮苷對照品溶液2，4，6，8，10μL注入高效液相色譜儀，按上述條件進行測定，以柚皮苷量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得柚皮苷的回歸方程為Y＝1 625.669 09X＋9.369 02，r＝0.999 9。精密稱取化橘紅約0.1g，分別置索氏提取器中，加入石油醚90mL，提取至無色，棄去乙醚提取液，再加甲醇90mL，提取至無色，甲醇液放冷，移至100mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別定量取供試品溶液與對照品溶液適量，按外標(biāo)峰面積法測定柚皮苷含量。加樣回收率為100.2%（RSD＝2.43%），穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度均良好。

1.2.5 野漆樹苷含量測定方法（薄層掃描法） 準(zhǔn)確稱取野漆樹苷對照品，加甲醇溶解，制成270mg·L－1的溶液，作為對照品溶液。取化橘紅約0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，加入石油醚90mL，提取至無色，棄去醚提液，再加甲醇90mL，提取至無色，移出、濃縮、放冷，再移至10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別定量取供試品溶液與對照品溶液適量，以定量毛細(xì)管點樣于GF254預(yù)制薄層板上。展開劑a：醋酸乙酯－丙酮－水（10∶5∶9），搖勻、放置待分層后取上層液10mL＋丙酮1mL＋甲酸0.02mL；展開劑b：醋酸乙酯－丙酮－水（10∶5∶9），搖勻、放置待分層后取上層液10mL＋丙酮1mL。先用展開劑a上行展開，展距8cm，取出晾干后，再用展開劑 b展開，展距8cm，取出，晾干，105℃烘15min，放冷，作光譜掃描，對照品色點與供試品色點均在342nm處有最大吸收峰，確定掃描波長為342nm。準(zhǔn)確吸取對照品溶液0.5，1，2，3，4，5μL于同一薄層板上，先后用a、b展開劑二次展開，取出，晾干，掃描。掃描條件：飛點掃描，λ＝342nm。以面積值為縱坐標(biāo)，點樣量為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y＝103 099.266X＋13 126.960，r＝0.999 0，按外標(biāo)峰面積法測定野漆樹苷含量。加樣回收率為95.17%（RSD＝2.50%），穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度均良好。

1.2.6 指紋圖譜比較方法（高效液相色譜法） 色譜柱：MACHEREY-NAGEL（100-5C18，5μm，250mm×4.6mm）。經(jīng)考察確定流動相，A：甲醇，B：水－冰醋酸（61∶4），梯度洗脫。流速：1.0mL·min－1，檢測波長：283nm（345nm為輔助參考波長），柱溫：25℃。以柚皮苷、野漆樹苷、柚皮苷元對照品為參照物，取同一份供試品溶液，分別在0，1.5，3.5，5.5，25，27h不同時間點進行測定，考察保留時間和峰面積的一致性，柚皮苷保留時間的RSD和峰面積的RSD分別為0.279%和2.68%，穩(wěn)定性良好。取同一份供試品溶液，連續(xù)進樣5次，考察色譜峰保留時間和峰面積的一致性，柚皮苷保留時間的RSD和峰面積的RSD分別為0.304%和2.04%，精密度良好。

1.3 結(jié)果與分析

1.3.1 化橘紅與光橘紅原植物形態(tài)比較研究 依法進行原植物比較研究，兩者原植物形態(tài)有顯著差異，結(jié)果見表2。

表2 化橘紅與光橘紅原植物形態(tài)主要區(qū)別

1.3.2 化橘紅與光橘紅原植物顯微特征比較 依法進行顯微特征比較研究，兩者原植物顯微構(gòu)造有顯著差異，結(jié)果見表3。

表3 化橘紅與光橘紅原植物顯微特征主要區(qū)別

1.3.3 化橘紅與光橘紅總黃酮含量比較 所測化橘紅總黃酮含量均高于光橘紅，結(jié)果見表4。

表4 化橘紅與光橘紅總黃酮含量

1.3.4 化橘紅與光橘紅柚皮苷含量比較 所測化橘紅柚皮苷含量均高于光橘紅，結(jié)果見表5。

表5 化橘紅與光橘紅柚皮苷含量

1.3.5 化橘紅與光橘紅野漆樹苷含量比較 所測化橘紅野漆樹苷含量均顯著高于光橘紅，結(jié)果見表6。

表6 化橘紅與光橘紅野漆樹苷含量

圖1 化橘紅HPLC指紋圖譜

圖2 光橘紅HPLC指紋圖譜

結(jié)果顯示，化橘紅與光橘紅HPLC指紋圖譜有顯著差異，易于鑒別兩者。

1.3.7 不同采收時間的化州柚果皮（化橘紅）及化州柚葉中總黃酮含量比較 結(jié)果見表7。

1.3.6 化橘紅與光橘紅指紋圖譜比較 結(jié)果見圖1、圖2。

表7 不同采收時間的化州柚果皮及化州柚葉的總黃酮含量（x±s） ／%

表7 不同采收時間的化州柚果皮及化州柚葉的總黃酮含量（x±s） ／%

取樣時間／d 果皮 葉20 50.05±6.06 6.64±0.39 27 43.64±3.84 7.67±0.75 34 31.35±6.61 6.10±0.74 41 16.81±2.51 5.95±0.89 48 13.90±1.48 6.30±0.75 55 12.39±2.38 7.29±0.44 62 9.99±2.52 7.70±0.97 69 9.18±3.07 6.96±0.51 76 7.78±1.23 7.53±0.34 83 6.34±0.37 6.96±0.85 90 7.11±1.31 7.48±0.97

1.3.8 不同采收時間的化州柚果皮（化橘紅）及化州柚葉中柚皮苷含量比較 結(jié)果見表8。

表8 不同采收時間的化州柚果皮及化州柚葉的柚皮苷含量（±s）／%

表8 不同采收時間的化州柚果皮及化州柚葉的柚皮苷含量（±s）／%

注：n＝5

采樣時間／d 果皮 葉20 46.01±6.25 1.27±0.17 27 32.15±4.46 1.11±0.14 34 24.56±6.85 1.01±0.21 41 13.01±2.96 1.03±0.13 48 11.54±3.56 1.04±0.16 55 9.23±2.06 1.03±0.14 62 8.05±2.38 1.09±.26 69 7.29±1.88 1.07±0.15 76 7.22±1.49 1.13±0.17 83 4.78±0.85 0.95±0.21 90 5.99±0.99 1.02±0.28

1.3.9 化州柚果皮（化橘紅）及化州柚葉指紋圖譜分析結(jié)果 見圖3～15。注：n＝5

圖3 柚皮苷和野漆樹苷對照品HPLC圖譜

圖4 柚皮苷元對照品HPLC圖譜

圖5 20d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

圖6 27d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

圖7 34d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

圖8 41d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

1.4 小結(jié)

1.4.1 植物形態(tài) 化橘紅原植物化州柚為光橘紅原植物柚的變種，兩者親緣關(guān)系雖近，但樹高、果實（大小及外果皮有無毛）等原植物形態(tài)已有明顯差異，其莖、葉的顯微構(gòu)造差異也十分明顯，易于互相鑒別。

圖9 48d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

圖10 55d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

圖11 62d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

圖12 69d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

圖13 76d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

圖14 83d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

圖15 90d時化州柚果皮HPLC指紋圖譜

1.4.2 化橘紅與光橘紅有效成分含量對比 所測3批化橘紅總黃酮含量均高于光橘紅，其中的主要活性成分柚皮苷也高于光橘紅，兩品種活性成分含量的主要差異為野漆樹苷，化橘紅野漆樹苷含量為0.62%～0.88%，而光橘紅野漆樹苷含量僅為前者的1／10左右，具有顯著性差異；此差異也造成兩者HPLC指紋圖譜的各自特點，兩者均以柚皮苷為第一高峰，但化橘紅以野漆樹苷為次高峰，而光橘紅野漆樹苷僅為第4或5高峰，此差異與兩者圖譜中的其他特征峰一起，構(gòu)成了易于鑒別兩者的特征指紋圖譜。

1.4.3 不同采集時間的化州柚果皮及葉的有效成分含量對比 成果20～41d，化州柚果皮中柚皮苷及總黃酮含量呈急劇下降趨勢，48d后下降速度減緩，至83d時達(dá)到最低值。化州柚葉總黃酮含量在成果27d時達(dá)到峰值，之后含量急劇下降，至41d時達(dá)到最低值，然后急劇增加，62d后變化減緩，維持在7.0%～7.6%的較高水平；成果20～41d，化州柚葉柚皮苷含量變化與化州柚果皮相近，呈顯著下降趨勢，至62～76d期間又呈增加趨勢，之后再顯著下降。

1.4.4 不同采收時間化州柚果皮及葉指紋圖譜對比可見成果20d時化州柚果皮中柚皮苷峰面積最大，之后顯著下降；成果20d時野漆樹苷峰面積值很低，27d時其峰面積顯著增加，至55d期間均維持在較高水平，但62d后野漆樹苷峰面積顯著下降，83d時峰面積降至最低；而20d時柚苷元峰面積值最高，27d時峰面積值顯著下降，之后一直維持下降趨勢，成果69d后其指紋圖譜中已難以確定柚苷元峰。化州柚葉與果皮指紋圖譜存在一定的相似性，其峰面積值最大的兩個成分乃為柚皮苷和野漆樹苷，柚苷元也是主要成分之一；葉中柚皮苷峰面積值基本隨時間降低，野漆樹苷峰面積值直至83d時均無顯著變化，但90d時卻急劇增加，達(dá)到峰值；葉中柚苷元峰值出現(xiàn)在成果35d時。

1.4.5 化橘紅采收時間 化州柚果實為化橘紅（毛橘紅）原藥材，化州市化橘紅原藥材采收主要分兩類，一為幼果，將制成質(zhì)量最優(yōu)的（毛）橘紅胎；二是近成熟果，將制成化橘紅。本研究結(jié)果顯示，成果20d時鮮果重11.74g，此時干果皮總黃酮含量50.05%，柚皮苷含量46.01%；成果27d時鮮果重12.68g，總黃酮含量43.64%，柚皮苷含量32.15%；但34d時鮮果重達(dá)28.68g，為兩周前重量的2.4倍，其干果總黃酮含量31.35%，柚皮苷含量24.56%，藥農(nóng)多此時采收化州柚幼果，作為（毛）橘紅胎入藥，從經(jīng)濟價值和有效成分含量兩方面綜合考慮應(yīng)是可取的?；蓁瞩r果重量增加的峰值出現(xiàn)在成果41d時，其重量達(dá)到110.19g，幾乎為一周前的4倍，此時其干果皮總黃酮含量16.81%，柚皮苷含量13.01%，此時采果作為化橘紅原藥材，其質(zhì)量應(yīng)當(dāng)較優(yōu)。

1.4.6 化州柚葉中有效成分的變化 柚皮苷含量基本與果皮柚皮苷含量呈正相關(guān)，但兩者總黃酮含量卻似乎難以找出相關(guān)性。由于葉為植物的營養(yǎng)器官，除為其他器官（包括果實）提供糖分等營養(yǎng)物質(zhì)之外，黃酮類成分等次生代謝物質(zhì)的形成也必須以糖代謝為前提，作為糖原形成的主要器官，葉中成分的變化應(yīng)會影響果實中相應(yīng)成分的變化，對此還需進行深入研究。

2 化橘紅鮮果采收標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量初步監(jiān)測方法的制訂

根據(jù)上述研究結(jié)果和結(jié)論，制訂出化橘紅鮮果的以下采收標(biāo)準(zhǔn)。

2.1 來源鑒別

藥材來源應(yīng)為蕓香科柑橘屬植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’，采收時應(yīng)查明待采集者外果皮密被白色絨毛，確定為化州柚后才能采收。

2.2 鮮果直徑檢驗

以游標(biāo)卡尺判定擬采收的果實直徑。

2.2.1 幼果 1.5cm≤果實直徑≤3.5cm，外果皮密被絨毛，屬特級品。

2.2.2 未成熟果 （1）6.5cm≤果實直徑≤6.9cm，外果皮密被絨毛，屬一級品。（2）6.9cm≤果實直徑≤8.0cm，外果皮密被絨毛，屬二級品。（3）近成熟果：果實直徑超過8.0cm者，均屬于等外品。

3 化橘紅初加工品檢驗標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量初步監(jiān)測方法的制訂

3.1 產(chǎn)品外觀

成品大小均勻，堅實，香氣濃郁，園柱直徑不得過3cm，高不得過5cm；果皮表面青綠色，絨毛較多，手摸有細(xì)毛氈樣舒適感。

3.2 水分限量

不得過13%。

3.3 黃酮類成分含量

總黃酮含量≥11.5%，柚皮苷含量≥9.0%，野漆樹苷含量≥0.20%。

3.4 初加工產(chǎn)品外觀鑒定

3.4.1 特級品 大小均勻，香氣濃郁，堅實，成品園柱直徑小于2cm，高小于3cm；果皮表面青綠色，密被絨毛，手摸有細(xì)毛氈樣舒適感。

3.4.2 甲級品 大小均勻，堅實，香氣濃郁，成品園柱直徑小于3cm，高小于5cm；果皮表面青綠色，絨毛較多，手摸有細(xì)毛氈樣舒適感。

3.4.3 乙級品 大小均勻，堅實，香氣較濃，成品園柱直徑4cm左右，高大于5cm，果皮表面褐色，絨毛較少，手感較差。

3.5 有效成分含量測定

3.5.1 特級品 總黃酮含量≥25%，柚皮苷含量≥15%，野漆樹苷含量≥0.20%。

3.5.2 甲級品 總黃酮含量≥11.5%，柚皮苷含量≥8.5%，野漆樹苷含量≥0.20%。

3.5.3 乙級品 總黃酮含量≥9%，柚皮苷含量≥7%，野漆樹苷含量≥0.20。

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：69-70.

［2］梁文皓.化州橘紅志［M］.廣州：廣東科技出版社，1993：1-30.

［3］黃美聲，沈玉剛.反相高效液相色譜法測定化橘紅中柚皮苷的含量［J］.中草藥，1990，21（5）：15-17.

［4］Hou-YC，Hsiu-SL，Yen-HF，et al.Effect of honey on naringin absorption from a decoction of the pericarps of Citrus grandis［J］.Planta-Med，2000，66（5）：439-43.

［5］歐明，林勵，李衍文，等.簡明中藥成分手冊［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2003：91-92.

Quality Evaluation，Monitoring and App lication Study of the Medicinal Material Citrus Grandis‘Tomentosa’

Lin Li1，Li Xiangming2，Wan Jianyi2，Chen Zhixia1，Yuan Xujiang1，Huang Lanzhen1
（1.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong510405，China；2.Guangdong Huazhou Green Life Co.，Ltd.，Huazhou Guangdong525100，China）

Objective：To evaluate the quality ofCitrus grandis‘Tomentosa’（CGT）and determine its quality monitoring method.Methods：Compare the original plants and their microstructures using phenetic classification and microscopic identification，total flavones using spectrophotometry，naringin contentand fingerprintusing high efficiency liquid chromatography，and rhoifolin content using thin layer chromatography scanning.Results：There are significant differences in exocarp hair and stem non-glandular hair，etc.between the two CGT original plants；the total flavones and naringin content of CGT are higher than those ofCitrus grandis（L.）Osbeck，the rhoifolin content of CGT is ten times that ofCitrus grandis（L.）Osbeck，and there are significant differences in fingerprint.The peak of weight gain of the fresh fruit of CGT occurs on Day 41 of fruit bearing，when its medicinal quality is better.Conclusion：The quality of the genuine medicinal material CGT is significantly better than that ofCitrus grandis（L.）Osbeck，and the harvesting time of CGT should be preferably around Day 41.

CGT；Variety；Identification；Harvesting time；Fingerprint

*萬建義，E-mail：srm＠greenlifegroup.com.cn