人源血管緊張素轉化酶-C結構域在畢赤酵母中的表達

趙鈺嵐，徐玨，許傳蓮

浙江理工大學生命科學學院蛋白質(zhì)組學與分子酶學研究室，杭州 310018

醫(yī)學與免疫生物技術

人源血管緊張素轉化酶-C結構域在畢赤酵母中的表達

趙鈺嵐，徐玨，許傳蓮

浙江理工大學生命科學學院蛋白質(zhì)組學與分子酶學研究室，杭州 310018

血管緊張素轉化酶 (ACE，EC3.4.15.1) 在調(diào)節(jié)血壓方面具有重要作用，研究證實，ACE-C結構域是體內(nèi)使血管緊張素I (AngI) 分解的主要活性位點。PCR擴增ACE-C結構域基因片段，克隆至分泌表達載體pPIC9K，轉化畢赤酵母GS115，陽性克隆再次電轉，用G418篩選高拷貝的酵母菌落進行表達條件優(yōu)化，獲得0.5 g/L的蛋白表達量及7.178 U/mL的酶活力。經(jīng)Ni+親和層析純化，獲得純度大于97%的目的蛋白。Captopril對酶的抑制試驗證明ACE-C結構域可望成為新一代抗高血壓藥物ACE抑制劑篩選的理想酶靶。

血管緊張素轉化酶，催化結構域，畢赤酵母，卡托普利

Abstract:Angiotensin I-converting enzyme (ACE, EC3.4.15.1) plays an important role in regulating blood pressure. The C-domain of ACE has been identified as the main catalytic site of angiotensin I cleavageinvivo. The ACE gene fragment of the C-domain was amplified by PCR and cloned into the pPIC9K secretory expression plasmid. The recombinant plasmid was transformed intoPichia pastorisstrain GS115. Positive clones were selected and subject to electroporation. Antibiotic G418 was used for the screening of multicopy inserts. After optimization of the expression system, the protein yield reached 0.5 g/L by flask-shaking culture fermentation, and enzyme activity reached 7.178 U/mL in the fermentation supernatant. The purity of the target protein obtained was 97% after Ni+affinity chromatography. Enzyme inhibitory activity assay using Captopril showed that it is promising to use ACE-C domain as new generation of target for screening ACE inhibitor antihypertensive drugs.

Keywords:angiotensin converting enzyme, catalytic domain,Pichia pastoris, Captopril

血管緊張素轉化酶 (Angiotensin-converting enzyme，ACE) 是一種通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，參與血管緊張素II (Ang II)的生成和緩激肽 (BK) 的失活過程，對血壓調(diào)節(jié)，腎臟和心血管功能起關鍵作用的鋅離子依賴蛋白水解酶[1-5]。研究發(fā)現(xiàn)，ACE由兩個同源的活性結構域 (C-結構域和 N-結構域) 組成，C-結構域主要與 AngII 的生成相關，N-結構域主要涉及出血調(diào)節(jié)[6-7]。體內(nèi)實驗表明，N-結構域對血壓的調(diào)節(jié)沒有顯著影響，因此，ACE-C結構域與全長序列ACE生成Ang II的能力幾乎相同[8]。

血管緊張素轉化酶抑制劑 (ACEI) 是臨床主要降壓藥物。目前，ACEI的設計均以全長序列 ACE為靶蛋白，這種相對非選擇性的ACEI在抑制AngⅡ生成的同時也抑制了緩激肽的降解，易產(chǎn)生咳嗽、腎功能不全等副作用[9]。而ACE-C結構域的特異性抑制劑在有效抑制 AngⅡ生成的同時，又不完全抑制緩激肽的降解，穩(wěn)定緩激肽濃度，能夠有效減輕不良反應。最近在收縮前豬冠狀微動脈模型中采用新一代ACE-C結構域特異性抑制劑 (RXPA380) 和ACE-N結構域抑制劑 (RXP407)，該抑制劑是在這兩種區(qū)域之間結構差異的基礎上設計的，更具選擇性，在增強安全性的同時，改善了對不同生理過程的控制[10-13]。靶向ACE-C結構域的ACEI藥物有望成為降血壓藥物的新選擇。

目前，用于 ACEI藥物篩選的酶靶主要是提取自豬腎、兔肺的天然ACE全酶。本研究采用畢赤酵母表達系統(tǒng)，以完整的人源ACE開放閱讀框為模板，克隆了 ACE胞外的 C結構域，實現(xiàn)了具有活性的ACE-C結構域可溶性表達，并通過Captopril對其酶活性的抑制分析，為ACE-C結構域特異性抑制劑篩選提供了新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1基因、菌株與試劑

Pichia pastoris菌株GS115、大腸桿菌DH12S、pPIC9K質(zhì)粒為本實驗室保存。含完整人源血管緊張素轉化酶ORF的質(zhì)粒GC-T7349購于廣州復能基因公司。EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，TaqDNA聚合酶，蛋白分子量標準 (低) 為TaKaRa公司產(chǎn)品。KOD-Plus-DNA Polymerase為日本 TOYOBO公司產(chǎn)品。普通質(zhì)粒小提試劑盒、DNA分子量標準 (MarkerⅢ，D15000) 為上海天根生物工程有限公司產(chǎn)品。膠回收試劑盒購自博大泰克。酵母提取物 (Yeast extract) 購自Oxoid公司。蛋白胨 (Polypepton) 購自日本Nihon Seiyaku公司。YNB購自 Amresco公司。Captopril、Hippuryl-His-Leu acetate salt (HHL) 購自美國 Sigma公司。Hippuric acid馬尿酸標準品為Alfa Aesar公司產(chǎn)品。生物素 Biotin為 BBI公司產(chǎn)品。層析介質(zhì) Ni+Sepharose High Performance購自Amersham公司。DNA測序由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.1.2PCR引物

所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。5′端引物 Primer1：5′-GGGGAATTCTCCCAACAG GTGACAGTCAC-3′ (下劃線為EcoRⅠ酶切位點)；3′端引物 Primer2：5′-GGGCGGCCGCTTAATGATG ATGATGATGATGGGAGTTCGGCGTCCAGTTGT-3′(下劃直線為NotⅠ酶切位點；下劃波浪線為 6個(CAT) 的His標簽；黑體為引入的終止密碼子)。

1.1.3培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：YPD (10%酵母抽提物，20%蛋白胨，20%葡萄糖)；

生長培養(yǎng)基：BMGY (10%酵母抽提物，甘油適量，20%蛋白胨，1 mol/L磷酸鹽緩沖液，13.4%YNB，4×10?5%生物素)；

表達培養(yǎng)基：BMMY (10%酵母抽提物，甲醇適量，20%蛋白胨，1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，13.4%YNB，4×10?5%生物素)。

1.2 方法

1.2.1pPIC9K-ACE-C載體的構建

以質(zhì)粒GC-T7349為模板，上下游引物擴增ACE的C結構域片段，擴增條件為：94℃熱變性2 min；94℃15 s，47℃30s，68 ℃ 2 min ，25個循環(huán)；68℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過回收純化以后，用EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，連接入pPIC9K載體，連接產(chǎn)物轉化 DH12S，提取陽性轉化子的重組質(zhì)粒pPIC9K-ACE-C，做酶切鑒定。

1.2.2重組質(zhì)粒的電擊轉化及高抗性轉化子的篩選

限制性內(nèi)切酶SacⅠ將測序鑒定正確的高濃度重組質(zhì)粒線性化，與電轉化感受態(tài)細胞GS115混合轉入0.2 cm電轉杯，電擊4 s左右，參數(shù)為：電壓1 500 V；電容25 μF；電阻200 ?。電擊后，經(jīng)孵育，涂布于MD平板，30℃培養(yǎng)2 d，至單克隆轉化子出現(xiàn)，挑取菌落進行PCR鑒定。陽性菌落制備成電轉化感受態(tài)細胞，進行2次電轉，刮下MD板上生長的菌落分別涂布于含抗生素G418 3 mg/mL的YPD平板上，30℃培養(yǎng)2～3 d，篩選抗性強的轉化子。

1.2.3重組質(zhì)粒在酵母GS115中的表達與條件優(yōu)化

從含3 mg/mL G418的YPD平板上挑取單克隆接種于 25 mL BMGY培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng) 2 d至OD600= 2～6，離心收集菌體重新懸浮于 200 mL BMMY培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，每隔24 h添加甲醇至終濃度為1%，誘導目的蛋白表達，分別在誘導后0、6、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84、96 h取樣，取上清進行12% SDS-PAGE電泳，并用Bradford法測總蛋白濃度和酶活力。

從含3 mg/mL G418的YPD平板上挑取單克隆接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d至OD600=2～6，離心收集菌體重新懸浮于BMMY (不添加甲醇與磷酸緩沖液) 培養(yǎng)基，2 mL分裝于滅菌試管，一組添加磷酸緩沖液 (pH 6.0) 和不同濃度的甲醇至終濃度分別為0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%、2.25%；一組添加甲醇至終濃度為1%和不同pH值的磷酸緩沖液，pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。30℃誘導 2 d，取上清進行SDS-PAGE電泳，并用Bradford法測總蛋白濃度和酶活力。

重組酵母在 25 mL BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600= 2～6，離心收集菌體，重懸于200 mL BMMY培養(yǎng)基，30℃誘導96 h (甲醇誘導濃度1.75%) 后，上清進行12% SDS-PAGE、Western blotting鑒定蛋白質(zhì)，Bradford法測定蛋白濃度，薄層凝膠掃描分析蛋白質(zhì)純度。

1.2.4表達蛋白的純化

甲醇誘導表達的ACE-C分泌到畢赤酵母胞外，培養(yǎng)基于12 000 r/min離心30 min去除菌體，上清調(diào)pH值至7.4，NaCl濃度至500 mmol/L。取處理后的上清 600 mL以 3 cm/min的線速度加入Ni+-NTA層析柱中，收集流出液，得蛋白峰 1。首先用30 mL 上樣緩沖液洗滌，得蛋白峰2，然后用含20 mmol/L、40 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液分步洗滌 3次，每次 3 mL，分別得到蛋白峰 3、4。用含200 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫5次，收集流出液共15 mL，得蛋白峰5。最后將經(jīng)Ni+-NTA層析柱得到的蛋白液用10 kDa透析袋除鹽12 h，收集后真空干燥。SDS-PAGE檢測純化效果。

1.2.5表達蛋白的活性測定

三肽HHL (馬尿酰-組氨酰-亮氨酸，N-Hippuryl-His-Leu) 在 ACE的催化作用下快速分解產(chǎn)生馬尿酸和二肽His-Leu，可通過HPLC測定馬尿酸的生成量來評價ACE的酶活性。0.5 mL離心管中加入70 μL Tris緩沖液 (100 mmol/L Tris-HCl；300 mmol/L NaCl；10 μmol/L ZnCl2，pH 8.3)，10 μL 培養(yǎng)基上清于 37℃恒溫 5 min，隨后加入 12.5 mmol/L HHL 20 μL，37℃恒溫 30 min后沸水浴 10 min，15 000×g高速離心10 min，轉移80 μL上清于HPLC管用作進樣分析。HPLC檢測條件為：0.1%乙酸溶液-乙腈(95.5∶4.5)，維持0～5 min；在5～35 min流動相比例線性改變至 (85∶15)；35～65 min流動相比例線性改變至 (68∶32)，流速1.0 mL/min；檢測波長330 nm；進樣量20 μL。使用Agilent ZORBAX SB-C18分析柱 (4.6 m×150 mm，5 μm)。馬尿酸做標準曲線計算馬尿酸的生成量。酶活力定義：在上述條件下每分鐘水解HHL生成1 nmol/L馬尿酸所需要的酶量為一個單位 (U)。

1.2.6Captopril對表達產(chǎn)物ACE C-端結構域的抑制作用

精密稱取2.17 mg Captopril，去離子水溶解并定容至10 mL容量瓶，即為1 mmol/L Captopril母液。稀釋母液濃度至 102、10、1、10?1、10?2、10?3μmol/L。取 10 μL Captopril稀釋液與 20 μL Tris緩沖液 (pH 8.3)、50 μL 0.5 μmol/L 酶液混勻，37℃孵育5 min后加20 μL HHL啟動反應。按“1.2.5”方法測定不同濃度的 Captopril對 ACE-C結構域的抑制活性?？瞻讓φ占?0 μL去離子水，計算IC50值，即抑制50% ACE-C結構域酶活性的Captopril濃度。

計算公式：Inhibition (%) = (a?b)/a×100%。

a為空白對照組中馬尿酸的峰面積 (mAU×s)；b為添加Captopril組中馬尿酸的峰面積 (mAU×s)。

2 結果與分析

2.1 pPIC9K-ACE-C載體的構建與鑒定

重組質(zhì)粒抽提，用 Primer1/Primer2引物進行PCR鑒定，得到約2 kb的片段 (圖1)，與目的基因大小 (1 915 bp) 相符，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ進行雙酶切，出現(xiàn)約9 kb和2 kb片段，與載體 (9.3 kb) 和目的基因 (1 915 bp) 條帶大小相符，說明表達載體構建成功。重組質(zhì)粒的測序結果 (測序圖略) 也與NCBI的RNA庫中查得的序列相符，未發(fā)生堿基突變。

2.2 酵母重組子的鑒定和篩選

畢赤酵母GS115為His?菌株，不能合成組氨酸，因此只有含HIS4基因的重組質(zhì)粒整合入GS115后，與宿主進行互補，才能在不含組氨酸的培養(yǎng)基MD板上生長。SacⅠ線性化后的重組質(zhì)粒轉化GS115后，產(chǎn)生 His+Mut+重組子，挑取單克隆用GS115基因組上 5′AOX1引物和 3′AOX1引物進行PCR鑒定 (圖2)，可見兩條帶，一條為目的基因約2.5 kb，另一條為AOX基因約2.2 kb，野生菌GS115擴增出一條帶，為AOX基因，空載體對照擴增出一條大小約500 bp的帶。為增加目的基因在酵母基因組中的拷貝數(shù)，提高表達量，對陽性重組子進行了2次電轉，并用高濃度G418篩選高拷貝數(shù)轉化子，最終獲得能抗G418 3 mg/mL的酵母轉化子。

2.3 ACE-C結構域的誘導表達和鑒定

2.3.1甲醇濃度對蛋白表達量和酶活力變化的影響

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定與雙酶切鑒定Fig.1 PCR amplication of ACE-C gene and restrication analysis of the expression vector pPIC9K-ACE-C. M: DNA marker; 1: pPIC9K-ACE-C/EcoRⅠ+NotⅠ; 2: PCR of ACE-C gene.

本菌種為Mut+型，對甲醇的消耗能力較強。結果如圖3所示，甲醇濃度1.75%時，總蛋白量和酶活力都是最高的。

2.3.2pH條件對蛋白表達量和酶活力變化的影響

pH值降低會影響細胞的膜通透性，進而影響蛋白的分泌。結果如圖4所示，不同pH值對酶活力的影響較大；酸性環(huán)境明顯不利于ACE-C結構域的表達，在pH 5.5時，蛋白表達量和酶活力最高。

圖2 PCR鑒定畢赤酵母整合Fig.2 PCR analysis of recombinant strain. M: DNA marker;1,2: the expression strain of pPIC9K; 3,4: wild strain; 5: the expression strain of pPIC9K-ACE-C.

圖3 不同甲醇濃度誘導下的總蛋白和酶活力變化Fig.3 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation supernatant induced by different concentration of methanol.

圖4 不同pH條件下甲醇誘導的總蛋白和酶活力變化Fig.4 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation supernatant of different pH condition.

2.3.3誘導時間對蛋白表達量和酶活力變化的影響

pH 5.5、1.75%甲醇誘導條件下發(fā)酵96 h，不同時間段的總蛋白和酶活力變化結果如圖5所示。

2.3.4重組蛋白的鑒定

上述結果可見pH 5.5和1.75%甲醇終濃度誘導96 h后能獲得高表達有活力的酶蛋白，表達總蛋白為0.5 g/L，平均酶活力為5.235 U/mL，分子量約為97.2 kDa。12% SDS-PAGE和Western blotting鑒定結果見圖6和圖7。

2.4 表達產(chǎn)物的純化

表達上清液經(jīng)Ni+Sepharose High Performance親和柱一步純化后，用40 mmol/L咪唑濃度的洗脫液洗脫獲得高純度的目的蛋白，結果見圖 8。薄層凝膠掃描分析蛋白質(zhì)純度為97%。

2.5 卡托普利對表達產(chǎn)物 ACE-C結構域的抑制作用

應用 ACE抑制劑卡托普利對表達產(chǎn)物 ACE-C結構域的抑制活性進行考察，其濃度與抑制率關系

圖5 不同時間段的總蛋白和酶活力變化Fig.5 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation supernatant at different stages after induced in culture.

圖6 酵母菌表達重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of the expression. M: protein marker; 1: control of pPIC9K; 2: ACE-C domain.

圖7 ACE-C結構域的Western blotting鑒定Fig.7 Western blotting analysis of the expression. M: protein marker; 1: control of pPIC9K; 2: ACE-C domain.

圖8 ACE-C結構域純化的SDS-PAGE分析Fig.8 Purification of the ACE-C domain. M: protein marker;1: ACE-C domain.

圖9 Captopril對ACE-C結構域的抑制Fig.9 Inhibition of ACE-C domain by captopril.

如圖9所示，卡托普利的濃度范圍在10?8～10?9mol/L之間濃度與抑制率成線性關系。計算 IC50值為7.38×10?9mol/L。

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)藥物在高血壓的治療中表現(xiàn)突出，廣泛用于臨床的兩大類是血管緊張素轉化酶抑制劑和非肽類血管緊張素受體拮抗劑 (沙坦類)，這兩類藥物是近年來發(fā)展較快的降壓藥物。目前國內(nèi)外心血管藥品市場中的血管緊張素轉化酶抑制劑藥物主要有 Enalapril、Benaze-pril、Benazepril、Lisinopril、Quinapril，它們具有卓越的療效和良好的耐受性，遺憾的是存在不良反應，尤其干咳現(xiàn)象較為突出。

因為傳統(tǒng)的 ACEI能夠抑制強效的血管收縮物質(zhì)血管緊張素的生成，同時也能抑制了緩激肽的降解。濃度升高的緩激肽雖然起到了舒張血管的作用，但也會引起干咳等不良反應。在對ACE的兩個結構域的研究中發(fā)現(xiàn)針對ACE-C結構域的抑制劑可以抑制血管緊張素II的生成，但又不能完全抑制緩激肽的降解，有望減輕藥物帶來的副作用。

本實驗中克隆的ACE-C結構域含有豐富的二硫鍵及糖基化位點，在大腸桿菌中表達不能正確折疊，形成無活性的包涵體[14-15]。本研究采用畢赤酵母表達系統(tǒng)后，成功并且高效地表達了ACE-C結構域。表達策略主要包括：在外源蛋白基因的 5′端去掉了天然信號肽；采用pPIC9K載體上的a交配因子信號肽和KEX2酶切位點序列，它們可將外源蛋白分泌至胞外并將a交配因子信號肽切除；采用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切位點；在表達蛋白基因的3′端去掉了原蛋白的膜錨定區(qū)和胞內(nèi)結構域，Tracy等實驗證實，3′端是否去掉ACE-C結構域的膜錨定區(qū)，對增加分泌性 ACE-C結構域的表達量有較大影響[16]；在 3′端增加了 His6-tag序列以便純化；在外顯子選擇方面采用了sACE與tACE共同的基因序列，以便更好地反映ACE整體特征；為提高外源蛋白表達量，用2次電轉來增加高拷貝菌株概率，篩選獲得高拷貝菌株。

對發(fā)酵誘導條件中 pH、甲醇誘導濃度、誘導時間的進行優(yōu)化，使蛋白表達量增加到0.5 g/L，平均酶活力達到5.235 U/mL，最高酶活力達到7.178 U/mL，適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，由于搖瓶發(fā)酵導致的目的蛋白及蛋白酶活力的不穩(wěn)定有望在高密度發(fā)酵水平得到改善。由于外源蛋白融合了His6-tag，經(jīng)一步純化即可達到純度為97%?？ㄍ衅绽鳛橐种苿藴势?，考察了卡托普利對ACE-C結構域的抑制動力學，不同文獻報道的卡托普利對 ACE的抑制活性各不相同，IC50值為 7.5×10?10～2.2×10?8mol/L[17]，這可能與不同的酶來源、不同的測試底物等因素有關。Nicolas等最新報道，在其發(fā)現(xiàn)的一系列次磷酸三肽化合物中，8F2化合物對ACE-C結構域及ACE-N結構域的Ki值分別為 6.5×10?10mol/L和 1500×10?10mol/L，顯示出良好的ACE-C結構域選擇性，同時，對內(nèi)皮素轉化酶抑制劑也具有抑制作用[18]。8F2對ACE-C結構域的IC50為7.31 nmol/L，半抑制濃度與卡托普利相接近；如能同時測定8F2與卡托普利對本研究所表達的ACE-C結構域半抑制濃度，將更有意義。同時，由于次磷酸三肽分子量較卡托普利大，結構較卡托普利復雜，作為臨床用藥，卡托普利無疑更具有優(yōu)勢。

綜上所述，ACE-C結構域在畢赤酵母中的成功表達為ACE-C結構域抑制劑的高通量篩選提供了特異性的酶靶。

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Expression of human angiotensin converting enzyme-C domain inPichia pastoris

Yulan Zhao, Jue Xu, and Chuanlian Xu

Laboratory of Proteomics & Molecular Enzymology,College of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou310018,China

Received:December 14, 2009;Accepted:March 22, 2010

Supported by:Key Project of Zhejiang Education Department (No. Z200804057), Project of Scientific and Technological Innovation Promotion for Student of Zhejiang Province (No. 14080131380912).

Corresponding author:Chuanlian Xu. Tel: +86-571-86843566; Fax: +86-571-86843745; E-mail: chuanlianxu@163.com

浙江省教育廳重點項目 (No. Z200804057)，浙江省大學生科技創(chuàng)新推廣項目 (No. 14080131380912) 資助。