石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌抑制作用及防病效果

喬樹華, 蔣紅云, 張燕寧, 何偉志

(植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100193)

番茄灰霉病(Botrytiscinerea Pers.)是設(shè)施栽培番茄上的一種重要病害,從20世紀(jì)80年代以來,隨著我國保護(hù)地蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大,該病害成為番茄生產(chǎn)的限制性障礙[1]。番茄灰霉病菌菌絲在5～30℃均可生長,孢子在8～32℃均可萌發(fā)[2],所以適宜生長的機(jī)會(huì)大,危害也大,尤其在我國北方蔬菜區(qū)是一種危害性很大的病害。塑料大棚、溫室、小拱棚等保護(hù)設(shè)施栽培的番茄常發(fā)生灰霉病的流行,嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)30%以上。我國南方蔬菜區(qū)過去較少發(fā)生此病,但近年來由于保護(hù)設(shè)施栽培的發(fā)展,番茄灰霉病也開始發(fā)生并有逐年加重趨勢。目前主要依靠化學(xué)防治。但由于化學(xué)藥劑的連續(xù)使用,使病原菌產(chǎn)生了抗藥性,防效逐年降低,也造成了一定的農(nóng)藥污染。隨著人們環(huán)保意識(shí)的提高,對無公害蔬菜的需求越來越大。因此,近年來,開發(fā)低毒、低殘留的植物源農(nóng)藥成為無公害農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)之一。

本研究對石榴皮的萃取物抑制番茄灰霉病菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)進(jìn)行了測試。同時(shí)報(bào)道了石榴皮萃取物對番茄灰霉病的溫室盆栽防治試驗(yàn)結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

石榴皮(Punica granatum),購于北京同仁堂藥店。

番茄灰霉病菌(Botry tis cinerea),由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)業(yè)有害生物基本調(diào)查創(chuàng)新研究組提供。

供試番茄品種為粉紅番茄合作908(上海番茄研究所)。

70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(西安常隆正華作物保護(hù)有限公司)。

乳化劑0204,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)藥研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

采用超聲波提取法。將石榴皮放入50℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干至發(fā)脆,用植物粉碎機(jī)(河南滎陽市三張機(jī)械廠生產(chǎn))將其粉碎,過 40目篩。稱取500 g,用溶劑浸提3次,過濾,合并3次提取液。將其分幾次轉(zhuǎn)入500 m L或1 000 m L圓底磨口燒瓶中,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā),溫度70℃,壓強(qiáng)0.080～0.095M pa,蒸發(fā)至沒有回流液,油膏狀為止。

采用液液分配萃取的方法得到萃取物。

稱取50 g的石榴皮甲醇提取物,用4倍量的蒸餾水溶解,然后用極性不同的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇溶劑對所得浸膏進(jìn)行連續(xù)等量的萃取,減壓濃縮得石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物浸膏,分別稱重后放入4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 室內(nèi)試驗(yàn)

1.3.1 石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用

參照陳年春[3]的生長速率測定法進(jìn)行。

將各萃取物配成 200、100、50、25、12.5 g/L 5個(gè)濃度梯度。每個(gè)處理重復(fù)3次,以平皿中加入蒸餾水作為空白對照。于(26±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待對照皿中菌落長至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)調(diào)查菌落直徑(菌落直徑平均值-4)。計(jì)算菌絲生長抑制率,求出毒力回歸方程、EC50和95%置信限。

1.3.2 石榴皮萃取物對灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

參照陳年春[3]孢子萌發(fā)試驗(yàn)法進(jìn)行。

在25℃下培養(yǎng)3 d的供試菌種中加入滅菌水5 m L,用接種針輕輕摩擦培養(yǎng)基表面,使孢子懸浮于水中,用紗布過濾去掉培養(yǎng)基塊及菌絲體;或者在孢子懸浮于水中后,靜置片刻,取上清液,鏡檢每視野中含孢子80～100個(gè)作為菌原材料。將各萃取液和孢子懸浮液等量混合,將混合液用移液管滴入凹玻片的凹槽內(nèi),置于培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿中鋪吸水紙并加無菌水濕潤,以便保濕),在25～27℃恒溫下培養(yǎng)使孢子萌發(fā),3～4 h后檢查孢子萌發(fā)率。每一處理重復(fù)3次,并以不加藥劑的孢子懸浮液為對照。

1.4 盆栽試驗(yàn)

1.4.1 石榴皮萃取物對番茄灰霉病的保護(hù)效果

將石榴皮萃取物先加入5%乳化劑0204增加其乳化性,再用蒸餾水稀釋100、300倍,于番茄植株葉面噴施,24 h后,用3%的蔗糖溶液制備孢子懸浮液(約1×105個(gè)/m L)接種,接種后保濕。每處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)3盆番茄植株。以噴灑蒸餾水作為空白對照,以70%甲基硫菌靈可濕性粉劑300倍作為化學(xué)藥劑對照。15～21 d后觀察記錄葉片發(fā)病級(jí)數(shù),并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

1.4.2 石榴皮萃取物對番茄灰霉病的治療作用

在盆栽番茄上分別接種番茄灰霉病病菌,保濕24 h,然后噴施石榴皮萃取物稀釋100、300倍液。每處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)3盆番茄植株,以噴灑蒸餾水作為空白對照,以70%甲基硫菌靈可濕性粉劑300倍處理作為化學(xué)藥劑對照[5]。15～21 d后觀察記錄葉片發(fā)病級(jí)數(shù),并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[4]。

0級(jí):無病斑;

1級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下;

3級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%;

5級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%;

7級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%;

9級(jí):病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。

病情指數(shù)=(∑各級(jí)病葉數(shù)×相對級(jí)數(shù)值)×100/調(diào)查總?cè)~數(shù)×9;

防治效果=(CK-PT)/CK×100%;

式中:CK—空白對照施藥后病情指數(shù);

PT—藥劑處理施藥后病情指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果用M icroso ft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,經(jīng)DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用

以生長速率法測定了石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用。結(jié)果(表1)表明,正丁醇萃取物對菌絲生長的抑制活性最強(qiáng),其EC50為50.28 g/L;石油醚萃取物次之,EC50為66.16 g/L。

4種萃取物的毒力測定結(jié)果顯示,抑制活性大小依次為正丁醇萃取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和氯仿萃取物。表明極性較大的正丁醇萃取物對黃瓜枯萎病菌菌絲生長有顯著的抑制作用。

2.2 石榴皮萃取物對灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用見圖1。石榴皮萃取物各處理均表現(xiàn)出對孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。正丁醇萃取物抑制活性最高,各個(gè)不同處理表現(xiàn)出顯著差異。結(jié)果表明石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌的孢子萌發(fā)具有顯著抑制作用。這種抑制作用與濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

2.3 石榴皮萃取物對番茄灰霉病的保護(hù)作用及治療作用

在溫室盆栽番茄上測定了石榴皮正丁醇萃取物對番茄灰霉病的保護(hù)和治療作用,結(jié)果見表2。正丁醇萃取物對番茄灰霉病具有顯著的防治效果,其100倍液對番茄灰霉病的保護(hù)效果達(dá)到46.41%,治療作用效果達(dá)到48.00%,均與對照化學(xué)藥劑甲基硫菌靈300倍處理達(dá)到同一顯著水平。

表1 石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用

圖1 石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

表2 石榴皮正丁醇萃取物對番茄灰霉病的溫室防治效果

3 結(jié)論與討論

采用生長速率法測定石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌菌絲的抑制作用,結(jié)果表明,正丁醇萃取物抑菌活性最強(qiáng),培養(yǎng)過程中,前期抑菌效果好于后期,可能是活性成分隨時(shí)間延長有所降解。

孢子萌發(fā)法測定結(jié)果表明,石榴皮萃取物對孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制活性。

在溫室試驗(yàn)中,正丁醇萃取物對番茄灰霉病也表現(xiàn)出顯著的防治效果,其100倍液對番茄灰霉病的保護(hù)效果為46.41%,治療效果達(dá)到48.00%。

在本試驗(yàn)中,試驗(yàn)材料為植物萃取液粗提物,濃度較高,可能是由于純度不夠,導(dǎo)致用藥量過大?？紤]到溫室栽培條件下番茄結(jié)果比較困難,因而在溫室試驗(yàn)中,選用番茄葉片作為試驗(yàn)靶標(biāo)。而石榴皮萃取物對番茄果實(shí)灰霉病的防治效果如何,需進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)驗(yàn)證。

[1] 李寶聚,朱國仁,關(guān)天舒,等.節(jié)能日光溫室中番茄灰霉病發(fā)生規(guī)律的研究[J].植物保護(hù),2003,29(2):26-29.

[2] 馬輝剛,李瑞明,胡水秀,等.番茄灰霉病菌生物學(xué)特性研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,20(2):801-803.

[3] 陳年春.農(nóng)藥生物測定技術(shù)[M].北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1990:135-165.

[4] 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所生測室.農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則(一)[M].中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,1993:47-48.

[5] 王樹桐,曹克強(qiáng),胡同樂,等.中藥細(xì)辛提取物對番茄灰霉病菌的抑菌作用及防病效果研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(1):5-8.