響應(yīng)面法優(yōu)化牡蠣酶解工藝

趙 鴻 霞， 朱 蓓 薇， 周 大 勇， 劉 兆 芳， 秦 磊， 蔣 笑

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

牡蠣是一種世界性的貝類，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多不飽和脂肪酸，以及豐富的糖原和充足的維生素等營養(yǎng)成分，具有巨大的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[1-3]。目前市場上牡蠣大部分以開殼牡蠣肉鮮銷為主。牡蠣在捕撈后由于微生物的增殖以及所產(chǎn)生的毒素的積累，會使其品質(zhì)逐漸下降[4]，這給新鮮牡蠣的貯藏和運(yùn)輸帶來很大的困難，深加工成為當(dāng)前形式下最迫切的需要。

現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究表明，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)消化道中的酶作用后，大多是以寡肽的形式被吸收，而以游離氨基酸形式被吸收的比例很小。同時(shí)，肽在微量的狀態(tài)下，就能發(fā)揮強(qiáng)大的生理活性，如抑制細(xì)菌和病毒、抗癌作用、抗氧化等。因此，開發(fā)有益于人類健康的功能性肽具有廣闊的市場前景[5-6]。本實(shí)驗(yàn)以新鮮牡蠣為原料，首先激活牡蠣自身的酶系，將其自身組織的蛋白降解，而后采用外源酶對牡蠣進(jìn)一步酶解，最終生產(chǎn)牡蠣肽。

1 材料與儀器

1.1 原料與試劑

新鮮牡蠣，市售；堿性蛋白酶(Alc)，四川華威高科技生物有限公司；中性蛋白酶(Neu)，南寧龐博生物工程有限公司；木瓜蛋白酶(Pap)，上海生物工程有限公司；其他試劑與藥品均為分析純。

1.2 主要儀器

HH-4 系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；JJ200Y型精密電子天平，美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司；DF-101S集中式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；8050超濾攪拌器。

2 方 法

2.1 原料預(yù)處理

牡蠣經(jīng)去殼、清洗、打漿后，以水解度為評價(jià)指標(biāo)對比不同紫外照射時(shí)間、pH、溫度、金屬離子、反應(yīng)時(shí)間下的自溶效果。自溶后的牡蠣經(jīng)冷凍干燥，粉碎過100目的篩，貯于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 原料的酶解

本實(shí)驗(yàn)選用木瓜蛋白酶(Pap)、中性蛋白酶(Neu)、和堿性蛋白酶(Alc)3種蛋白酶以水解度和肽得率為評價(jià)指標(biāo)，按表1的條件對原料進(jìn)行水解。酶解工藝如下：

精密稱取原料→加水→調(diào)pH值→加酶→保溫水解→滅酶(100 ℃，10 min)→定容→離心(4 000 r/min,10 min)→上清液→測水解度。

表1 3種酶的試驗(yàn)條件Tab.1 The experimental conditions of three enzymes

2.3 水解度的測定

水解度的測定采用甲醛滴定法[7-9]。水解度(Degree of hydrolysis,DH) 是指蛋白質(zhì)分子中由于生物或化學(xué)水解而斷裂的肽鍵占蛋白質(zhì)分子中總肽鍵的比例。

2.4 單因素試驗(yàn)

以中性蛋白酶為水解酶，以水解度為評價(jià)指標(biāo)，研究酶加量、酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度和底物濃度等對酶解的影響?；緱l件為酶加量2 500 U/g；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%；pH 7；反應(yīng)溫度50 ℃；水解時(shí)間3 h，改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以分別考察不同的影響因素。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同條件下牡蠣自溶效果的比較

紫外照射能抑制牡蠣的自溶，時(shí)間越長抑制作用越明顯；溫度能激活牡蠣的自溶，隨著溫度的升高自溶作用明顯加強(qiáng)，但超過一定溫度后高溫使酶失活，自溶效果又下降；pH值對自溶的影響也較大，酸性能加強(qiáng)自溶，堿性能抑制自溶；自溶時(shí)間越長自溶效果越好；最后比較了金屬離子對自溶的影響，F(xiàn)e2+、Fe3+、Mn2+對牡蠣自溶有明顯的激活作用，Cu2+有明顯的抑制作用，Ca2+、Mg2+、Ba2+對自溶的影響不明顯。綜合考慮成本及對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，最終確定自溶條件為pH值5，溫度50 ℃，時(shí)間3 h，在此條件下牡蠣的水解度增加了4.5%，比原來提高了34%。

3.2 不同蛋白酶酶解效果的比較

按表1條件對牡蠣進(jìn)行水解，各蛋白酶水解效果見表2。從水解效果上分析，中性蛋白酶和堿性蛋白酶的水解度和肽得率都比較高；但從工業(yè)化角度考慮，堿性蛋白酶水解所需要的pH較高，設(shè)備條件要求較苛刻，而中性蛋白酶的水解條件要溫和得多，因此選擇水解條件溫和的中性蛋白酶作為最佳用酶，從表2也可以看到水解產(chǎn)物的水解度高，肽得率也相應(yīng)較高，因此可以以水解度為評價(jià)指標(biāo)，利用單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)對水解工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表2 酶解產(chǎn)物的水解度和肽得率Tab.2 DH and yield of peptide of the hydrolysates

3.3 酶解工藝的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

3.3.1 反應(yīng)溫度對酶解效果的影響

如圖1 所示，溫度對水解度的影響很大，溫度在30～70 ℃時(shí)，水解度變化在23.83%～35.02%，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，牡蠣的酶解效果最佳，因此50 ℃為牡蠣酶解反應(yīng)的單因素最佳溫度。

圖1 溫度對水解度的影響Fig.1 Effect of temperature on degree of hydrolytic

3.3.2 酶加量對酶解效果的影響

如圖2所示，當(dāng)酶加量在500～4 500 U/g變化時(shí)，水解度變化范圍為29.05%～35.26%；當(dāng)酶加量超過2 500 U/g時(shí)，水解反應(yīng)趨于平緩?？紤]到經(jīng)濟(jì)效益，確定2 500 U/g為此酶解反應(yīng)的最佳酶加量。

圖2 酶加量對水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolytic

3.3.3 pH值對牡蠣酶解效果的影響

由圖3可以看出，pH值對水解度的影響比較大，pH在4～9時(shí)，水解度變化在20.13%～35.54%;pH 7～9時(shí)牡蠣的水解度達(dá)到最佳?？紤]到經(jīng)濟(jì)效益和操作的安全方便性，選擇pH 7為單因素最適pH。

圖3 pH對水解度的影響Fig.3 Effect of pH on degree of hydrolytic

3.3.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對牡蠣酶解效果的影響

從圖4可以看出，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升，水解效果增強(qiáng)，超過8%之后又迅速下降。因此底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)為最佳選擇。

圖4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on degree of hydrolytic

3.3.5 反應(yīng)時(shí)間對牡蠣酶解效果的影響

從圖5可以看出，隨著酶解時(shí)間的增加，酶解效果逐漸增強(qiáng)。當(dāng)酶解時(shí)間超過4 h后，酶解效果趨于平緩。為節(jié)約成本，選擇4 h為單因素最佳酶解時(shí)間。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對水解度的影響Fig.5 Effect of time on degree of hydrolytic

3.4 響應(yīng)面法對酶解工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，并根據(jù)提高效率、節(jié)約成本的原則，將加酶量定為2 500 U/g，酶解時(shí)間定為4.0 h；利用Design-Expert軟件根據(jù)Central Composite原理[10]設(shè)計(jì)了溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值的三因素五水平共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)(其中1～14為析因試驗(yàn)，15～20為中心點(diǎn)試驗(yàn)用來估算誤差)。以此確定中性蛋白酶酶解牡蠣肽的最佳工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表3。

3.4.1 響應(yīng)面結(jié)果分析

根據(jù)表3試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4?；貧w方程中各變量對指標(biāo)(響應(yīng)值)影響的顯著性由F檢驗(yàn)來判定，概率(P)越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由響應(yīng)面結(jié)果的方差分析可知，模型P值為0.000 3意味著此二次模型是極顯著的，即模型建立成功；且溫度項(xiàng)A、pH值項(xiàng)B、平方項(xiàng)A2、B2、C2對水解度的影響都是顯著的；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)項(xiàng)C、交互項(xiàng)不顯著。

表3 Central Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Experimental design and results of Central Composite

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析Tab.4 Analysis of variance of quadratic model in RSM

用Design-Expert 7.0 軟件分析模型的可信度，見表5，得出回歸方程的各因變量和全體自變量之間的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=49.11/53.79=0.912 9，說明可以用此模型對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和預(yù)測。當(dāng)信噪比大于4時(shí)模型可信，試驗(yàn)測得信噪比為8.876大于4，也說明模型可靠。

表5 模型的可信度分析Tab.5 The credibility analysis of the model

根據(jù)Design-Expert 7.0 軟件得出回歸模型各因素相互作用的效應(yīng)圖，見圖6～8。圖6顯示反應(yīng)溫度與pH值交互作用對水解度的影響，固定了底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，形成了pH值與反應(yīng)溫度的等高線及響應(yīng)面圖。從圖6可以看出，因素A、B對Y是非線性的，因?yàn)楸砻鎴D發(fā)生彎曲，可以做進(jìn)一步優(yōu)化分析。從等高線圖中可以看出pH值方向比溫度方向的等高線變化相對密集，說明pH對響應(yīng)值峰值的影響大于溫度。同理從圖7、8也可以看到表面圖發(fā)生彎曲，得出因素A、C， B、C對Y也存在二次項(xiàng)，做進(jìn)一步優(yōu)化分析得出溫度、pH對響應(yīng)值峰值的影響大于底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖6 溫度與pH值關(guān)于水解度的響應(yīng)面圖Fig.6 RS contour plots showing effect of temperature and pH on DH

圖7 溫度與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)于水解度的響應(yīng)面圖Fig.7 RS contour plots showing effect of temperature and substrate concentration ratio on DH

圖8 pH值與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)于水解度的響應(yīng)面圖Fig.8 RS contour plots showing effect of pH and substrate concentration ratio on DH

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行回歸擬合分析得到的牡蠣水解度(Y)的回歸方程:

Y=-261.10+3.46A+62.20B-1.12C+

0.09AB+0.083AC+0.52BC-

0.049A2-5.00B2-0.42C2

3.4.2 響應(yīng)因子水平優(yōu)化

顯著因素水平的優(yōu)化運(yùn)用Design Expert 7.0軟件，對回歸模型進(jìn)行規(guī)范形分析，尋求最大值的穩(wěn)定點(diǎn)及對應(yīng)的因素水平。結(jié)合圖6～8給出的回歸方程的三維響應(yīng)面圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)即最大值。根據(jù)三元二次回歸方程求最大值，分別對回歸方程各因素求一階偏導(dǎo)且令方程等于零，整理得：

解方程組得到模型的極值點(diǎn)為：A=48.96，B=7.08，C=7.92。

把極值點(diǎn)代入回歸方程，解得方程的最大值為39.29%，即最佳理論工藝條件：溫度48.96 ℃、pH值7.08、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.92%、加酶量2 500 U/g、反應(yīng)時(shí)間4 h。在此條件下，理論水解度為39.29%。但考慮到實(shí)際操作的便利，將酶解的最佳提取工藝條件修正為溫度49 ℃、pH值7.1、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.9%、加酶量2 500 U/g、反應(yīng)時(shí)間4 h。在此條件下，實(shí)際測得水解度為39.53%，與實(shí)驗(yàn)預(yù)測值相差0.24%，說明試驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，建立的回歸方程能真實(shí)地反映pH值、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對牡蠣水解度的影響，并達(dá)到試驗(yàn)過程中的最高得率，說明此響應(yīng)面模型具有可行性。通過此模型優(yōu)化能夠有效提高牡蠣的水解度，對牡蠣肽精深加工及功能性產(chǎn)品開發(fā)利用具有重要的實(shí)際意義。

4 結(jié) 論

以水解度為評價(jià)指標(biāo)確定了牡蠣的最佳自溶條件:pH 5，溫度50 ℃，時(shí)間3 h。以水解度和肽得率為評價(jià)指標(biāo)，選擇中性蛋白酶為外源工具酶。通過二次回歸旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)優(yōu)化了中性蛋白酶的最佳工藝條件并修正為：溫度49 ℃、pH 7.1、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.9%、加酶量2 500 U/g、反應(yīng)時(shí)間4 h。通過上述最佳工藝條件制備的牡蠣肽的理論水解度為39.29%，實(shí)際水解度為39.53%。

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