Arthrobacter sp.3胞外酶轉(zhuǎn)化人參二醇類(lèi)皂苷生成Rg3的反應(yīng)條件

李 學(xué) 龍, 富 瑤 瑤, 孫 斯 宜, 付 紹 平, 魚(yú) 紅 閃, 金 風(fēng) 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參皂苷Rg3是具有高抗癌活性的一種稀有皂苷，具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移等藥理作用[1]。但是它在植物人參中的含量?jī)H為十萬(wàn)分之三，目前大多采用化學(xué)方法來(lái)制備。邵巍等[2]對(duì)Arthrobactersp.GS 0202菌株所產(chǎn)的人參皂苷-β-葡萄糖苷酶水解人參皂苷Rb1生成Rg3進(jìn)行了研究；王亮等[3]研究了Arthrobactersp.3，phodopseudomonassp.18細(xì)菌所產(chǎn)胞外酶將人參二醇類(lèi)皂苷轉(zhuǎn)化為人參皂苷C-K的特種人參皂苷糖苷酶，發(fā)現(xiàn)不同溫度發(fā)酵所產(chǎn)酶的種類(lèi)不同；吳迪等[4]對(duì)Phycicoccussp.BXN 5-13細(xì)菌所產(chǎn)胞酶將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化生成Rg3進(jìn)行了研究，證實(shí)該酶是胞內(nèi)酶。

本實(shí)驗(yàn)主要研究新篩選出的Arthrobacter屬中一種sp. 3細(xì)菌所產(chǎn)胞外酶，將人參二醇類(lèi)皂苷轉(zhuǎn)化生成Rg3的反應(yīng)條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種和人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品

細(xì)菌Arthrobactersp.3，韓國(guó)KAIST提供；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rg3、Rb1、Rc、Rd，由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要儀器

薄層層析板Silica Gel-60-F254，德國(guó)Merck；高效液相色譜分析儀，Waters 2695-2996；色譜柱，Thermo Hypersil ODS2(200 mm×4.5 mm,5 μm)。

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制

分別稱(chēng)取胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，溶于1 000 mL去離子水中，高壓蒸汽滅菌20 min待用。

1.2.2 細(xì)菌的發(fā)酵

用接種針?lè)謩e于液體發(fā)酵培養(yǎng)液中接菌2～3環(huán)，30 ℃振蕩培養(yǎng)2 d，30 mL培養(yǎng)基內(nèi)接菌液0.3 mL，置于35 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.2.3 粗酶的提取方法

將發(fā)酵液4 ℃下1 000 r/min離心8 min，棄沉淀，上清液中加入90 mL丙酮，4 ℃靜置2 h。4 ℃ 1 000 r/min離心8 min，離心后棄上清液，白色沉淀即所要粗酶。加入2 mL HAc-NaAc緩沖液，振蕩溶解，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.4 酶反應(yīng)條件的優(yōu)化

取粗酶液100 μL，分別與人參二醇類(lèi)皂苷在不同條件下反應(yīng)。

1.2.5 薄層層析法檢驗(yàn)酶反應(yīng)產(chǎn)物成分

每次點(diǎn)樣1 μL，將點(diǎn)好樣的薄層板放入層析缸的展開(kāi)劑中。所用展開(kāi)劑氯仿-甲醇-水溶液，體積比為7∶3∶0.5。

1.2.6 高效液相色譜法檢驗(yàn)酶反應(yīng)產(chǎn)物

進(jìn)樣量為10 μL；體積流量 1.0 mL/min；柱溫，35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，203 nm。流動(dòng)相A為乙腈，B為水，比例如表1所示。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 The developing procedure of HPLC flowing form

2 結(jié)果與討論

2.1 誘導(dǎo)物的確定

在30 mL發(fā)酵液中加入0.1 mg/mL的人參二醇類(lèi)皂苷和蘆丁各0.5 mL，振蕩培養(yǎng)3 d，按“1.2.3”的方法提酶。取酶液和人參二醇類(lèi)皂苷底物各0.1 mL，40 ℃反應(yīng)24 h，加入0.2 mL水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)。振蕩、離心1 min，取上層液作TLC檢測(cè)。根據(jù)圖1結(jié)果，選擇人參二醇類(lèi)皂苷作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)酶來(lái)研究產(chǎn)Rg3的最優(yōu)反應(yīng)條件。

2.2 酶反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.2 酶反應(yīng)底物質(zhì)量濃度的優(yōu)化

分別選擇0.1、0.05、0.02、0.001 mg/mL人參二醇類(lèi)皂苷0.1 mL與0.1 mL酶液，在40 ℃條件下反應(yīng)24 h,加入0.2 mL 水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)。振蕩、離心1 min，取上層液作TLC檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以確定，0.1 mg/mL為酶反應(yīng)最佳底物質(zhì)量濃度。

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2均為人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品； 1、2為蘆丁和人參二醇類(lèi)皂苷誘導(dǎo)物圖1 加入不同誘導(dǎo)物的酶反應(yīng)TLC檢測(cè)Fig.1 Effect of inducer on enzyme activit

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2分別為人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品； 1～4分別為0.1、0.05、0.02、0.001 mg/mL人參二醇類(lèi)皂苷作底物的反應(yīng)產(chǎn)物

2.1.3 酶反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

0.1 mL酶液在40 ℃條件下與0.1 mL的0.1 mg/mL底物分別反應(yīng)22、24、26、28 h，反應(yīng)終止時(shí)加入0.2 mL 水飽和正丁醇。振蕩、離心1 min，取上層液作TLC檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。由圖3確定，24 h為最佳酶反應(yīng)時(shí)間。

2.1.4 酶反應(yīng)溫度的優(yōu)化

0.1 mL酶液和0.1 mg/mL人參二醇類(lèi)皂苷底物分別于20、30、40、50 ℃反應(yīng)24 h，終止酶反應(yīng)時(shí)加入0.2 mL 水飽和正丁醇。振蕩、離心1 min，取上層液作TLC檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示。由圖4可以確定，40 ℃為最佳酶反應(yīng)溫度。

2.1.5 優(yōu)化反應(yīng)條件后的產(chǎn)物鑒定

根據(jù)上述優(yōu)化反應(yīng)條件，即以人參二醇類(lèi)皂苷為底物，質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，40 ℃反應(yīng)24 h后加入0.2 mL 水飽和正丁醇終止反應(yīng)。振蕩、離心1 min，取上層液作TLC檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以確定上述條件即為酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Rg3的最優(yōu)條件。

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2分別為人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品；1～4分別為反應(yīng)22、24、26、28 h的產(chǎn)物圖3 不同反應(yīng)時(shí)間的TLC檢測(cè)圖Fig.3 Effect of reaction time on enzyme activity

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2為人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品； 1～4分別為20、30、40、50 ℃下的反應(yīng)產(chǎn)物圖4 不同溫度下的酶反應(yīng)TLC檢測(cè)Fig.4 Effect of reaction temperature on enzyme activity

Rb1、Rc、Rd、PPD、Rg3、F2為人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品； s1為條件優(yōu)化后的反應(yīng)產(chǎn)物圖5 酶反應(yīng)條件優(yōu)化后產(chǎn)物的TLC檢測(cè)Fig.5 Hydrolysis of ginsenoside PPD type under the optimal condition

2.2 HPLC檢測(cè)酶解產(chǎn)物的成分

將“2.1.5”反應(yīng)后溶液用水飽和1 mL正丁醇萃取、蒸干，溶于1 mL甲醇(色譜純)，搖勻，用直徑0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得上樣液。HPLC圖譜如圖6所示。通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，Rg3的生成率較高，為21%。

圖6 酶反應(yīng)后的HPLC譜圖Fig.6 Enzymatic reaction product on HPLC

3 結(jié) 論

為得到把人參二醇類(lèi)皂苷轉(zhuǎn)化為Rg3的特種人參皂苷糖苷酶，對(duì)細(xì)菌Arthrobactersp.3進(jìn)行了發(fā)酵誘導(dǎo)物篩選和酶反應(yīng)條件的研究。結(jié)果顯示，采用0.1 mg/mL人參二醇類(lèi)皂苷作為誘導(dǎo)物時(shí)細(xì)菌產(chǎn)酶的酶活較高；反應(yīng)體系中底物為0.1 mg/mL，溫度40 ℃、反應(yīng)24 h時(shí)Rg3的生成率最高，在最適條件下對(duì)酶反應(yīng)后人參皂苷進(jìn)行HPLC檢測(cè)，底物的轉(zhuǎn)化率約為21%。

[1] 金鳳燮. 天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2009：79-81

[2] 邵巍,金風(fēng)燮,魚(yú)紅閃. GS0202菌產(chǎn)人參皂苷-β-葡萄糖苷酶條件及其酶的反應(yīng)條件[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 27(1):30-33.

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