閃式柱層析技術(shù)的研究進(jìn)展*

陳勝發(fā),胡莉娟,馬文龍

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.楊凌示范區(qū)醫(yī)院,陜西楊凌 712100)

閃式柱層析(Flash Chromatography,簡稱閃柱)是國外于20世紀(jì)80年代興起的一種快速層析技術(shù),它的最大特點就是分離相當(dāng)迅速。完成一個重量為0.01～10 g的混合物樣品的分離,從裝柱、上樣到洗脫分離,整個過程只需要15～60 min。國外的化學(xué)實驗室已經(jīng)普遍采用這個分離技術(shù)了,國內(nèi)部分實驗室也有此套裝置?，F(xiàn)就閃柱的性質(zhì)特點和應(yīng)用綜述如下。

1 裝置

閃柱首先由Still等于1978年詳細(xì)介紹,其目的在于縮短常壓柱色譜的操作時間,該技術(shù)于1981年獲專利保護(hù)(美國專利4,293,422)[1]。色譜分離時,進(jìn)行長時間的洗脫有兩個缺點:敏感化合物可能被分解和色帶容易拖尾。這兩個問題在天然產(chǎn)物分離中經(jīng)常會遇到,而閃柱的出現(xiàn)很好的解決了這個問題。最初一個典型的閃柱色譜分離裝置包括一裝有活塞、長度適合的玻璃柱,可用干法或濕法將固定相加入其中。干法裝柱效果更好,但需用大量溶劑使固定相完全潤濕。在固定相的頂部最好加一層沙子,固定相的上端應(yīng)留有足夠的空間以便反復(fù)加人洗脫劑,也可在柱頂裝一滴液漏斗作為儲液槽。加樣后,使柱與氣體人口相聯(lián),該處裝一針式閥門以控制壓縮氣體的流速?？墒┘痈哂诖髿鈮? bar的壓力使樣品洗脫。利用不同尺寸的色譜柱對0.01～10.0 g樣品所進(jìn)行的分離通常可在15 min內(nèi)完成。

現(xiàn)在人們已開發(fā)的閃柱色譜系統(tǒng)的商品有以下幾種。

(1)Biotage徑向柱壓縮系統(tǒng) (Charlottesville VA USA):每次可分離1～250 g樣品,最大流速可達(dá)250 mL/min(壓力可達(dá)7 bar),該系統(tǒng)有 FLASH 12型、FLASH 25 型、FLASH 40型、FLASH 75型和FLASH 150型五種型號。其中的數(shù)字代表柱子的直徑,例如 FLASH 75型,表示柱子的直徑為75 mm(可裝200～800 g,KP-SIL 60A硅膠)。

(2)BAKER公司出售的系列色譜柱。

(3)ALDRICH公司出售的系列色譜柱。

(4)TOKYO RIKAKIKAI公司出售的EYELA快速色譜裝置。

2 閃柱在天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用

閃柱已經(jīng)被廣大科研工作者所熱愛,并在天然產(chǎn)物分離中得到廣泛應(yīng)用。下面為閃柱在天然產(chǎn)物分離中應(yīng)用的一些實例。

2.1 皂 苷

許多檸檬苦素苷類用常規(guī)的方法不容易分開,而且檸檬苦素類遇酸容易分解。所以Raman等[2]采取反相C18硅膠閃柱系統(tǒng),甲醇-水梯度洗脫,分離出一系列結(jié)構(gòu)類似的檸檬苦素苷類:nomilin 17-D-glucopyranoside and nomilinic acid 17-D-glucopyranoside。

2.2 生物堿

Hou等[3]配合使用硅膠和反相C18硅膠閃柱系統(tǒng),只用兩步就得到了純度很高的oxymatrine(氧化苦參堿)。

2.3 黃 酮

在枳實類藥材中,黃酮苷類成分(Naringin,Hesperidin)是其中的主要成分。雖然兩者大量存在,但是由于兩者結(jié)構(gòu)相近而且極性都比較大,用常規(guī)的方法不容易分開。所以Raman等[4]采取反相C18硅膠閃柱系統(tǒng),甲醇-水梯度洗脫,分離這兩個黃酮苷類成分。這是一種快速高效的方法,并不昂貴,而且其純度都很高。

2.4 苯丙素類

2006年xiao等[5]利用正相硅膠閃柱系統(tǒng)和制備型HPLC從Green Onion(Alliumspp)的脂溶性部分分離出Ⅱ相代謝酶的誘導(dǎo)劑(p-Hydroxyphenethyl trans-Ferulate)。

2.5 萜類

1989年Alam等[6]使用采取正相硅膠閃柱系統(tǒng)從Ascochyta rabzei菌的培養(yǎng)液中分離得到2種毒素,證實了這種菌就是導(dǎo)致植物發(fā)生枯萎病的元兇。向柱中填入60A的硅膠(230-400 mesh),以正己烷-乙酸乙酯系統(tǒng)(3∶1-1∶1其中含有0.1%乙酸)進(jìn)行梯度洗脫。收集了30個流份,得到2種毒素:solanapyrones A和solanapyrones C。

1999年Millar等[7]采用精餾,化學(xué)法和閃式柱層析的方法,簡單快速分離出1種倍半萜zingiberene,純度超過99%。向FLASH柱中填入40～63 μm Silica gel(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI),采用正己烷-丙酮 (15∶85)系統(tǒng)等度洗脫得到倍半萜和PTAD的加成產(chǎn)物。最后經(jīng)過 LiAlH 4還原,得到高純度的zingiberene。

2000年Takeoka等[8]利用正相硅膠閃柱系統(tǒng)從苦杏仁的外種皮中分離出3個三萜類化合物,白樺酸(betulinic acid),齊墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)。采用CH2N2進(jìn)行甲基化,產(chǎn)物進(jìn)行正相硅膠閃柱層析,填充Merck grade 9385(230～400 mesh),采用戊烷-乙醚系統(tǒng)梯度洗脫,分成6個流分,再用制備型HPLC純化得到三萜化合物。

2001年Jiang等[9]利用反相硅膠閃柱系統(tǒng)從日本胡椒的嫩葉中發(fā)現(xiàn)了新的單萜苷類化合物(3S,6S)-cis-linalool-3,7-oxideβ-D-glucopyranoside 和 2-methylpropanyl 6-O-β-D-apiofuranosylβ-D-glucopyranoside。

2001年Sabine等[10]利用反相硅膠閃柱系統(tǒng)成功地從從亞洲蓍(Achillea asiatica)中分離出了大極性的愈創(chuàng)木內(nèi)酯類化合物。采用正相閃柱系統(tǒng)[ICN Silica TSC,60A(53 cm×20 cm)],二氯甲烷-丙酮梯度系統(tǒng)洗脫,流速為 20 ml/min,得到一系列大極性的愈創(chuàng)木內(nèi)酯類化合物。例如:8-desacetyl-matricarin.

2004年Shibata等[11]利用正相硅膠閃柱系統(tǒng)快捷地分離出高純度的胡蘿卜醇(Lutein)。濕法上樣,采用正相 FLASH(30 mm i.d.×260 mm)柱,壓力為1～2 kg/cm2進(jìn)行洗脫,先用正己烷洗脫,得到胡蘿卜素的混合物,再用正己烷-丙酮-氯仿洗脫得到胡蘿卜醇(Lutein)。

2.6 海洋天然產(chǎn)物

1987年Blunt等[12]總結(jié)了一套行之有效的方法,利用反相C18硅膠閃柱系統(tǒng)對海綿等(含大極性的化合物)海洋天然產(chǎn)物進(jìn)行初步的分段處理。粗樣溶解于CH2Cl2-MeOH-H2O(250 ml),使用5 g反相材料進(jìn)行拌樣,裝入柱頂,以水平衡柱子。以表1的方式進(jìn)行洗脫,同時測定每個流份的細(xì)胞毒活性。

表1 不同洗脫液對應(yīng)的流份的質(zhì)量及其細(xì)胞毒活性

1996年 Edwards等[13]利用 BiotageFlash 75 s閃柱系統(tǒng)從藍(lán)綠藻原柱生物中分離得到微囊藻素(microcystins)。他們在9 cm×7.5 cm的色譜柱中裝Hperprep C18(30μm,120 A)或不規(guī)則狀的μ-Bordapak C18(37-55μm,125 A)固定相,將提取的水液過濾后以100 ml/min加入,然后以10%梯度增加的甲醇-水系統(tǒng) (0%～100%)進(jìn)行洗脫,最后用制備型HPLC純化得到微囊藻素(microcystins)。

1999年Law tona等[14]反復(fù)利用Biotage閃柱系統(tǒng)對疏水性的微囊藻素進(jìn)行了制備性純化。首先他們利用Flash 12(其中預(yù)裝好flash KP-Sil silica)來摸條件,選好條件后,在放大使用Flash 40進(jìn)行制備,采用梯度洗脫,得到微囊藻素純度達(dá)到90%。最后采用反相硅膠閃柱系統(tǒng)進(jìn)行純化,利用反相Flash40(其中預(yù)裝好flash KP-C18 silica),先用水進(jìn)行洗脫,除去其中混有的醋酸,再用甲醇洗脫下微囊藻素,其純度達(dá)到95%。

1999年Kevin等[15]使用采取正相硅膠閃柱系統(tǒng)結(jié)合制備液相技術(shù),快速高效地從海洋浮游植物中分離到一種罕見的毒素:dinophysistoxin-2(DTX-2)。

2001年Van Wagoner等[16]利用反相C18硅膠閃柱系統(tǒng)和氰基柱制備液相分離得到一個新的蝶啶類化合物:1,3,O7-trimethylisoxanthopterin。采用反相C18硅膠閃柱系統(tǒng),甲醇-水梯度洗脫,樣品采用濕法上樣,在其中加入 0.1%TFA助溶,再利用氰基柱制備液相純化得到 1,3,O7-trimethylisoxanthopterin。

2.7 其他天然產(chǎn)物

2004年Taylor等[17]采用閃柱系統(tǒng),離子交換柱從豌豆提取物中分離到肽類的混合物。商品化的野豌豆粉末去酯后,其甲醇提取物用正相硅膠柱以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫得各部分,其中Fr8顯示有殺蟲活性。Fr8(150 mg)用內(nèi)部預(yù)置有8 g硅膠的FLASH12裝置(Biotage Inc.),以氯仿:甲醇:水 (65∶35∶10)等梯度洗脫,流速為2 ml/min,得到7個亞流分,再用離子交換柱,最后富集得到肽類混合物。

3 展望

閃式柱層析作為先進(jìn)的層析手段,目前在多種化合物的分離中顯示出了很好的分離效果,尤其是閃柱在天然產(chǎn)物分離中逐漸被廣泛應(yīng)用,對于萜類物質(zhì)的分離純化有很好的推廣前景。閃式柱層析技術(shù)逐漸開始與其他色譜技術(shù)相結(jié)合,并在實踐中不斷改進(jìn),目前國內(nèi)外正在開發(fā)的高通量制備色譜系統(tǒng)和多維色譜系統(tǒng),這些技術(shù)無疑將會使閃式柱層析技術(shù)得到豐富和發(fā)展,使其在天然產(chǎn)物的分離純化的研究工作中發(fā)揮重大作用,尤其是我國科研人員可以使用此項技術(shù)推動我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展,相信會在傳統(tǒng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化中發(fā)揮更大的作用。

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