鏈球菌制劑預(yù)防性治療實驗動物糖尿病機理研究

王德彬,彭 焱,覃 瑞,陳 玉

（1.中南民族大學藥學院,武漢430074;2.武漢生物制品研究所血液制劑室,武漢 430060;3.中南民族大學生命科學學院,武漢430074;4.中南民族大學化學與材料科學學院,武漢替換為 430074）

鏈球菌制劑預(yù)防性治療實驗動物糖尿病機理研究

王德彬1,彭 焱2,覃 瑞3,陳 玉4＊

（1.中南民族大學藥學院,武漢430074;2.武漢生物制品研究所血液制劑室,武漢 430060;3.中南民族大學生命科學學院,武漢430074;4.中南民族大學化學與材料科學學院,武漢替換為 430074）

為了探討鏈球菌制劑預(yù)防性治療糖尿病的機理,以純系的自發(fā)性糖尿病NOD小鼠和鏈脲霉素誘導糖尿病鼠為動物模型,從5周～20周皮下注射鏈球菌制劑0.1 mg/只,對照組注射等量生理鹽水,觀察其發(fā)病率.至40周時鏈球菌制劑組均未發(fā)病,而生理鹽水組發(fā)病率為70%.取胰腺組織作病理切片,Fas、FasL染色及胰島β細胞染色.未發(fā)病鼠無Fas表達,但有FasL的表達;已發(fā)病鼠有Fas的表達;經(jīng)鏈球菌制劑免疫后小鼠有 FasL表達.相同的結(jié)果也出現(xiàn)在以鏈脲霉素（STZ）誘導的遲發(fā)型糖尿病模型鼠中.鏈球菌制劑可能通過改變Fas L/Fas系統(tǒng)在胰腺組織的表達,來預(yù)防性治療糖尿病,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用.

A群溶血性鏈球菌制劑;糖尿病;NOD小鼠;鏈脲霉素

糖尿病是一種急性或慢性的代謝障礙性疾病,主要是由于胰島素的絕對或相對缺乏所引起.已有大量事實證明,無論是1型糖尿病還是2型糖尿病,其發(fā)病均與胰腺內(nèi)分泌細胞功能異常有關(guān),尤其是與β細胞的功能不足有很大關(guān)系.糖尿病已成為人類第5位死亡主因,并且還可能引發(fā)多種并發(fā)癥[1].因此,眾多的中外學者對其發(fā)病機理和治療方法進行了積極的研究.糖尿病的發(fā)病機制十分復(fù)雜,隨著免疫學研究的逐步深入,證實凋亡在免疫系統(tǒng)的平衡中是一個關(guān)鍵因素,凋亡機制的破壞可能是自身免疫失調(diào)的原因.鏈球菌制劑作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,已廣泛應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療,使用安全,來源豐富.它與國外的A群溶血性鏈球菌OK-432[2]屬同類制劑,能直接殺傷腫瘤細胞及改善機體免疫功能,本實驗以糖尿病動物為模型,研究鏈球菌制劑在體內(nèi)預(yù)防性治療糖尿病的機制,為開發(fā)鏈球菌制劑新的適應(yīng)癥提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù).

1 實驗方法

1.1 實驗動物的分組

選用30只5周齡雌性NOD小鼠（購自上海斯萊克實驗動物中心）.隨機分為兩組,一組20只,為實驗組,皮下注射鏈球菌制劑 0.1 mg/只/周,共15周;另一組10只,為對照組,每周皮下注射等量生理鹽水.所有小鼠喂食普通飼料并自由飲水.另取20只8周齡雌性NOD小鼠（購自上海斯萊克實驗動物中心）,以300 mg/kg CP（環(huán)磷酰胺）一次性腹腔注射,隨機分為兩組,每組10只,一組皮下注射鏈球菌制劑0.1 mg/只,連續(xù)注射7 d,另一組皮下注射等量生理鹽水7 d.

1.2 采血方法、血樣處理及血糖測定

采用上海生物制品研究所提供的葡萄糖氧化酶法試劑盒測血糖.小鼠10周齡以后每周監(jiān)測血糖,統(tǒng)計小鼠發(fā)病率.

1.3 自發(fā)性糖尿病 NOD鼠胰島β細胞 FAS及

FAS-L免疫組化染色

NOD小鼠開腹,分離胰腺,取胰尾入10%甲醛固定6 h,常規(guī)梯度酒精脫水,透明,浸蠟,包埋,常規(guī)切片脫蠟至水.Insulin Ab-6（INS04+INS05）:晶美公司,對胰島細胞進行免疫組化染色;采用武漢博士德生物工程有限公司提供的免疫組化染色試劑盒對胰島β細胞進行 FAS、FAS-L免疫組化染色.

1.4 鏈球菌制劑對鏈脲霉素誘導小鼠遲發(fā)型糖尿病的治療作用

正常昆明種小鼠（武漢生物制品研究所實驗動物中心提供,20～22 g）以10 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲霉素,每周1次,連續(xù)5周誘導 PBS鼠,血糖檢測結(jié)果表明小鼠血糖在第2周開始升高,在注射5周后發(fā)生遲發(fā)型糖尿病.實驗組1為模型鼠,成模后立即以鏈球菌制劑連續(xù)治療7 d;實驗組2為模型鼠,成模7 d后以鏈球菌制劑連續(xù)治療7 d;實驗組3為模型鼠,成模14 d后以鏈球菌制劑連續(xù)治療7 d;實驗組4為模型鼠,成模21 d后以鏈球菌制劑連續(xù)治療7 d,觀察鏈球菌制劑的治療效果.

1.5 鏈脲霉素誘導糖尿病模型鼠胰島β細胞FAS及FAS-L免疫組化染色

方法同1.3.

2 實驗結(jié)果

2.1 NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率

本實驗中用鏈球菌制劑處理的20只雌性NOD鼠直到實驗結(jié)束（40周）沒有發(fā)病鼠（見表1）,對照組（10只）于第14周開始出現(xiàn)糖尿病鼠,至實驗結(jié)束時發(fā)病率達到了70%（7/10）.而注射環(huán)磷酰胺的20只NOD鼠,10只經(jīng)鏈球菌制劑免疫的均未發(fā)病,對照組10只發(fā)病率達到了80%（8/10）.說明鏈球菌制劑完全可以預(yù)防NOD鼠糖尿病的自然發(fā)生和環(huán)磷酰胺促發(fā)的糖尿病的發(fā)生.

表1 鏈球菌制劑對NOD小鼠發(fā)病率的影響Tab.1 Effects of kanserin on incidence of diabetes in female NOD mice

2.2 自發(fā)性糖尿病 NOD鼠胰腺組織胰島β細胞染色及免疫組化染色

取未發(fā)病鼠、已發(fā)病鼠及經(jīng)鏈球菌制劑免疫后小鼠的胰腺組織作病理切片,每張病理切片均作Fas和Fas-L的單個染色.

圖1 未發(fā)病NOD鼠的胰島β細胞Fig.1 The pancreatic isletβcell of non-diabetic NOD mouse（400×）

圖2 已發(fā)病NOD鼠的胰島β細胞Fig.2 The pancreatic isletβcell of diabetic NOD mouse（400×）

圖3 鏈球菌制劑處理過的NOD鼠胰島β細胞Fig.3 The pancreatic isletβcell of hemolytic streptococci-treated NOD mouse（400×）

2.2.1 胰島β細胞染色 鏈球菌制劑對受損的胰島β細胞具修復(fù)作用,對保持胰島β細胞的細胞結(jié)構(gòu)完整、維持正常的生理功能有著重要的作用,在一定意義上阻止了糖尿病的發(fā)生.

2.2.2 胰島β細胞Fas及FasL染色 未發(fā)病鼠:胰島β細胞無Fas表達,但表達FasL.

已發(fā)病鼠:胰島β細胞有 Fas的表達,周圍有表達FasL的細胞浸潤.

鏈球菌制劑免疫后小鼠:胰島β細胞有 FasL的表達,不表達 Fas.

提示Fas的異常表達與糖尿病的發(fā)生有關(guān),Fas-FasL途徑是糖尿病發(fā)病過程中β細胞凋亡的方式之一,也說明了鏈球菌制劑對胰島β細胞的保護作用.

2.3 鏈球菌制劑對鏈脲霉素誘導遲發(fā)型糖尿病鼠

的治療作用

多次注射小劑量STZ后誘導胰島β細胞發(fā)生輕度改變,自身被激活的 T淋巴細胞將胰島β細胞當作靶細胞進行攻擊,從而導致自身免疫過程的發(fā)生,誘導遲發(fā)型糖尿病,該過程類似于人的1型糖尿病.應(yīng)用鏈球菌制劑對成模小鼠進行治療,發(fā)現(xiàn)間隔7 d、14 d注射的兩組各有1只血糖恢復(fù)正常,而成模后馬上注射及間隔21 d注射的,沒有治療效果.

圖4 未發(fā)病NOD鼠胰島細胞表達Fas-LFig.4 Expressed Fas-L on islet of non-diabetic NOD mouse（400×）

圖5 已發(fā)病NOD鼠胰島細胞表達FasFig.5 Expressed Fas on islet of diabetic NOD mouse（400×）

2.4 取鏈脲霉素誘導遲發(fā)型糖尿病鼠胰島β細胞免疫組化染色

取正常組、模型組、鏈球菌制劑治療組小鼠胰腺組織Fas及FasL免疫組化染色.

正常組:胰島β細胞無 Fas表達,但表達FasL.

模型組:胰島β細胞有 Fas的表達,周圍有表達FasL的細胞浸潤.

鏈球菌制劑治療組:胰島β細胞有FasL的表達,不表達 Fas.

說明鏈球菌制劑對STZ誘導的遲發(fā)型糖尿病鼠胰島β細胞損傷有一定的修復(fù)作用.研究結(jié)果提示,Fas-FasL途徑可能也是STZ誘發(fā)的遲發(fā)型糖尿病鼠胰島β細胞凋亡的方式之一.

圖6 鏈球菌制劑處理的NOD鼠胰島細胞表達Fas-LFig.6 Expressed Fas-L on islet of hemolytic streptococci-treated NOD mouse（400×）

圖7 未發(fā)病鼠胰島細胞表達Fas-LFig.7 Expressed Fas-L on islet of non-diabetic mouse（400×）

圖8 以鏈脲霉素誘導的遲發(fā)型糖尿病鼠胰島細胞表達FasFig.8 Expressed Fas on islet of delayed diabetic mice with STZ（400×）

圖9 經(jīng)鏈球菌制劑治療的遲發(fā)型糖尿病鼠胰島細胞表達Fas-LFig.9 Expressed Fas-L on islet of delayed diabetic mice with STZ by hemolytic streptococci-treated（400×）

3 討 論

3.1 鏈球菌制劑對 NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率的影響

NOD鼠是1型糖尿病的動物模型[3],楊竹林[4]等從10周齡開始觀察NOD鼠是否有糖尿?。―M）癥狀出現(xiàn),當出現(xiàn)多飲、多尿、消瘦等癥狀時,斷尾取血測定血糖值,若連續(xù)2次>11.1 mmol/L,則確定為糖尿病.環(huán)磷酰胺（CP）可選擇性地去除某些抑制性 T細胞的功能而加速NOD鼠發(fā)病.本實驗表明鏈球菌制劑可以阻止糖尿病的發(fā)生,且早期注射鏈球菌制劑的未發(fā)病NOD鼠血清胰島素水平遠高于發(fā)病鼠,而胰島素由胰腺β細胞分泌,提示鏈球菌制劑對早期受損的胰島β細胞具有保護和修復(fù)作用.

3.2 NOD鼠胰腺組織胰島β細胞染色及免疫組化染色

隨著細胞組織免疫化學染色技術(shù)的飛速發(fā)展,在糖尿病機制的研究中有關(guān)β細胞形態(tài)學的探討越來越受到人們的重視[5].本實驗中胰島β細胞染色結(jié)果顯示,發(fā)病組切片與正常組切片比較,兩者在形態(tài)學上有很大差異,發(fā)病組胰島數(shù)目少,β細胞松散排列,分布不規(guī)則.鏈球菌制劑免疫組胰島β細胞的形態(tài)與未發(fā)病組無大的差別,說明鏈球菌制劑對NOD鼠β細胞的形態(tài)有明顯的改善作用.

作為在中樞和周圍淋巴器官選擇淋巴細胞庫的方式,凋亡機制的破壞可能是自身免疫失調(diào)的發(fā)病原因.Fas（CD95）屬于腫瘤壞死因子受體家族,FasL和Fas結(jié)合后,通過活化下游的凋亡通路可誘導表達Fas細胞的凋亡.本實驗采用 Fas/FasL免疫組化方法對胰腺組織進行染色發(fā)現(xiàn),未發(fā)病鼠胰島β細胞在正常情況下表達 FasL,但不表達Fas;發(fā)病鼠許多細胞因子和炎癥介質(zhì)可促進胰島β細胞大量表達Fas,其附近有表達FasL的細胞浸潤,說明1型糖尿病β細胞凋亡與 Fas/FasL通路的活化密切相關(guān),1型糖尿病β細胞凋亡主要是Fas的異常表達所致,而胰島內(nèi)細胞因子的異常也增強了Fas和FasL之間的相互作用.

3.3 鏈球菌制劑對鏈脲霉素誘導遲發(fā)型糖尿病鼠的治療作用

自Rakieten[6]等文獻6中為1963年首次報告鏈脲霉素（streptozotocin STZ）有致糖尿病的作用以來,國內(nèi)外有學者利用不同劑量的STZ來復(fù)制糖尿病模型.STZ為一種廣譜抗菌素,具有抗菌、抗腫瘤的性能,但它同時具有致糖尿病的副作用[7],對實驗動物胰島β細胞具有高度選擇性的毒性作用,是目前使用最廣泛的糖尿病動物模型化學誘導劑.Junod等[8]通過光鏡觀察表明,STZ能直接破壞胰島的β細胞,導致胰島功能受損,血糖升高.STZ誘導小鼠糖尿病高血糖狀態(tài)持續(xù)3周以上確定為DM小鼠模型[9].注射小劑量STZ,誘導胰島細胞發(fā)生輕度改變,炎性細胞浸潤并釋放細胞因子,放大細胞損傷效應(yīng),最終導致遲發(fā)型糖尿病[10-11].本實驗以鏈球菌制劑治療遲發(fā)型糖尿病鼠,剛成模的小鼠因為其胰島浸潤細胞主要為炎性細胞,注射鏈球菌制劑后,激活機體的淋巴細胞,增強細胞免疫功能,進一步擴大炎癥反應(yīng),因而仍然保持高血糖水平.間隔一段時間后,鏈球菌制劑通過上調(diào) TH2型細胞因子,從而下調(diào) TH1型細胞因子,對輕度受損的胰島β細胞進行修復(fù),從而起到降低血糖的作用.通過免疫組化染色觀察模型鼠與正常鼠及鏈球菌制劑治療鼠的胰島改變及Fas的表達,證明鏈球菌制劑對STZ造成的糖尿病鼠胰島β細胞損傷有一定的修復(fù)作用,對保持胰島β細胞的細胞結(jié)構(gòu)完整、維持正常的生理功能有著重要的作用,在一定意義上防止了糖尿病的發(fā)生.提示促進受損胰島β細胞的修復(fù),保護胰島β細胞是鏈球菌制劑治療糖尿病的機理之一.

需要指出的是,NOD鼠與遲發(fā)型糖尿病鼠雖然都是1型糖尿病動物模型,但NOD鼠從患胰島炎到發(fā)生糖尿病,時間間隔幾個月,當糖尿病確診時,胰島受損已很嚴重,且體重大為減輕,此時用鏈球菌制劑治療,可能太晚,這也是鏈球菌制劑對速發(fā)型糖尿病鼠沒有治療效果的原因.

4 結(jié)論

鏈球菌制劑能阻止NOD鼠糖尿病的自然發(fā)生及環(huán)磷酰胺促發(fā)的NOD鼠糖尿病的發(fā)生,Fas-FasL途徑是糖尿病發(fā)病過程中β細胞凋亡的方式之一.鏈球菌制劑對正常胰島β細胞具有保護作用,促進輕度受損胰島β細胞的修復(fù)可能是鏈球菌制劑治療糖尿病的機理之一.鏈球菌制劑對糖尿病的預(yù)防性治療作用可作為該藥新的適應(yīng)癥可能應(yīng)用于臨床.

[1]Mc Carty D,Zimmet,P.globval estimates and projections[J].Diabetes,2006,32:1-46.

[2]Fujimoto T,Duda RB,Szilvasi A,et al.Streptococcal preparation OK-432 is a potent inducer of IL-12 and a T helper cell dominant state[J].J Immunol,1997,158:5619.

[3]Rackietan N,Rackietan ML,Nadkarni MR.Studies on diabetogenic action of streptozotozin[J].Cancer Chemotherapy Reports,2003,29:91-95.

[4]楊竹林,伍漢文,周智廣,等.完全弗氏佐劑預(yù)防NOD鼠胰島炎和糖尿病的機理研究[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,1999,15（5）:271.

[5]Makino S,Kunimoto K,Muraoka Y,et al.Breeding of a non-obese diabetic stain of mouse[J].Experimental Animals,2000,29:1.

[6]Rakieten.Studies on diabetogenic action of streptozotocin（NSC-37917）Cancer Chemotherapy Reports,1963,29:91.

[7]劉學政,蕭 鴻.鏈脲佐菌素致糖尿病鼠模型的研究[J].錦州醫(yī)學院學報,2001,22（4）:11-14.

[8]Juunod A,Lamber AE,Orei L,et al.Studys of the diabetcgenic action of streptozotocin[J].PTOC Soc Exp BiolmED,2001,125:201-203.

[9]Rabinovitch A.Immunoregulatory and cytokine imbalance in the pathogenesis of IDDM[J].Diabetes,2004,43（2）:613-621.

[10]Trembleau S,Gemann T,Gately M,et al.The role of IL-12 in the induce of organ-specific autoimmune disease[J].Immunology Today,2005,16:383-387.

[11]Rabiinovitch A.Immunoregulatary and cytokine imbalances in the pathogenesis of IDDM[J].Diabetes,2004,43:613-619.

Abstract:To study the effectiveness of Group A hemolytic streptococci on diabetes mellitus in mice model and its possible mechanism.female NOD mice of Group A hemolytic streptococci-treated group were injected with 0.1 mg Group A hemolytic streptococci weekly from 5 weeks to 20 weeks and control group with 0.1ml NS（normal saline）to investigate the incidence.The mice were sacrificed at 40 wk or when diabetes occurred.The pancreatic tissues were routinely processed and underwent Fas and FasL staining with ABC immunohistochemical method,isletβcell stained through insulin Antibody.The incidence of diabetes in the Group A hemolytic streptococci group was zero which obviously less than 70%in the control group..Fas only expressed on islets of the mice suffering from diabetes,whereas Fas ligand expressed on islets of the mice injected with Group A hemolytic streptococci and NS.Similar results in rapid and delayed diabetic experimented models in Kun-ming mice with streptozotoein（STZ）.Group A hemolytic streptococci possessed the therapeutic and preventive effects on diabetic mice,The immune mechanism of Group A hemolytic streptococci treatment is closely related to the expression of Fas ligand/Fas system on the pancreatic tissues.Group A hemolytic streptococci appears to have a immune-regulatory effect on diabetes mice.

Key words:group A hemolytic streptococci;diabete;NOD mice;streptozotoein

Therapeutic and protective mechanism of Group A hemolytic streptococci on diabetes

WANG Debin1,PENG Yan2,Qin Rui3,CHEN Yu4
（1.College of Pharmacy,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074;2.Bolld Preparatious Lab,Wuhan Institute of Biologic Products,Wuhan 430060;3.College of Life Science,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074;4.College of Chemistry and Materials,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074）

R965.1

A

1000-1190（2010）04-0648-05

2010-05-30.

湖北省自然科學基金項目（2006ABA367）.

＊通訊聯(lián)系人.E-mail:chenyuwh888@126.com.